技术领域
本发明涉及一种可调控的肝损伤动物模型的制作方法及其专用载体。
背景技术
丙型肝炎病毒(HCV)是引起慢性肝炎的主要病原之一，严重危害人类健康。据统计，在世界范围内约有1.7亿慢性感染者。由于缺乏良好的小动物模型，使HCV发病机制的研究还局限于HCV感染自然史的观察和黑猩猩的实验感染，而黑猩猩是受保护动物，在伦理和经济上都受到许多限制，因此人源化小鼠是替代灵长类动物用于HCV感染和药物筛选的理想模型。
近年来，Mercer(Mercer，D.F.et al.Hepatitis C virus replication in micewith chimeric human livers.Nat.Med.7，927-933.2001)、Tateno(Tateno，C.et al.Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolicresponses to drugs.Am.J.Pathol.165，901-912.2004)和Turrini(TurriniP et al.Development of humanized mice for the study of hepatitis C virusinfection.Transplant Proc.2006 May；38(4)：1181-4)等人先后以Alb-uPA小鼠作为移植受体来制备人源化小鼠肝脏，并实现了HCV感染，然而Alb-uPA小鼠uPA基因的表达会造成新生小鼠出血死亡，因此，存在着纯合子死亡率极高以致繁殖后代极为困难的致命缺陷。另外，小鼠肝细胞具有极强的再生能力，Alb-uPA小鼠在出生后1-2个月内，再生的肝细胞替代转基因的肝细胞从而失去适合细胞移植的环境，因此，应用Alb-uPA小鼠作为受体时，移植时间仅限于出生后14天之内，移植手术难度高且移植后成活率低。
最近几年，发展了一些可诱导性表达的表达系统，包括可诱导的真核生物表达系统和原核生物表达系统，但这些系统也存在很大的局限性，表现为：1)以重金属离子、激素及热休克蛋白为诱导剂的真核表达系统，其诱导刺激可引起多元效应，引发许多基因表达，难以区分特异或非特异性事件；在没有诱导剂存在时，还常出现表达泄露现象；2)可诱导性原核表达系统，如基于lac阻遏因子基础上的IPTG诱导表达系统，其作用虽然特异，但其要求的诱导剂剂量接近细胞毒水平，而且诱导过程缓慢、诱导效率低，也难以广泛推广。
近年来发展的一种高效无毒、具有严密开/关功能的基因表达系统，称为Tet-off/Tet-on基因表达系统。Tet-off系统在没有四环素(tetracycline，Tet)或其衍生物强力霉素(doxycycline，Dox)存在的情况下，引起插入启动子下游目的基因的高效表达，随着四环素浓度的增加，基因表达以一种剂量依赖性的方式逐渐关闭直至为零。Tet-on基因表达系统受四环素的作用刚好与Tet-off系统相反，即在没有四环素的情况下表达水平为零，在加入四环素或强力霉素后目的基因高效表达。Tet-off/Tet-on基因表达系统被认为是目前最为理想的真核生物基因表达系统，与目前所用的其他真核基因表达系统比较，该系统具有严密性、特异性、高效性等优点，自推出以来，在许多方面得到了广泛的应用。
Tet-off/Tet-on基因表达系统工作原理如下：
大肠杆菌E.coli株转座子Tnl0中Tet阻遏因子(Tet repressor，Tet R)负性调节四环素抗性操纵子(tetracycline-resistauce operon)，Tet R与四环素有很高的亲和性。在没有四环素存在时，Tet R与Tet操纵因子序列(Tet O)结合而阻断四环素抗性基因的表达；当有四环素时，Tet R对Tet O的阻遏解除，转录启动。
基于这个原理，Gossen等将Tet R1-207个氨基酸与单纯疱疹病毒VP16的C-端130个氨基酸所组成的转录活化区域(transcriptional activator domain，VP16 AD)融合，将Tet R这个阻遏因子改建成四环素转录激活子(tetracycline transcriptionalactivator，tTA)；而7个拷贝42bp大小的Tet O加上其上游最小单位CMV启动子构成了四环素反应因子(tetracycline response element，TRE)，被研究基因位于其下游。这样，与前述Tet O-Tet R工作原理相反，当缺乏四环素时，tTA蛋白与Tet O结合，激活TRE下游基因的转录；而加入四环素时，四环素与Tet R的高亲和性，使tTA蛋白发生构型变化，不能结合Tet O，从而TRE下游基因的转录活化被阻断。
在Tet-off的基础上，Bujard通过改变Tet上4个氨基酸，在5’端接上一个核定位信号，其它结构不变，构建成“反义″Tet阻遏因子，形成反义四环素激活子(rtTA)。所谓反义四环素激活子，即在有四环素或其衍生物强力霉素(doxycycline)存在时，rtTA蛋白可与TRE结合而促使Tet O调节的基因表达，而撤走四环素或强力霉素时，基因不被转录。这个系统被称之为Tet-on系统。对于那些基因需被抑制表达以及不必要或不便于长时间表达(如基因治疗和转基因动物)的情况，Tet-on系统使研究变得十分便利。
发明内容
本发明提供了一种可调控的肝损伤动物模型的制作方法及其专用载体。
本发明所提供的重组表达载体P，是在真核表达载体的多克隆位点插入DNA片段K得到的重组载体；所述DNA片段K由Tet-off/Tet-on基因表达系统的四环素反应因子(TRE)、启动子和尿激酶原激活剂编码基因按上游至下游的顺序依次连接而成；
所述启动子是如下1)或2)或3)的DNA分子：
1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；
3)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的DNA分子。
所述四环素反应因子为如下A)或B)或C)的DNA分子：
A)其核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；
B)在严格条件下与A)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；
C)与序列表中序列2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的DNA分子。
所述尿激酶原激活剂为如下a)或b)的蛋白质：
a)其氨基酸序列是GenBank Accession Number NP_032899的自氨基末端第1至433位氨基酸残基；
b)将a)限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有尿激酶原激活剂功能的由a)限定的氨基酸序列衍生的蛋白质。
所述尿激酶原激活剂的编码基因为如下I)或II)或III)的DNA分子：
I)其核苷酸序列是GenBank Accession Number NM_008873的自5′末端第59位至1360位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子；
II)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码所述尿激酶原激活剂的DNA分子；
III)与I)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码具有尿激酶原激活剂功能的蛋白质的DNA分子。
所述重组表达载体P具体可为pTRE-uPA。
上述pTRE-uPA是将PBI载体Mlu I和Nhe I位点间的小片段取代为尿激酶原激活剂的编码基因得到的。
本发明还提供了另一种重组表达载体Q，是在真核表达载体的多克隆位点插入DNA片段N得到的重组载体；所述DNA片段N由肝脏特异启动子和Tet-on基因表达系统的反义四环素激活子(rtTA)编码基因按上游至下游的顺序依次连接而成。
所述肝脏特异启动子为小鼠白蛋白启动子或转甲状腺素蛋白(transthyretin，TTR)启动子或载脂蛋白(apolipoprotein E，ApoE)启动子等。
所述的重组表达载体Q中，在所述小鼠白蛋白启动子上游还插入了增强子，形成了所述小鼠白蛋白启动子和增强子融合的DNA片段T，所述DNA片段T是如下i)或ii)或iii)的DNA分子：
i)其核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
ii)在严格条件下与i)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；
iii)与序列表中序列3限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的DNA分子。
所述反义四环素激活子可为如下c)或d)的蛋白质：
c)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
d)将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有反义四环素激活子功能的由序列4衍生的蛋白质。
所述反义四环素激活子编码基因可为如下e)或f)或g)的DNA分子：
e)其核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子；
f)在严格条件下与e)限定的DNA序列杂交且编码所述反义四环素激活子的DNA分子；
g)与序列表中序列5限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码具有反义四环素激活子功能的蛋白质的DNA分子；
所述重组表达载体Q具体可为pAlb-rtTA。
上述pAlb-rtTA是将pSK载体的SacI和BamHI位点间的小片段取代为所述DNA片段T、EcoRI和HindIII位点间的小片段取代为反义四环素激活子编码基因得到的。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5％ SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％ SDS和1×SSC，0.1％ SDS各洗膜一次。
切除所述重组表达载体P中的原核表达元件得到的DNA片段P’也属于本发明的保护范围。
所述DNA片段P’具体可为用DrdI和HpaI酶切所述pTRE-uPA得到的大片段。
切除所述重组表达载体Q中的原核表达元件得到的DNA片段Q’也属于本发明的保护范围。
所述DNA片段Q’具体可为用KpnI和SacI酶切所述pAlb-rtTA得到的大片段。
本发明还提供了一种肝损伤动物模型的制作方法，包括以下步骤：
1)将所述重组表达载体P或所述DNA片段P’导入动物中，得到转基因首建者动物A；将所述重组表达载体Q或所述DNA片段Q’导入动物中，得到转基因首建者动物B；
2)将所述转基因首建者动物A与非转基因正常动物进行杂交，得到携带有所述DNA片段K的F1代转基因动物A1；
将所述转基因首建者动物B与所述非转基因正常动物进行杂交，得到携带有所述DNA片段N的F1代转基因动物B1；
3)将所述F1代转基因动物A1和所述F1代转基因动物B1进行杂交，得到的携带有所述DNA片段K和所述DNA片段N的F2代转基因动物C作为肝损伤动物模型。
所述方法中还可包括将同窝的所述F2代转基因动物C进行传代得到的所有携带有所述DNA片段K和所述DNA片段N的后代均作为肝损伤动物模型的步骤。
所述动物具体可为小鼠。
本发明得到的模型小鼠，在强力霉素(DOX)诱导后，检测到了uPA mRNA的表达；诱导前后血清中的ALT活力浓度明显提高，可以确定肝脏受到了一定程度的损伤；通过肉眼观察可见DOX诱导后小鼠肝脏的颜色变白，呈现出明显的损伤症状。结果证明，本发明制作的模型小鼠的uPA的表达模式是正确的，并能对小鼠的肝脏造成较为严重的损伤，因此，该小鼠模型可以作为人源肝细胞移植的优良受体进行人源化小鼠肝脏的相关研究。
本文发明应用Tet-on基因表达系统制备了Tet-on调控uPA基因在小鼠肝细胞中特异性表达的转基因小鼠，该转基因小鼠肝细胞中uPA基因的表达时间和表达量受Doxycycline诱导调控，肝损伤的时间和程度可以根据实验要求人为加以控制。因此，该转基因小鼠作为人源化小鼠肝脏具有以下三个方面优势：
1)与正常小鼠一样很容易获得转基因纯合子后代，可以获得大量的可移植受体小鼠；
2)细胞移植的时间不受限制，可以选择在出生后4～6周的成体小鼠，所以，移植手术的难度降低、大大提高手术后小鼠成活率；
3)小鼠肝损伤的程度可以根据实验需要，通过饲喂Doxycycline的剂量来加以调控，从而得到更为理想的实验结果。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
附图说明
图1为不同退火温度PCR扩增的uPA cDNA电泳图
图2为凝胶回收后的PCR扩增的uPA DNA的电泳图
图3为pGEMT-uPA阳性重组质粒的酶切鉴定电泳图
图4为鉴定pTRE-uPA阳性克隆的电泳图
图5为pTRE-uPA载体的酶切鉴定电泳图
图6为线性化的pTRE-uPA的DNA片段的电泳图
图7为用于显微注射的pTRE-uPA载体DNA片段的电泳图
图8为pAlb-rtTA载体的酶切鉴定电泳图
图9为PCR鉴定pTRE-uPA转基因阳性始建者小鼠
图10为PCR鉴定pAlb-rtTA转基因阳性始建者小鼠
图11为RT-PCR检测DOX诱导后小鼠肝脏中uPA mRNA的表达
图12为Tet-uPA小鼠DOX诱导6天后肝脏形态的变化
具体实施方式
应用本发明制作小鼠模型的具体流程如下：
1)从ICR小鼠肾脏RNA中通过RT-PCR扩增出尿激酶原激活剂(uPA)基因的cDNA。
2)将步骤1)得到的cDNA克隆入Tet-on系统的反应元件pBI载体中构建成pTRE-uPA。
3)构建能在小鼠肝脏中特异性表达的Tet-on系统的调控元件pAlb-rtTA的载体。
4)分别将步骤2)和步骤3)构建的载体切除原核表达元件，得到两种线性的DNA片段。
5)将步骤4)得到pTRE-uPA线性DNA片段应用原核显微注射法导入ICR小鼠，得到转基因首建者小鼠A；将步骤4)得到pAlb-rtTA线性DNA片段应用原核显微注射法导入ICR小鼠，得到转基因首建者小鼠B。
6)将转基因首建者小鼠A与ICR小鼠杂交获得F1代转基因小鼠，鉴定阳性的为A1；将转基因首建者小鼠B与ICR小鼠杂交获得F1代转基因小鼠，鉴定阳性的为B1。
7)将转基因小鼠A1和转基因小鼠B1杂交获得的双阳性转基因小鼠C，即为可调控的肝损伤小鼠模型。
8)将同窝的所述F2代转基因小鼠C进行传代得到的所有携带有所述DNA片段K和所述DNA片段N的后代均作为肝损伤小鼠模型。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、Tet-on调控uPA基因在小鼠肝脏特异性表达的重组载体的构建
Tet-on调控uPA基因在小鼠肝脏特异性表达的重组载体有两个，一个是携带有Tet-on表达的反应元件TRE和uPA基因的重组表达载体pTRE-uPA，另一个是携带有小鼠白蛋白(Albumin)启动子和Tet-on表达的调控元件rtTA基因的重组载体pAlb-rtTA。在pAlb-rtTA中，rtTA基因位于Albumin启动子之下并受其调控，在小鼠肝脏中特异性表达；而肝脏中rtTA的浓度变化进而可以调控尿激酶原激活剂(uPA)基因的表达。
pTRE-uPA和pAlb-rtTA的具体构建方法如下：
一、pTRE-uPA质粒载体的构建和供原核注射DNA样品的制备
从ICR小鼠肾脏RNA中通过RT-PCR扩增出尿激酶原激活剂(uPA)基因的cDNA，将其克隆入pGEM-T载体中测序正确后，Mlu I和Nhe I双酶切下uPA cDNA片段并克隆入Tet-on系统的反应元件pBI载体的多克隆位点内，构建成pTRE-uPA载体，进一步使用Hpa I和Drd I酶切出3.6kb的DNA片段用于原核显微注射制作转基因小鼠。
(一)小鼠uPA cDNA的克隆和测序
提取ICR小鼠肾脏的总RNA，经RT-PCR反应得到uPA cDNA并将其克隆于pGEM-T载体上，蓝白斑筛选挑取阳性克隆进行DNA序列测定。
1、ICR小鼠肾脏总RNA提取
①取成年的ICR小鼠一只，颈椎脱臼法致死，使用干热灭菌后的镊子取小鼠的肾脏放入1.5ml的Eppendorf管(无核酸酶)中，加入1ml Trizol(invitrogen，Cat.No.15596-026)充分匀浆，室温静置5分钟；
②加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，静置2min；
③4℃离心，12000g×15min，取上清；
④加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min；
⑤4℃离心，12000g×10min，弃上清；
⑥加入1ml 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃，7500g×5min，弃上清；
⑦晾干，加入100ul无RNase水溶解(65℃促溶10-15min)。
提取的总RNA立即用于反转录或是置于-80℃保存。
将小鼠肾脏总RNA稀释50倍后，于紫外分光光度计测定A260/280的OD值。OD260＝0.699；OD280＝0.435；A260/280＝1.607；总RNA的浓度为：0.699×40ug/ml×50(稀释倍数)＝1398ug/ml。
2、反转录合成cDNA第一链
①取0.7ul总RNA(相当于1ug总RNA)于200ul PCR管中，70℃孵育10分钟后置于冰上。
②在上述PCR管中加入以下体积的溶液，制备成20ul的反转录反应体系：
25mM MgCl2 4ul
10×RT buffer 2ul
dNTP混合物 2ul
RNA酶抑制剂 0.5ul
AMV反转录酶 0.5ul
Oligo(dT)15 1ul
无核酸酶的水 至终体积20ul
③上述反应体系42℃孵育15分钟后，95℃加热5分钟，4℃保温5分钟后，置于-20℃保存备用。
3、PCR扩增uPA cDNA
①根据Gene bank中小鼠的uPA mRNA序列(NM_008873)设计一对引物P1和P2，引物上游引入MluI酶切位点，引物下游引入Nhe I酶切位点(下划线标注的DNA序列)。上游引物位于uPA mRNA起始编码区上游96bp处，下游引物位于终止密码子下游76bp处。
P1：5’GGCACGCGTATGAAAGTCTGGCTGGCGAG 3’，
P2：5’TCTGCTAGCGAGAGGACGGTCAGCATGGG 3。
②应用引物P1和P2，以反转录的cDNA为模板，使用TaKaRa的Pyrobest DNA聚合酶进行PCR反应。
PCR反应体系(100ul)如下：
无菌去离子水 71ul
10×Pyrobest buffer II 10ul
P1(10uM) 2ul
P2(10uM) 2ul
dNTP混合物(各2.5mM) 8ul
cDNA 5ul
Pyrobest DNA聚合酶 2ul
PCR反应条件如下：
将下述变性→退火→延伸进行35个循环。
变性：94℃，30sec；
退火：分别采用57℃、58.6℃、60.5℃、62.4℃、64.2℃和65℃6个温度梯度进行，40sec；
延伸：72℃，2min。
分别将上述6种退火温度下进行PCR的产物进行电泳，以优化PCR反应条件，电泳图见图1。图1中，从左到右的泳道对应的样品依次为：M：DNA marker，DL2000；1：57℃PCR的产物；2：58.6℃PCR的产物；3：60.5℃PCR的产物；4：62.4℃PCR的产物；5：64.2℃PCR的产物；6：65℃PCR的产物；7：PCR空白对照。
由图可见，随着PCR退火温度从57℃上升到65℃的过程中，1.4kb大小的目的条带的亮度和特异性都随之增强，因此在随后的PCR反应中选择了65℃为最适的退火温度。
4、PCR产物的回收
将退火温度为65℃的PCR产物进行凝胶电泳后，应用DNA快速纯化/回收试剂盒(北京鼎国生物公司，cat.no A014-1)回收1.4kb条带，具体步骤如下：
①100ul反应体系的PCR产物进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，切取含DNA片段的琼脂糖置于1.5ml Eppendorf管中称重，用吸头捣碎并加入溶液A。
②65℃水溶5-10分钟，胶完全溶化即可，其间可振荡助溶2-3次，待溶化后置室温，加入15ul溶液B，充分混匀。
③将溶液置于离心柱中，静置2分钟，10000rpm离心20-30秒，若一次加不完，可分两次离心；
④倒掉液体，加入500μl溶液C于离心柱中8000rpm离心20-30秒，弃液体，此步骤重复一次；
⑤12000rpm再次离心1分钟，甩干剩余液体以除去残余酒精；
⑥将离心柱置于新的离心管中，室温敞开离心管盖放置5-10分钟，使乙醇挥发殆尽；
⑦加入20-30ul溶液D，50℃水浴静置2分钟后，15000rpm离心1分钟，管底溶液即为所需DNA。
回收的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图2。图2中，从左到右的泳道对应的样品依次为：M：DNA marker，DL2000；1：回收的PCR产物。
将得到的DNA稀释20倍，于紫外分光光度计下测定A260/280OD。A260＝0.035；A280＝0.022；A260/280＝1.609；DNA浓度为：0.035×50ug/ml×20＝35ng/ul。
其余的DNA储存于-20℃备用。
5、PCR产物的鉴定
回收的PCR产物经体外加A反应后，连入pGEM-T载体进行序列分析，具体步骤如下：
1)加A反应
反应体系(10ul)如下：
PCR产物 7.2ul
10×PCR缓冲液 1ul
dNTP混合物(2.5mM) 0.8ul
Taq DNA聚合酶 1.0ul
70℃条件下反应30分钟。
2)连接反应
反应体系(10ul)如下：
2×T4 DNA连接酶缓冲液 5ul
pGEM-T(50g/ul) 0.5ul
加A后的PCR产物 3.5ul
T4 DNA连接酶 1ul
室温孵育1小时后，用于转化实验。
3)转化
取5ul连接产物加入到100ul大肠杆菌Top10感受态细胞中，冰浴30分钟；42℃孵育90秒；再冰浴2分钟；将其转移至0.5ml LB培养液中，37℃、100rpm条件下培养45分钟；然后吸取50ul均匀涂布于经过IPTG和X-gal处理的10cm LB平板上，37℃条件下培养18小时。
4)重组阳性菌落的挑选和鉴定
挑选8-10个分散良好的白色单菌落，分别加入5ml液体LB培养基中，37℃、250rpm条件下培养12小时，待培养基变得混浊时，分取1ul菌液用于PCR鉴定重组，其余菌液4℃条件下保存。
经PCR鉴定，确为重组阳性的克隆命名为pGEMT-uPA。应用Promega公司的WizardPlus SV Minipreps DNA Purificat ion System试剂盒提取重组阳性克隆质粒，提取质粒的具体实验步骤如下：
①吸取1.5ml菌液至1.5ml Eppendorf管中，10000g离心1min，弃上清，再次加入1.5ml过夜培养的菌液，离心、弃上清后收获菌体；
②加入250ul细胞悬浮液，用移液器反复吹打后再剧烈振荡1min，仔细观察待菌体彻底悬浮即可；
③缓慢加250ul细胞裂解液，上下缓慢的颠倒4-5次以混匀，室温孵育小于5min，待溶液变得澄清即可；
④加入10ul碱性蛋白酶溶液(Alkaline Protease Solution)，上下缓慢的颠倒4-5次以混匀，室温孵育5min；加入350ul中和液，立即上下颠倒4-5次以混匀；
⑤室温条件下14000g离心10min；
⑥将约850ul的上清液移入置于收集管上的制备柱(Prepared Spin Column)中，室温条件下14000g离心1min；
⑦吸出收集管中的液体，将制备柱(Prepared Spin Column)重新放于收集管上；
⑧加入750ul清洗液(Colume Wash Solution)，室温条件下14000g离心1min；
⑨吸出收集管中的液体，将制备柱(Prepared Spin Column)重新放于收集管上；加入250ul清洗液(Colume Wash Solution)，室温条件下14000g离心2min；
⑩将制备柱(Prepared Spin Column)重新放于一新的、无菌的1.5ml Eppendorf管上，加入100ul无核酸酶的水，室温条件下14000g离心1min，以洗脱质粒DNA。
取2ug质粒进行Mlu I和Nhe I双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切后质粒DNA片段的大小，如出现3kb和1.3kb两条DNA条带则可确定该质粒确为pGEMT-uPA阳性重组质粒，电泳图见图3。图3中，从左到右的泳道对应的样品依次为：M：DNAmarker，DL2000；1：pGEMT-uPA载体MluI+NheI酶切；2：pGEMT-uPA载体。
从图3可见，pGEMT-uPA用Mlu I和Nhe I双酶切后可见分子量大小分别为3.0kb和1.3kb的两条带，与预期结果完全相符。
5)测序
经PCR、Mlu I和Nhe I双酶切鉴定确为阳性重组质粒的pGEMT-uPA送交北京三博远志生物公司测序。测序结果表明，pGEMT-uPA中克隆的uPA cDNA序列完全正确，是GenBank Accession Number NM_008873的自5′末端第59位至1424位脱氧核糖核苷酸，其编码序列是GenBank Accession Number NM_008873的自5′末端第59位至1360位脱氧核糖核苷酸，编码序列是GenBank Accession Number NP_032899的自氨基末端第1至433位氨基酸残基的uPA。
(二)载体的构建和鉴定
pBI(Clontech)是携带Tet-on调控反应元件TRE的质粒，调控外源基因表达的CMV启动子位于TRE反应元件下游并受TRE调控，所以选择pBI质粒作为出发载体构建pTRE-uPA。pBI质粒上，所述调控外源基因表达的CMV启动子序列见序列表的序列1，所述四环素反应因子(TRE)序列见序列表的序列2。
将pGEMT-uPA经Mlu I和Nhe I双酶切，得到1.4kb的片段，连入经过同样酶切的pBI质粒(Clontech)中，酶切鉴定成功重组的阳性质粒，进行进一步的大量提取和纯化。
1、pBI质粒的提取
应用Promega公司的Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System试剂盒提取pBI质粒。
用Mlu I和Nhe I双酶切质粒DNA得到大小为4.4kb的DNA片段，琼脂糖凝胶电泳鉴定表明酶切后的DNA片段大小正确。
2、pTRE-uPA载体的构建和鉴定
1)酶切和回收
①pTRE-uPA质粒的酶切和回收
用Mlu I(NEB)和Nhe I(NEB)双酶切经测序正确的pGEMT-uPA质粒以回收uPAcDNA，反应体系50ul，具体如下：
10×NEB Buffer 5ul
pGEMT-uPA质粒DNA 20ul(约5ug)
MluI 2.5ul
NheI酶 2.5ul
无菌水 20ul
以上溶液混匀后，37℃保温12h后，取1ul进行0.7％琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否完全，待确定酶切已完全后，中止反应。使用鼎国公司的DNA快速纯化/回收试剂盒回收1.4kb大小的uPA cDNA片段。
②pBI质粒的酶切和回收
pBI质粒使用Mlu I+Nhe I酶切(NEB公司)，反应体系50ul，具体如下：
10×NEB Buffer 5ul
DNA 20ul(约5ug)
MluI 2.5ul
NheI酶 2.5ul
无菌水 20ul
以上溶液混匀后，37℃保温12h后，取1ul进行凝胶电泳检测酶切是否完全，待确定酶切已完全后，中止反应。使用鼎国公司的DNA快速纯化/回收试剂盒回收酶切后的DNA。
2)连接反应
使用DNA Ligation Kit Ver2.0，按照插入的DNA/载体摩尔比3∶1的比例分别吸取适量的DNA在1.5ml管中，反应体系10ul，分别加入：10×buffer 1ul，10mM dNTP0.2ul，T4 DNA连接酶0.2ul，适量的无菌水补足至10ul，16℃条件下反应30min。
3)转化
取5ul连接产物加入到100ul Top10感受态中，冰浴30分钟；42℃孵育90秒；再冰浴2分钟；将其转移至0.5ml LB培养液中，37℃、100rpm条件下培养45分钟；然后吸取50ul均匀涂布于直径10cm的LB平板上，37℃条件下培养18小时。
4)重组阳性质粒的筛选、鉴定
随机挑取形态正常、分散良好的20个单菌落进行PCR鉴定，电泳图见图4。图4中，从左到右的泳道对应的样品依次为：M：DNA marker，DL2000；1-20：随机挑取的1-20号克隆。结果有12个阳性克隆。
再分别挑取12个阳性克隆的菌落置于装有3ml LB液体培养基(含有Amp100ug/ml)的试管中，37℃、250rpm条件下培养12小时，待培养液变得浑浊时终止培养，应用Promega公司的Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System试剂盒提取质粒。
提取的质粒经Mlu I+Nhe I和Drd I+Hpa I双酶切、琼脂糖凝胶电泳，如出现两条分子量大小分别为4.35kb和1.38kb(MluI+NheI酶切结果)和3.6kb和2.1kb(DrdI+HpaI酶切结果)的DNA片段时，则可以确定为重组阳性的质粒，命名为pTRE-uPA。
经Mlu I+Nhe I和DrdI+HpaI双酶切鉴定，从12个阳性克隆中筛选到pTRE-uPA。pTRE-uPA的酶切结果见图5，图5中，从左到右的泳道对应的样品依次为：M：DNAmarker，DL15000；1：pTRE-uPA载体；2：pTRE-uPA载体经MluI+NheI酶切；3：pTRE-uPA载体经DrdI+HpaI酶切。
结果酶切片段大小正确，说明构建成功。
(三)pTRE-uPA载体的酶切线性化和纯化
选取DrdI和HpaI双酶切pTRE-uPA载体使其线性化，凝胶回收3.6kb的目的片段，进一步纯化后用于显微注射。
1、酶切线性化
反应体系(450ul)如下：
pTRE-uPA1 200ul(约30ug)
DrdI 5ul
HpaI 5ul
10×NEB buffer 4.5ul
无菌去离子水 235.5ul
混匀后，37℃条件下酶切消化12小时后，先吸取2ul酶切反应液电泳检测是否酶切完全，如果分子量为5.7kb的DNA条带消失，同时出现了3.6kb和2.1kb两个DNA片段则说明酶切已完全，则终止酶切反应。将酶切反应完全的产物进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，应用DNA快速纯化/回收试剂盒(北京鼎国生物公司，cat.no A014-1)回收分子量大小为3.6kb的包含有Tet-on反应调控元件TRE和uPAcDNA的片断。回收片段的电泳图见图6。图6中，从左到右的泳道对应的样品依次为：M：DNAmarker，DL15000；1：回收的DNA片段(2ul)；2：回收的DNA片段(4ul)；3：回收的DNA片段(6ul)。
2、线性化的pTRE-uPA的纯化
用Promega Wizard DNA clear-up kit(Cat：A 7280)进一步纯化线性化的DNA片段。
3、原核注射DNA样品的制备
按一定的稀释比测定DNA样品的260nm OD值及280nm OD值，计算其比值。DNA浓度为：260nm OD值×50ug/ml×稀释倍数＝DNA(ug/ml)。根据测定的结果，加入适量的TE，将DNA浓度稀释至2-5ng/ul，然后12000g×10min，4℃下离心。将上述离心后的上1/3部分溶液小心吸出，分装于经过充分洗涤的0.2ml管，20ul/管(可先将上部1/3液体转移到另外一个干净的0.6ml tube，然后再分装)。最后将分装后的DNA冻存于-20℃或-80℃冰箱，准备用于原核注射。最后用于显微注射用的DNA片段的电泳结果见图7。图7中，从左到右的泳道对应的样品依次为：M：DNAmarker，DL15000；1、2：均为纯化后用于显微注射的pTRE-uPA载体DNA片段，分子量大小为3.6kb。
二、pAlb-rtTA载体的构建与供原核注射DNA样品的制备
1、Alb启动子/增强子的获得
将位于小鼠白蛋白基因5’上游10.4-8.5kb之间的1.99kb的增强子片断和0.33kb的启动子片断融合成长度为2.3kb的Alb启动子/增强子，具体实验方法参见文献(Pinkert CA et al.An ALB enhancer located 10kb upstream functions alongwith its promoter to direct efficient，liverspecific expression in transgenicmice.Genes Dev 1987；1：268-276.)。获得的Alb启动子/增强子序列见序列表中的序列3。
2、rtTA编码基因的获得
EcoRI和HindIII(NEB)双酶切pUHrt62-1质粒(Clontech)获得附加有SV40polyA的rtTA编码基因，获得的rtTA基因经过DNA序列分析，结果表明序列完全正确，rtTA基因的编码序列见序列表中的序列5，rtTA基因编码的氨基酸序列见序列表中的序列4。
3、pAlb-rtTA载体的构建
先将Alb启动子/增强子插入pSK载体的SacI和BamHI多克隆位点构建成pSK-Alb，然后再将带有SV40polyA的rtTA编码基因插入pSK-Alb载体的EcoR I和HindIII多克隆位点，构建pAlb-rtTA载体。
对得到的载体进行SacI+KpnI双酶切鉴定，结果见图8。图8中，从左到右的泳道对应的样品依次为：M：DNA marker，DL15000；1-3：分别为随机挑取的1-3号克隆。
由图可见，出现分子量大小分别为3.5k和3k的条带。琼脂糖凝胶电泳回收3.5kb的DNA片段。
3、线性化的pAlb-rtTA载体的纯化
琼脂糖凝胶电泳回收3.5kb的DNA片段进行进一步的纯化以用于显微注射。具体操作同步骤一的(三)的2。
4、原核注射DNA样品的制备
具体操作同步骤一的(三)的3。
实施例2、转基因小鼠的制作和繁育
一、转基因小鼠的制作和鉴定
1、转基因小鼠的制作
①选取4-5周龄雌性ICR小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射10IU孕马血清(PMSG)。
②47-48小时后，每只小鼠腹腔注射10IU的人促绒毛膜性腺激素(HCG)，并与正常公鼠合笼，以提供受精卵。另取数只适龄母鼠(2月龄以上)，选取其中的阴道口潮红的发情母鼠作为受体，与结扎公鼠合笼。
③第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用，受体笼拿出作好隔离措施。
④10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入含有0.05％透明质酸酶(Sigma)M2液(Sigma)中，显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。
⑤仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液(Sigma)中洗涤，最后放在M16液(Sigma)中放入5％CO2，37℃培养箱培养。
⑥在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。
⑦安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵，DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。
⑧在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出；将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5％CO2，37℃培养箱培养。
⑨将受体麻醉，注射计量为1％戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。除较长的那段液体，其余的液体大致1cm左右，气泡0.2cm左右。将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤。
⑩受体每隔一个星期称体重一次，当第二次比第一次称重增加时，即可初步判断怀孕。手术后19-21天仔鼠分娩，即得到转基因首建者(Founder)小鼠。
2、转基因小鼠的鉴定
使用pTRE-uPA载体进行注射共得到48只转基因首建者小鼠A0，使用pAlb-rtTA载体进行注射共得到30只转基因首建者小鼠B0。
待转基因首建者(Founder)小鼠3周后，剪脚趾编号，剪尾提取DNA应用PCR方法进行检测。具体的方法如下：
(1)PCR引物的设计
①用于检测转基因小鼠A的上游引物在设计在mini CMV promoter序列内，下游引物设计在uPA基因的cDNA序列内，以保证PCR结果的可靠性，设计的PCR引物序列如下：
uPA434F：5’GTCGAGTAGGCGTGTACGGT 3’，
uPA841R：5’CCATTTCCATGATAGCAGGT 3’。
PCR产物大小为407bp。
②用于检测转基因小鼠B的引物上游在设计在Albumin promoter序列内，引物下游设计在rtTA基因序列内，以保证PCR结果的可靠性，设计的PCR引物序列如下：
Alb-rtTA2178F：5’GCTCCAGATGGCAAACATACGC 3’，
Alb-rtTA2822R：5’TTCCTCCAATACGCAGCCCAGT 3’。
PCR产物大小为644bp。
(2)PCR反应
应用上述引物进行PCR反应。
PCR反应体系(10ul)如下：
无菌去离子水 7.1ul
10×Pyrobest buffer 1.0ul
上游引物(10uM) 0.2ul
下游引物(10uM) 0.2ul
dNTP Mixture(各2.5mM) 0.8ul
cDNA 0.5ul
Pyrobest DNA Polymerase 0.22ul
反应条件：
94℃变性30sec→57℃退火30sec→72℃延伸40sec，反应进行35个循环。
pTRE-uPA转基因首建者小鼠鉴定结果见图9。图9中，从左到右的泳道对应的样品依次为：M：DNA marker，DL15000；1-48：分别为48只出生的小鼠。pAlb-rtTA转基因阳性小鼠鉴定结果见图10。图10中，从左到右的泳道对应的样品依次为：M：DNA marker，DL15000；PC：pAlb-rtTA载体；转基因阳性小鼠。
结果得到11只pTRE-uPA转基因阳性始建者小鼠A，分别为7、9、12、18、22、26、29、31、35、39、42；5只pAlb-rtTA转基因阳性始建者小鼠B，分别为1-5，2-9，2-10，3-8，4-6。
二、Tet-on调控uPA转基因小鼠的繁育
转基因首建者小鼠A和转基因首建者小鼠B分别与ICR小鼠交配得到F1代小鼠A1和B1；F1代的小鼠A1和B1相互交配，子代为F2代，PCR筛选Alb-rtTA和uPA基因双阳性的小鼠得到杂合的Tet-on调控的uPA小鼠C，即为小鼠模型；将小鼠C进行传代得到的双阳性后代小鼠均可作为小鼠模型。
从小鼠A中选取26、29两只分别与ICR小鼠交配得到F1代；从小鼠B中选取2-9、2-10两只分别与ICR小鼠交配得到F1代；PCR筛选uPA片段转基因阳性的F1代小鼠A1和Alb-rtTA片段转基因阳性的F1代小鼠B1相互交配，得到的后代得到F2代仔鼠；再经PCR筛选得到Alb-rtTA和uPA基因双阳性的小鼠C，即为模型小鼠；将小鼠C进行传代得到的双阳性后代小鼠均可作为小鼠模型，用于进一步的转基因表达的鉴定。
三、Tet-on调控转基因小鼠的肝脏uPA表达的鉴定
Tet-on调控uPA基因表达的转基因小鼠在强力霉素(doxycycline，Dox)诱导条件下可造成特异性肝脏损伤，肝脏损伤的情况可以通过小鼠血清中的的丙氨酸氨基转移酶(ALT)浓度升高反映出来，另外，还可以通过RT-PCR检测肝脏中uPA mRNA的表达来确定DOX诱导后uPA基因的表达情况。
1、DOX诱导前后转基因小鼠血清中ALT浓度的变化的检测
选取待诱导的Tet-on uPA小鼠眼眶静脉丛采血，8000rpm条件下离心5min，收集上清冻存于-20℃备用，采血后的小鼠在饮用水中加入1mg/ml的强力霉素(doxycycline，Dox)诱导表达6天后，同样的方法再次采血并收集血清用于ALT浓度的检测，同时以非转基因的ICR小鼠作为对照。
用上海百祥生物科技有限公司ALT测定试剂盒检测ALT，按表1在96孔板中加入各溶液，取出，冷至室温，于酶标仪上490nm比色，以空白孔较零，读取各孔吸光度。样品ALT活力浓度＝测定管吸光/标准管吸光×标准血清中酶活力浓度。结果见表2。
表1 96孔板中加入的溶液
表2 DOX诱导Tet-uPA小鼠6天后血清中ALT浓度的变化情况
样品编号 诱导前ALT浓度 (IU/L) 诱导后ALT浓度 (IU/L) 诱导后ALT浓度变化 (IU/L)
ICR 39 40 1 72-133 50 236 186 72-134 49 87 38 72-137 43 90 47 61-29 59 104 45 66-74 50 92 42 66-78 59 174 115 平均值 51.6 130.5 78.9
2、RT-PCR检测肝脏中uPA mRNA的表达
切取DOX诱导6天的Tet-uPA小鼠的肝脏，提取RNA，RT-PCR检测uPA基因mRNA的表达。其中RNA的提取和反转录以及PCR反应的具体操作步骤同上，PCR引物和反应条件如下：
PCR引物序列：
上游引物：5’GCTGTCAGAACGGAGGTGTA 3’
下游引物：5’TTGGGAGTTGAATGAAGCAG 3’
PCR反应条件：
变性：94℃、30sec→退火：57℃、30sec→延伸：72℃、30min
反应进行35个循环。
PCR产物：600bp。
切取上述5只DOX诱导6天的Tet-uPA小鼠的肝脏，提取RNA，用beta-actin作为内参，RT-PCR检测uPA基因mRNA的表达，同时以正常ICR小鼠的作为对照。结果见图11。图11中，从左到右的对应的样品依次为：编号72-133的小鼠、编号72-134的小鼠、编号72-137的小鼠、编号61-29的小鼠、编号66-74的小鼠、ICR小鼠。结果可见，5只Tet-uPA小鼠经DOX诱导6天后，肝脏中uPA基因在转录水平均有较高的表达，而对照的ICR小鼠则没有表达。
3、肝脏形态学鉴定
观察DOX诱导6天后的转基因小鼠和非转基因小鼠的肝脏形态，见图12。图12中，a为非转基因小鼠，b为转基因小鼠。通过肉眼观察可见DOX诱导后小鼠肝脏的颜色变白，呈现出明显的损伤症状，而非转基因小鼠经DOX诱导后肝脏形态没有变化。
结论：应用Tet-on调控表达系统成功地制作了可调控的肝损伤小鼠模型，该小鼠模型可以作为人源肝细胞移植的优良受体进行人源化小鼠肝脏的相关研究。
序列表