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小檗碱衍生物的制备方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101157693 B (45)授权公告日 2011.08.31 CN 101157693 B *CN101157693B* (21)申请号 200710186429.4 (22)申请日 2006.06.29 200610019492.4 2006.06.29 C07D 455/03(2006.01) (73)专利权人华中科技大学同济医学院附属同济医院地址 430030 湖北省武汉市汉口解放大道 1095 号 ( 同济医院科研处 ) (72)发明人徐丽君陆付耳魏世超 (74)专利代理机构武汉开元知识产权代理有限公司 42104 代理人胡镇西 jiri。

2、 dostal et al.berberine and coptisine free bases.J. molecular structure687.2004,687135-142. (54) 发明名称小檗碱衍生物的制备方法 (57) 摘要一种小檗碱衍生物醇式小檗碱的制备方法，包括以下步骤：将硫酸氢小檗碱原料溶于水中，制成硫酸氢小檗碱饱和溶液；在硫酸氢小檗碱饱和溶液中滴加碱溶液，直至再无沉淀物产生为止，形成浑浊液；对上述浑浊液进行过滤，获得沉淀物；将所得沉淀物溶于有机溶剂中，通过硅胶柱层析，用有机溶剂洗脱；对上述有机溶剂洗脱液减压浓缩，真空。

3、低温干燥，获得粗产物；将所得粗产物用甲醇或乙醇重结晶，即可得到足够量的小檗碱衍生物纯品。动物实验发现，所制得的小檗碱衍生物具有多种药物活性，显示出优异的调节 2 型糖尿病大鼠血糖和血脂的作用，比目前公认具有调节血糖和血脂作用的、结构最相关的化合物盐酸小檗碱的效果要好得多，且有效剂量要小很多。 (62)分案原申请数据 (51)Int.Cl. (56)对比文件审查员解佳烨 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利权利要求书 1 页说明书 11 页附图 2 页 CN 101157693 B1/1 页 2 1. 一种醇式小檗碱的制备方法，包括。

4、以下步骤： 1) 将硫酸氢小檗碱原料溶于水中，制成硫酸氢小檗碱饱和溶液； 2) 在硫酸氢小檗碱饱和溶液中滴加碱溶液，直至再无沉淀物产生为止，形成浑浊液； 3) 对上述浑浊液进行过滤，获得沉淀物； 4) 将所得沉淀物溶于有机溶剂中，通过硅胶柱层析，用有机溶剂洗脱； 5) 对上述有机溶剂洗脱液减压浓缩，在真空度低于 150mbar、温度低于 60的条件下真空低温干燥，获得粗产物； 6) 将所得粗产物用甲醇或乙醇重结晶，即可得到醇式小檗碱纯品，它是下列结构式所示的化合物： 2. 根据权利要求 1 所述的醇式小檗碱的制备方法，其特征在于：所说的步骤 2) 。

5、中的碱溶液为氢氧化钠溶液。 3. 根据权利要求 1 所述的醇式小檗碱的制备方法，其特征在于：所说的步骤 4) 中的有机溶剂为甲醇、乙醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮中的一种或一种以上的任意组合。权利要求书 CN 101157693 B1/11 页 3 小檗碱衍生物的制备方法 0001 本发明系申请日为 2006 年 6 月 29 日、申请号为 200610019492.4、发明名称为小檗碱衍生物及其制备方法和其药物组合物与用途的分案申请。技术领域 0002 本发明涉及以小檗碱 (BBR) 为母体进行化学修饰合成的方法，具体地指一种小檗碱衍生物的制。

6、备方法。背景技术 0003 目前，糖尿病已经成为世界性的流行病，据统计资料显示：国内 2 型糖尿病患病率 1976 年为 1.0， 1989 年为 2.0， 1996 年为 3.2， 2001 年上海和广州则超过了 9，已经高于欧美发达国家的平均水平。糖尿病已经成为人类的 “第三大杀手” ，与之相关的医疗护理费用开支极为庞大，即使是经济发达的国家也不堪重负。 0004 小檗碱 (BBR) 亦称黄连素，它是从中药黄连、黄檗等原料中提出的一种抗菌性生物碱，其盐酸盐为黄色粉末，味苦，微溶于水。其在试管中能痢疾杆菌、结核杆菌和葡萄球菌等，效价较一般抗菌素低，其。

7、口服后吸收很差，对细菌性痢疾和某些肠道感染有效。其注射后对循环和呼吸有一定的抑制作用。其外用可治疗化脓性感染和眼结膜炎等。 0005 科研人员对小檗碱 (BBR) 治疗和预防糖尿病的课题已进行了近十年的研究，大量的实验数据表明：小檗碱可治疗 2 型糖尿病，其最主要的作用就是调节患者的血糖和血脂。调节血糖包括促进胰岛素分泌，改善胰岛素抵抗 ( 主要是调节胰岛素抵抗相关因子游离脂肪酸 FFA 的量 ) ；调节血脂主要在于降低甘油三酯的量，且疗效确切。然而在实际应用中，不仅小檗碱的动物试验服用剂量较高，其有效剂量高达 185mgKg-1d-1，而且小檗碱的临床口服剂量。

8、亦较高，有的高达 3gd-1，且 1 3 个月为一疗程。高剂量长周期地使用，无疑会破坏患者肠道中的菌丛平衡，增加小檗碱的副作用。而另一方面，小檗碱的离体试验结果显示其有效浓度需求却很低， 1 10molL-1的小檗碱呈剂量依耐性地促进 HIT-T15 细胞分泌胰岛素， 0.1 100molL-1的小檗碱可显著增加脂肪细胞的葡萄糖消耗和转运， 5 100molL-1的小檗碱可使 HepG2 细胞的葡萄糖消耗量增加 33 60，疗效与 1mmolL-1的二甲双胍相当，由此可见低剂量小檗碱离体试验卓越的降糖效果。体内及离体剂量巨大的反差，提示小檗碱功效卓越但口服吸收极差。研究。

9、人员曾经以增强小檗碱肠胃吸收为目的，进行过许多药剂学上的实验探索，但实际应用于动物口服给药时，发现效果并不理想，这可能是动物体内的胃酸、酶系统或其他因素影响所致。对大鼠肠灌流实验也表明，灌肠 2.5 小时后仅有约 5的小檗碱从大鼠肠道消失，这提示在 2.5 小时以内，高达 95的小檗碱未被吸收利用。如何解决小檗碱的吸收问题，大幅度降低其服用剂量，充分发挥其治疗 2 型糖尿病的功效是科研人员急需攻克的难题。 0006 在 2004 年出版的 JOURNAL OF MOLECULAR STRUCTURE ( 分子结构杂志 ) 第 687 卷第 135 142 页中公开。

10、了一种小檗碱衍生物，我们称它为醇式小檗碱 (BBR-H)，具体见第 136 页图 1 中的第二幅，其化学结构式如下：说明书 CN 101157693 B2/11 页 4 0007 0008 文中介绍了该小檗碱衍生物的制备方法，该方法是将 100mg 硫化小檗碱 (1a， X HSO4) 溶于 20ml 水中，以乙醚作为该水溶液的保护层，加入氢氧化钠，轻轻摇动混合液，然后放在周围的温度下让其蒸发， 2 天之后，可以收集到一些亮黄色的晶体 2a，即醇式小檗碱 (BBR-H)。但通过该方法获取的小檗碱衍生物的量极少，不足以支持大规模的药物学实验和应用。文中也对该小。

11、檗碱衍生物进行了一些性能方面的研究实验，但其结论是发现该小檗碱衍生物几乎没有生物活性。发明内容 0009 本发明的目的就是要重新提供一种小檗碱衍生物的制备方法，以克服现有技术中获取醇式小檗碱 (BBR-H) 量极少的不足。 0010 本发明以硫酸氢小檗碱为原料，通过对现有小檗碱 (BBR) 的结构进行修饰，来合成上述醇式小檗碱 (BBR-H)，其制备方法包括以下步骤： 0011 1) 将硫酸氢小檗碱原料溶于水中，制成硫酸氢小檗碱饱和溶液； 0012 2) 在硫酸氢小檗碱饱和溶液中滴加碱溶液，直至再无沉淀物产生为止，形成浑浊液； 0013 3) 对上述浑浊液进行过。

12、滤，获得沉淀物； 0014 4) 将所得沉淀物溶于有机溶剂中，通过硅胶柱层析，用有机溶剂洗脱； 0015 5) 对上述有机溶剂洗脱液减压浓缩，真空低温干燥，获得粗产物； 0016 6)将所得粗产物用甲醇或乙醇重结晶，即可得到小檗碱衍生物纯品。经检测可知，其分子量为 353、分子式为 C20H19NO5、其化学结构式如下所示： 0017 0018 对上述制得的醇式小檗碱 (BBR-H) 进行药理学方面的实验发现，其具有多种有价值的药物活性，特别是其容易吸收的性能是现有小檗碱 (BBR) 所不具备的。具体地说： 0019 本发明制得的醇式小檗碱在动物试验中显示出。

13、了优异的调节 2 型糖尿病大鼠血糖和血脂的作用，它比目前公认具有调节 2 型糖尿病大鼠血糖和血脂作用的、结构最相关的化合物盐酸小檗碱的效果要好得多，且有效剂量要小很多。说明书 CN 101157693 B3/11 页 5 0020 本发明制得的醇式小檗碱在治疗 2 型糖尿病上的作用，主要体现在调节血糖和血脂方面。调节血糖包括改善口服葡萄糖耐量、促进胰岛素分泌、改善胰岛素抵抗 ( 主要是调节胰岛素抵抗相关因子游离脂肪酸FFA的量)，调节血脂主要在于降低甘油三酯的量。其口服治疗 2 型糖尿病大鼠的疗效突出且稳定。 0021 以本发明制得的醇式小檗碱为活性成份，可以。

14、制成各种类型的药物组合物。所述药物组合物含有治疗有效量的醇式小檗碱、以及含有一种或多种药学上可接受的载体。 0022 本发明制得的醇式小檗碱和其药物组合物可用于制备治疗 2 型糖尿病、调节血糖和血脂的药物。 0023 上述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等；填充剂如淀粉、蔗糖等；黏合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮等；湿润剂如甘油等；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠等；表面活性剂如十六烷醇等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、镁和聚乙二醇等。另外，还可以在药物组合物中加入其它辅助剂如香味剂、。

15、甜味剂等。 0024 本发明制得的醇式小檗碱通常以药物组合物的形式通过口服、鼻吸入或直肠给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂等。用于鼻吸入或直肠给药时，可将其制成溶液或水或油性悬浮剂等。优选的形式是片剂、包衣片剂、胶囊剂，最好的形式是针对肠道特定部位释放的制剂。 0025 本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域常规的生产方法制备。例如使活性成份与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。 0026 优选的本发明药物组合物含有重量比为 0.1 99.5的活性成份，最优选的本发明药物组合物。

16、含有重量比为 0.5 95的活性成份。 0027 本发明药物组合物的施用量可根据用药途径、患者年龄、体重、以及患者病情的严重程度等变化，其日用剂量按活性成份计算可以是0.2mg16mg/Kg体重，最优选的日用剂量是 2mg 6mg/Kg 体重，可以一次或多次施用。 0028 本发明依照前体药物的设计原理，以小檗碱 (BBR) 为母体进行化学修饰合成，从而制出性能更加优良的醇式小檗碱 (BBR-H)，为开发新的治疗糖尿病的药物组合物大下了基础。本发明以科学实验为依据来筛选小檗碱衍生物，其比国际上大海捞针式的从数十万种化合物中筛选先导化合物的方法具有明显优势。再者，。

17、小檗碱是价廉物美的治疗 2 型糖尿病药物，其作用机理的明确有助于肯定作为其前体物的小檗碱衍生物在临床上运用的合理性，从而充分发挥其社会效益和经济效益。附图说明 0029 图 1 为盐酸小檗碱 + 空白血清样品高效液相色谱仪紫外吸收图谱； 0030 图 2 为盐酸小檗碱 + 醇式小檗碱 + 空白血清样品高效液相色谱仪紫外吸收图谱； 0031 图 3 为灌服盐酸小檗碱 + 醇式小檗碱 30min 后大鼠血清样品高效液相色谱仪紫外吸收图谱； 0032 图 4 为灌服盐酸小檗碱 + 醇式小檗碱 60min 后大鼠血清样品高效液相色谱仪紫外吸收图谱。说明书 CN 1011576。

18、93 B4/11 页 6 具体实施方式 0033 以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。 0034 实施例 1 ：醇式小檗碱的制备 0035 将 5g 硫酸氢小檗碱粉末溶于蒸馏水中，配制成约 120ml 的饱和溶液；滴加浓度为 20的氢氧化钠溶液，直至再无沉淀产生为止；过滤所形成的浑浊液，获得沉淀物；将此沉淀物溶解于有机溶剂乙醚中，过滤此溶解液，所得滤液滴加在 20g 硅胶 G 中，常温挥发干乙醚，干法上入硅胶 G 柱 ( 硅胶 G500g)，用乙醚洗脱；洗脱液。

19、减压浓缩，在真空度低于 150mbar、温度低于 60的条件下进行真空低温干燥，得到粗产物 2.21g ；再将此粗产物用甲醇或乙醇重结晶，干燥为黄色粉末，即可得到醇式小檗碱纯品 1.78g。 0036 实施例 2 ：以醇式小檗碱为活性成份的片剂的制备 0037 按实施例 1 所制备的醇式小檗碱 10mg、乳糖 187mg、玉米淀粉 50mg、硬脂酸镁 3mg 的比例称取原料，先将醇式小檗碱、乳糖和玉米淀粉混合均匀，并用浓度为 70的乙醇湿润，然后把湿润后的混合物过筛、制粒、干燥，再过筛、加入硬脂酸镁，最后将混合物压片，每片重 250mg，活性成份。

20、含量为 10mg。 0038 试验例 1 ： 0039 实施例 1 所制备的醇式小檗碱在动物试验中表现出良好的治疗 2 型糖尿病、调节血糖和血脂的作用。具体试验过程如下： 0040 采用清洁级 Wistar 雄性大鼠，体重 20010g，单笼喂养，在清洁级大鼠实验室中进行实验，控制温度为 20 22。实验室严格遵守无菌操作规范，常规消毒空气、水和饲料。禁食 12h 后，大鼠尾静脉注射 STZ 液， STZ 液用 0.1M 柠檬酸 - 柠檬酸钠缓冲溶液配制，过滤除菌，注射量为 30mgkg-1。以普通饲料喂养 2 周后，禁食 12 15h，用 40葡萄糖按2.。

21、2g kg-1灌胃，于0min、 30min、 60min、 120min尾静脉取血约0.5ml，分离血清测血糖，以此筛选葡萄糖耐量异常的大鼠作为实验用大鼠，随机分为模型组、阿司匹林组、现有小檗碱组 ( 用 BBR 组表示 )、以及实施例 1 的醇式小檗碱低、中、高剂量组 ( 分别用 BBR-H.L 组、 BBR-H.M 组和 BBR-H.H 组表示 )。其中： BBR 组用药剂量为 185mgkg-1d-1， BBR-H.L 组用药剂量为 18.5mgkg-1d-1， BBR-H.M 组用药剂量为 37.0mgkg-1d-1， BBR-H.H 组用药剂量为 74.0。

22、mgkg-1d-1，阿司匹林组用药剂量为 120mgkg-1d-1，模型组用同体积的辅助液。 0041 除正常组外，其余组用蔗糖猪油奶粉鸡蛋普通饲料 30 20 4 2 63 的高脂高热量饲料喂养 8 周，在治疗 4 周后作 OGTT 试验，检测血糖，计算糖耐量；于治疗 8 周后，从腹主动脉取血，检测胰岛素 (IN) 含量、游离脂肪酸 (FFA) 含量和甘油三酯 (TG)。试验结果体现在以下四个方面： 0042 其一，实施例1所制备的醇式小檗碱改善了2型糖尿病大鼠口服葡萄糖的耐量。如下表 1 所示： 0043 表 1 ：。

23、BBR-H.L 组、 BBR-H.M 组和 BBR-H.H 组的糖耐量结果 (mmol/L) 0044 说明书 CN 101157693 B5/11 页 7 正常组模型组阿司匹林组BBR 组 BBR-H.L 组 BBR-H.M 组 BBR-H.H 组 0min 3.430.17 5.411.41 4.870.493.650.11 3.780.24 4.000.24 4.150.34 30min 5.910.22 11.352.03# 9.611.28*8.790.33* 10.931.90 6.480.29 7.000.28 60min 6.640.25 14.773.22# 11.1。

24、21.63*9.850.46 13.083.12 8.620.18 8.450.49 120min 5.720.24 12.812.87# 9.401.25 9.270.57 10.932.60 8.210.45 8.480.40 0045 # 与正常组比较 P 0.01 ；与模型组比较 P 0.01 ； * 与模型组比较 P 0.05。 0046 根据表 1 的糖耐量试验结果可知： BBR-H.M 组 (37.0mgkg-1d-1) 和 BBR-H.H 说明书 CN 101157693 B6/11 页 8 组 (74.0mgkg-1d-1) 都能改善 2 型糖尿病大鼠口服葡萄糖耐量，。

25、其效果与阿司匹林组 (120mgkg-1d-1) 和 BBR 组 (185mgkg-1d-1) 相当。 0047 其二，实施例 1 所制备的醇式小檗碱可促进 2 型糖尿病大鼠胰岛素的分泌。如下表 2 所示： 0048 表 2 ： BBR-H.L 组、 BBR-H.M 组和 BBR-H.H 组的胰岛素含量 (uIU/mol) 0049 说明书 CN 101157693 B7/11 页 9 正常组模型组阿司匹林组BBR 组BBR-H.L 组 BBR-H.M 组 BBR-H.H 组 33.312.81 23.454.99#35.5313.01 27.886.11*25.175.61 2。

26、4.086.15 32.217.90 0050 # 与正常组比较 P 0.01 ；与模型组比较 P 0.01 ； * 与模型组比较 P 0.05。 0051 从表 2 的胰岛素含量分析可知： BBR-H.H 组 (74.0mgkg-1d-1) 具有促进 2 型糖尿病大鼠胰岛素分泌的功效，其效果与阿司匹林组 (120mgkg-1d-1) 相当。 0052 其三，实施例 1 所制备的醇式小檗碱可显著降低 2 型糖尿病大鼠胰岛素抵抗相关说明书 CN 101157693 B8/11 页 10 因子游离脂肪酸 FFA 的水平。如下表 3 所示： 0053 表 3 ： BBR-H.L 组。

27、、 BBR-H.M 组和 BBR-H.H 组的游离脂肪酸含量 (mmol/L) 0054 说明书 CN 101157693 B9/11 页 11 正常组模型组阿司匹林组 BBR 组 BBR-H.L 组 BBR-H.M 组 BBR-H.H 组 1.560.09 19.020.76#12.000.974 11.861.10 14.260.52* 6.320.74 2.230.19 0055 # 与正常组比较 P 0.01 ；与模型组比较 P 0.01 ； * 与模型组比较 P 0.05。 0056 表 3 的游离脂肪酸含量表明： BBR-H.L 组 (18.5mgkg-。

28、1d-1)、 BBR-H.M 组说明书 CN 101157693 B10/11 页 12 (37.0mgkg-1d-1) 和 BBR-H.H 组 (74.0mgkg-1d-1) 都能显著降低 2 型糖尿病大鼠游离脂肪酸的水平，其效果与阿司匹林组 (120mgkg-1d-1) 和 BBR 组 (185mgkg-1d-1) 相当。 0057 其四，实施例1所制备的醇式小檗碱可显著降低2型糖尿病大鼠的甘油三酯水平。如下表 4 所示： 0058 表 4 ： BBR-H.L 组、 BBR-H.M 组和 BBR-H.H 组的甘油三酯含量 (mmol/L) 0059 正常组模型组阿司匹林。

29、组 BBR 组 BBR-H.L 组 BBR-H.M 组 BBR-H.H 组 0.6060.074 1.7710.308# 0.8030.171 0.450.258 0.7780.319 0.9080.385* 0.4520.159 0060 # 与正常组比较 P 0.01 ；与模型组比较 P 0.01 ； * 与模型组比较 P 0.05。 0061 从表 4 的甘油三酯含量结果可知： BBR-H.L 组 (18.5mgkg-1d-1)、 BBR-H.M 组 (37.0mgkg-1d-1) 和 BBR-H.H 组 (74.0mgkg-1d-1) 都能显著降低 2 型糖尿病大鼠甘油三酯的含量。

30、水平，其效果与阿司匹林组 (120mgkg-1d-1) 和 BBR 组 (185mgkg-1d-1) 相当。 0062 试验例 2 0063 实施例 1 所制备的醇式小檗碱在动物体内的药代动力学情况分析。具体试验过程如下： 0064 药品选用现有的盐酸小檗碱和实施例1所制备的醇式小檗碱。采用清洁级Wistar 大鼠12只，雌雄各半，体重20020克，单笼喂养，在清洁级大鼠实验室中进行实验，控制温度为 20 22。实验室严格遵守无菌操作规范，常规消毒空气、水和饲料。禁食 12h 后，按体重分为两组：第一组为盐酸小檗碱组；第二组为盐酸小檗碱 + 醇式小檗碱组，。

31、每组 6 只。盐酸小檗碱组分别一次灌服盐酸小檗碱 124mgkg-1d-1；盐酸小檗碱 + 醇式小檗碱组分别一次灌服盐酸小檗碱和醇式小檗碱共 186mgkg-1d-1( 盐酸小檗碱醇式小檗碱 124 62)。分别于 30min、 60min、 120min 尾静脉采血 0.8ml，分离血清。 0065 精密量取0.25ml血清，加入0.25ml、 0.2mol/L的氢氧化钠溶液，摇匀，分别依次加入无水乙醚3ml、 3ml、 2ml，离心涡旋1分钟，吸取无水乙醚层，于40水浴蒸干，加入流动相再涡旋 1 分钟使其完全溶解，制得样品。按上述方法同时制备空白血清样品、空白血。

32、清样品 + 盐酸小檗碱样品 + 醇式小檗碱样品。采用 Waters600ec 高效液相色谱仪分离、定量。高效液相色谱仪的色谱条件为：色谱柱为 (4.00mm25cm)，流动相为乙氰 - 水 - 十二烷基硫酸钠 - 磷酸二氢钾 (500ml-500ml-1.70g-3.40g)，用盐酸调 pH 值至 5.4，流动相经超声脱气后使用，流速为 1ml/min，柱温为 40，紫外检测波长 346nm，检测结果见图 1 至图 4。 0066 由图 1 至图 4 所示的图谱分析可知：盐酸小檗碱的保留时间为 11.08min，醇式小檗碱的保留时间为7.65min。大鼠灌服。

33、盐酸小檗碱+醇式小檗碱30min、 60min时，血清样品的高效液相色谱仪紫外吸收图谱显示醇式小檗碱的吸收峰下面积逐渐减小， 120min 时其吸收峰几无，而盐酸小檗碱的吸收峰下面积却有增加。具体数据如下表 5 所示： 0067 表 5 ：灌服盐酸小檗碱 + 醇式小檗碱的大鼠血清样品中盐酸小檗碱、醇式小檗碱的紫外吸收峰下面积 ( 微伏 * 秒 ) 0068 说明书 CN 101157693 B11/11 页 13 30min 60min 120min 盐酸小檗碱 38286 39541 21537 盐酸小檗碱 + 醇式小檗碱 28957 35480 80771 2970 41772 4417 0069 由表 5 可见：大鼠所灌服药物组成的初始比例为盐酸小檗碱醇式小檗碱 21，而在30min后大鼠体内药物浓度之比是盐酸小檗碱醇式小檗碱约为0.450.55，在60min后盐酸小檗碱醇式小檗碱约为0.960.04，提示本发明制得的小檗碱衍生物为已有小檗碱的前体药物，在体内可能转化为小檗碱而发挥其药理作用。说明书 CN 101157693 B1/2 页 14 说明书附图 CN 101157693 B2/2 页 15 说明书附图。

摘要
申请专利号：	CN200710186429.4	申请日：	20060629
公开号：	CN101157693B	公开日：	20110831
当前法律状态：		有效性：	失效
法律详情：
IPC分类号：	C07D455/03	主分类号：	C07D455/03
申请人：	华中科技大学同济医学院附属同济医院
发明人：	徐丽君,陆付耳,魏世超
地址：	430030 湖北省武汉市汉口解放大道1095号(同济医院科研处)
优先权：	CN200710186429A
专利代理机构：	武汉开元知识产权代理有限公司	代理人：	胡镇西
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内容摘要

一种小檗碱衍生物——醇式小檗碱的制备方法，包括以下步骤：将硫酸氢小檗碱原料溶于水中，制成硫酸氢小檗碱饱和溶液；在硫酸氢小檗碱饱和溶液中滴加碱溶液，直至再无沉淀物产生为止，形成浑浊液；对上述浑浊液进行过滤，获得沉淀物；将所得沉淀物溶于有机溶剂中，通过硅胶柱层析，用有机溶剂洗脱；对上述有机溶剂洗脱液减压浓缩，真空低温干燥，获得粗产物；将所得粗产物用甲醇或乙醇重结晶，即可得到足够量的小檗碱衍生物纯品。动物实验发现，所制得的小檗碱衍生物具有多种药物活性，显示出优异的调节2型糖尿病大鼠血糖和血脂的作用，比目前公认具有调节血糖和血脂作用的、结构最相关的化合物盐酸小檗碱的效果要好得多，且有效剂量要小很多。

权利要求书

1.一种醇式小檗碱的制备方法，包括以下步骤：1)将硫酸氢小檗碱原料溶于水中，制成硫酸氢小檗碱饱和溶液；2)在硫酸氢小檗碱饱和溶液中滴加碱溶液，直至再无沉淀物产生为止，形成浑浊液；3)对上述浑浊液进行过滤，获得沉淀物；4)将所得沉淀物溶于有机溶剂中，通过硅胶柱层析，用有机溶剂洗脱；5)对上述有机溶剂洗脱液减压浓缩，在真空度低于150mbar、温度低于60℃的条件下真空低温干燥，获得粗产物；6)将所得粗产物用甲醇或乙醇重结晶，即可得到醇式小檗碱纯品，它是下列结构式所示的化合物： 2.根据权利要求1所述的醇式小檗碱的制备方法，其特征在于：所说的步骤2)中的碱溶液为氢氧化钠溶液。 3.根据权利要求1所述的醇式小檗碱的制备方法，其特征在于：所说的步骤4)中的有机溶剂为甲醇、乙醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮中的一种或一种以上的任意组合。

说明书

本发明系申请日为2006年6月29日、申请号为200610019492.4、发明名称为《小檗碱衍生物及其制备方法和其药物组合物与用途》的分案申请。

技术领域

本发明涉及以小檗碱(BBR)为母体进行化学修饰合成的方法，具体地指一种小檗碱衍生物的制备方法。

背景技术

目前，糖尿病已经成为世界性的流行病，据统计资料显示：国内2型糖尿病患病率1976年为1.0％，1989年为2.0％，1996年为3.2％，2001年上海和广州则超过了9％，已经高于欧美发达国家的平均水平。糖尿病已经成为人类的“第三大杀手”，与之相关的医疗护理费用开支极为庞大，即使是经济发达的国家也不堪重负。

小檗碱(BBR)亦称黄连素，它是从中药黄连、黄檗等原料中提出的一种抗菌性生物碱，其盐酸盐为黄色粉末，味苦，微溶于水。其在试管中能痢疾杆菌、结核杆菌和葡萄球菌等，效价较一般抗菌素低，其口服后吸收很差，对细菌性痢疾和某些肠道感染有效。其注射后对循环和呼吸有一定的抑制作用。其外用可治疗化脓性感染和眼结膜炎等。

科研人员对小檗碱(BBR)治疗和预防糖尿病的课题已进行了近十年的研究，大量的实验数据表明：小檗碱可治疗2型糖尿病，其最主要的作用就是调节患者的血糖和血脂。调节血糖包括促进胰岛素分泌，改善胰岛素抵抗(主要是调节胰岛素抵抗相关因子游离脂肪酸FFA的量)；调节血脂主要在于降低甘油三酯的量，且疗效确切。然而在实际应用中，不仅小檗碱的动物试验服用剂量较高，其有效剂量高达185mg·Kg-1·d-1，而且小檗碱的临床口服剂量亦较高，有的高达3g·d-1，且1～3个月为一疗程。高剂量长周期地使用，无疑会破坏患者肠道中的菌丛平衡，增加小檗碱的副作用。而另一方面，小檗碱的离体试验结果显示其有效浓度需求却很低，1～10μmol·L-1的小檗碱呈剂量依耐性地促进HIT-T15细胞分泌胰岛素，0.1～100μmol·L-1的小檗碱可显著增加脂肪细胞的葡萄糖消耗和转运，5～100μmol·L-1的小檗碱可使HepG2细胞的葡萄糖消耗量增加33％～60％，疗效与1mmol·L-1的二甲双胍相当，由此可见低剂量小檗碱离体试验卓越的降糖效果。体内及离体剂量巨大的反差，提示小檗碱功效卓越但口服吸收极差。研究人员曾经以增强小檗碱肠胃吸收为目的，进行过许多药剂学上的实验探索，但实际应用于动物口服给药时，发现效果并不理想，这可能是动物体内的胃酸、酶系统或其他因素影响所致。对大鼠肠灌流实验也表明，灌肠2.5小时后仅有约5％的小檗碱从大鼠肠道消失，这提示在2.5小时以内，高达95％的小檗碱未被吸收利用。如何解决小檗碱的吸收问题，大幅度降低其服用剂量，充分发挥其治疗2型糖尿病的功效是科研人员急需攻克的难题。

在2004年出版的《JOURNAL OF MOLECULAR STRUCTURE》(分子结构杂志)第687卷第135～142页中公开了一种小檗碱衍生物，我们称它为醇式小檗碱(BBR-H)，具体见第136页图1中的第二幅，其化学结构式如下：

文中介绍了该小檗碱衍生物的制备方法，该方法是将100mg硫化小檗碱(1a，X＝HSO4)溶于20ml水中，以乙醚作为该水溶液的保护层，加入氢氧化钠，轻轻摇动混合液，然后放在周围的温度下让其蒸发，2天之后，可以收集到一些亮黄色的晶体2a，即醇式小檗碱(BBR-H)。但通过该方法获取的小檗碱衍生物的量极少，不足以支持大规模的药物学实验和应用。文中也对该小檗碱衍生物进行了一些性能方面的研究实验，但其结论是发现该小檗碱衍生物几乎没有生物活性。

发明内容

本发明的目的就是要重新提供一种小檗碱衍生物的制备方法，以克服现有技术中获取醇式小檗碱(BBR-H)量极少的不足。

本发明以硫酸氢小檗碱为原料，通过对现有小檗碱(BBR)的结构进行修饰，来合成上述醇式小檗碱(BBR-H)，其制备方法包括以下步骤：

1)将硫酸氢小檗碱原料溶于水中，制成硫酸氢小檗碱饱和溶液；

2)在硫酸氢小檗碱饱和溶液中滴加碱溶液，直至再无沉淀物产生为止，形成浑浊液；

3)对上述浑浊液进行过滤，获得沉淀物；

4)将所得沉淀物溶于有机溶剂中，通过硅胶柱层析，用有机溶剂洗脱；

5)对上述有机溶剂洗脱液减压浓缩，真空低温干燥，获得粗产物；

6)将所得粗产物用甲醇或乙醇重结晶，即可得到小檗碱衍生物纯品。经检测可知，其分子量为353、分子式为C20H19NO5、其化学结构式如下所示：

对上述制得的醇式小檗碱(BBR-H)进行药理学方面的实验发现，其具有多种有价值的药物活性，特别是其容易吸收的性能是现有小檗碱(BBR)所不具备的。具体地说：

本发明制得的醇式小檗碱在动物试验中显示出了优异的调节2型糖尿病大鼠血糖和血脂的作用，它比目前公认具有调节2型糖尿病大鼠血糖和血脂作用的、结构最相关的化合物盐酸小檗碱的效果要好得多，且有效剂量要小很多。

本发明制得的醇式小檗碱在治疗2型糖尿病上的作用，主要体现在调节血糖和血脂方面。调节血糖包括改善口服葡萄糖耐量、促进胰岛素分泌、改善胰岛素抵抗(主要是调节胰岛素抵抗相关因子游离脂肪酸FFA的量)，调节血脂主要在于降低甘油三酯的量。其口服治疗2型糖尿病大鼠的疗效突出且稳定。

以本发明制得的醇式小檗碱为活性成份，可以制成各种类型的药物组合物。所述药物组合物含有治疗有效量的醇式小檗碱、以及含有一种或多种药学上可接受的载体。

本发明制得的醇式小檗碱和其药物组合物可用于制备治疗2型糖尿病、调节血糖和血脂的药物。

上述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等；填充剂如淀粉、蔗糖等；黏合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮等；湿润剂如甘油等；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠等；表面活性剂如十六烷醇等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、镁和聚乙二醇等。另外，还可以在药物组合物中加入其它辅助剂如香味剂、甜味剂等。

本发明制得的醇式小檗碱通常以药物组合物的形式通过口服、鼻吸入或直肠给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂等。用于鼻吸入或直肠给药时，可将其制成溶液或水或油性悬浮剂等。优选的形式是片剂、包衣片剂、胶囊剂，最好的形式是针对肠道特定部位释放的制剂。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域常规的生产方法制备。例如使活性成份与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

优选的本发明药物组合物含有重量比为0.1％～99.5％的活性成份，最优选的本发明药物组合物含有重量比为0.5％～95％的活性成份。

本发明药物组合物的施用量可根据用药途径、患者年龄、体重、以及患者病情的严重程度等变化，其日用剂量按活性成份计算可以是0.2mg～16mg/Kg体重，最优选的日用剂量是2mg～6mg/Kg体重，可以一次或多次施用。

本发明依照前体药物的设计原理，以小檗碱(BBR)为母体进行化学修饰合成，从而制出性能更加优良的醇式小檗碱(BBR-H)，为开发新的治疗糖尿病的药物组合物大下了基础。本发明以科学实验为依据来筛选小檗碱衍生物，其比国际上大海捞针式的从数十万种化合物中筛选先导化合物的方法具有明显优势。再者，小檗碱是价廉物美的治疗2型糖尿病药物，其作用机理的明确有助于肯定作为其前体物的小檗碱衍生物在临床上运用的合理性，从而充分发挥其社会效益和经济效益。

附图说明

图1为盐酸小檗碱+空白血清样品高效液相色谱仪紫外吸收图谱；

图2为盐酸小檗碱+醇式小檗碱+空白血清样品高效液相色谱仪紫外吸收图谱；

图3为灌服盐酸小檗碱+醇式小檗碱30min后大鼠血清样品高效液相色谱仪紫外吸收图谱；

图4为灌服盐酸小檗碱+醇式小檗碱60min后大鼠血清样品高效液相色谱仪紫外吸收图谱。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：醇式小檗碱的制备

将5g硫酸氢小檗碱粉末溶于蒸馏水中，配制成约120ml的饱和溶液；滴加浓度为20％的氢氧化钠溶液，直至再无沉淀产生为止；过滤所形成的浑浊液，获得沉淀物；将此沉淀物溶解于有机溶剂乙醚中，过滤此溶解液，所得滤液滴加在20g硅胶G中，常温挥发干乙醚，干法上入硅胶G柱(硅胶G500g)，用乙醚洗脱；洗脱液减压浓缩，在真空度低于150mbar、温度低于60℃的条件下进行真空低温干燥，得到粗产物2.21g；再将此粗产物用甲醇或乙醇重结晶，干燥为黄色粉末，即可得到醇式小檗碱纯品1.78g。

实施例2：以醇式小檗碱为活性成份的片剂的制备

按实施例1所制备的醇式小檗碱10mg、乳糖187mg、玉米淀粉50mg、硬脂酸镁3mg的比例称取原料，先将醇式小檗碱、乳糖和玉米淀粉混合均匀，并用浓度为70％的乙醇湿润，然后把湿润后的混合物过筛、制粒、干燥，再过筛、加入硬脂酸镁，最后将混合物压片，每片重250mg，活性成份含量为10mg。

试验例1：

实施例1所制备的醇式小檗碱在动物试验中表现出良好的治疗2型糖尿病、调节血糖和血脂的作用。具体试验过程如下：

采用清洁级Wistar雄性大鼠，体重200±10g，单笼喂养，在清洁级大鼠实验室中进行实验，控制温度为20～22℃。实验室严格遵守无菌操作规范，常规消毒空气、水和饲料。禁食12h后，大鼠尾静脉注射STZ液，STZ液用0.1M柠檬酸--柠檬酸钠缓冲溶液配制，过滤除菌，注射量为30mg·kg-1。以普通饲料喂养2周后，禁食12～15h，用40％葡萄糖按2.2g·kg-1灌胃，于0min、30min、60min、120min尾静脉取血约0.5ml，分离血清测血糖，以此筛选葡萄糖耐量异常的大鼠作为实验用大鼠，随机分为模型组、阿司匹林组、现有小檗碱组(用BBR组表示)、以及实施例1的醇式小檗碱低、中、高剂量组(分别用BBR-H.L组、BBR-H.M组和BBR-H.H组表示)。其中：BBR组用药剂量为185mg·kg-1·d-1，BBR-H.L组用药剂量为18.5mg·kg-1·d-1，BBR-H.M组用药剂量为37.0mg·kg-1·d-1，BBR-H.H组用药剂量为74.0mg·kg-1·d-1，阿司匹林组用药剂量为120mg·kg-1·d-1，模型组用同体积的辅助液。

除正常组外，其余组用蔗糖∶猪油∶奶粉∶鸡蛋∶普通饲料＝30∶20∶4∶2∶63的高脂高热量饲料喂养8周，在治疗4周后作OGTT试验，检测血糖，计算糖耐量；于治疗8周后，从腹主动脉取血，检测胰岛素(IN)含量、游离脂肪酸(FFA)含量和甘油三酯(TG)。试验结果体现在以下四个方面：

其一，实施例1所制备的醇式小檗碱改善了2型糖尿病大鼠口服葡萄糖的耐量。如下表1所示：

表1：BBR-H.L组、BBR-H.M组和BBR-H.H组的糖耐量结果(mmol/L)

正常组模型组阿司匹林组BBR组 BBR-H.L组 BBR-H.M组 BBR-H.H组 0min 3.43±0.17 5.41±1.41 4.87±0.493.65±0.11 3.78±0.24 4.00±0.24 4.15±0.34 30min 5.91±0.22 11.35±2.03# 9.61±1.28*8.79±0.33* 10.93±1.90 6.48±0.29▲ 7.00±0.28▲ 60min 6.64±0.25 14.77±3.22# 11.12±1.63*9.85±0.46▲ 13.08±3.12 8.62±0.18▲ 8.45±0.49▲ 120min 5.72±0.24 12.81±2.87# 9.40±1.25▲9.27±0.57▲ 10.93±2.60 8.21±0.45▲ 8.48±0.40▲

#与正常组比较P＜0.01；▲与模型组比较P＜0.01；*与模型组比较P＜0.05。

根据表1的糖耐量试验结果可知：BBR-H.M组(37.0mg·kg-1·d-1)和BBR-H.H组(74.0mg·kg-1·d-1)都能改善2型糖尿病大鼠口服葡萄糖耐量，其效果与阿司匹林组(120mg·kg-1·d-1)和BBR组(185mg·kg-1·d-1)相当。

其二，实施例1所制备的醇式小檗碱可促进2型糖尿病大鼠胰岛素的分泌。如下表2所示：

表2：BBR-H.L组、BBR-H.M组和BBR-H.H组的胰岛素含量(uIU/mol)

正常组模型组阿司匹林组BBR组BBR-H.L组 BBR-H.M组 BBR-H.H组33.3±12.81 23.45±4.99#35.53±13.01▲27.88±6.11*25.17±5.61 24.08±6.15 32.21±7.90▲

#与正常组比较P＜0.01；▲与模型组比较P＜0.01；*与模型组比较P＜0.05。

从表2的胰岛素含量分析可知：BBR-H.H组(74.0mg·kg-1·d-1)具有促进2型糖尿病大鼠胰岛素分泌的功效，其效果与阿司匹林组(120mg·kg-1·d-1)相当。

其三，实施例1所制备的醇式小檗碱可显著降低2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗相关因子游离脂肪酸FFA的水平。如下表3所示：

表3：BBR-H.L组、BBR-H.M组和BBR-H.H组的游离脂肪酸含量(mmol/L)

正常组模型组阿司匹林组 BBR组 BBR-H.L组 BBR-H.M组 BBR-H.H组1.56±0.09 19.02±0.76#12.00±0.974▲ 11.86±1.10▲ 14.26±0.52* 6.32±0.74▲ 2.23±0.19▲

#与正常组比较P＜0.01；▲与模型组比较P＜0.01；*与模型组比较P＜0.05。

表3的游离脂肪酸含量表明：BBR-H.L组(18.5mg·kg-1·d-1)、BBR-H.M组(37.0mg·kg-1·d-1)和BBR-H.H组(74.0mg·kg-1·d-1)都能显著降低2型糖尿病大鼠游离脂肪酸的水平，其效果与阿司匹林组(120mg·kg-1·d-1)和BBR组(185mg·kg-1·d-1)相当。

其四，实施例1所制备的醇式小檗碱可显著降低2型糖尿病大鼠的甘油三酯水平。如下表4所示：

表4：BBR-H.L组、BBR-H.M组和BBR-H.H组的甘油三酯含量(mmol/L)

正常组模型组阿司匹林组 BBR组 BBR-H.L组 BBR-H.M组 BBR-H.H组0.606±0.074 1.771±0.308# 0.803±0.171▲ 0.45±0.258▲ 0.778±0.319▲ 0.908±0.385* 0.452±0.159▲

#与正常组比较P＜0.01；▲与模型组比较P＜0.01；*与模型组比较P＜0.05。

从表4的甘油三酯含量结果可知：BBR-H.L组(18.5mg·kg-1·d-1)、BBR-H.M组(37.0mg·kg-1·d-1)和BBR-H.H组(74.0mg·kg-1·d-1)都能显著降低2型糖尿病大鼠甘油三酯的含量水平，其效果与阿司匹林组(120mg·kg-1·d-1)和BBR组(185mg·kg-1·d-1)相当。

试验例2

实施例1所制备的醇式小檗碱在动物体内的药代动力学情况分析。具体试验过程如下：

药品选用现有的盐酸小檗碱和实施例1所制备的醇式小檗碱。采用清洁级Wistar大鼠12只，雌雄各半，体重200±20克，单笼喂养，在清洁级大鼠实验室中进行实验，控制温度为20～22℃。实验室严格遵守无菌操作规范，常规消毒空气、水和饲料。禁食12h后，按体重分为两组：第一组为盐酸小檗碱组；第二组为盐酸小檗碱+醇式小檗碱组，每组6只。盐酸小檗碱组分别一次灌服盐酸小檗碱124mg·kg-1·d-1；盐酸小檗碱+醇式小檗碱组分别一次灌服盐酸小檗碱和醇式小檗碱共186mg·kg-1·d-1(盐酸小檗碱∶醇式小檗碱＝124∶62)。分别于30min、60min、120min尾静脉采血0.8ml，分离血清。

精密量取0.25ml血清，加入0.25ml、0.2mol/L的氢氧化钠溶液，摇匀，分别依次加入无水乙醚3ml、3ml、2ml，离心涡旋1分钟，吸取无水乙醚层，于40℃水浴蒸干，加入流动相再涡旋1分钟使其完全溶解，制得样品。按上述方法同时制备空白血清样品、空白血清样品+盐酸小檗碱样品+醇式小檗碱样品。采用Waters600ec高效液相色谱仪分离、定量。高效液相色谱仪的色谱条件为：色谱柱为(4.00mm×25cm)，流动相为乙氰-水-十二烷基硫酸钠-磷酸二氢钾(500ml-500ml-1.70g-3.40g)，用盐酸调pH值至5.4，流动相经超声脱气后使用，流速为1ml/min，柱温为40℃，紫外检测波长346nm，检测结果见图1至图4。

由图1至图4所示的图谱分析可知：盐酸小檗碱的保留时间为11.08min，醇式小檗碱的保留时间为7.65min。大鼠灌服盐酸小檗碱+醇式小檗碱30min、60min时，血清样品的高效液相色谱仪紫外吸收图谱显示醇式小檗碱的吸收峰下面积逐渐减小，120min时其吸收峰几无，而盐酸小檗碱的吸收峰下面积却有增加。具体数据如下表5所示：

表5：灌服盐酸小檗碱+醇式小檗碱的大鼠血清样品中盐酸小檗碱、醇式小檗碱的紫外吸收峰下面积(微伏*秒)

30min 60min 120min 盐酸小檗碱 38286 39541 21537 盐酸小檗碱+ 醇式小檗碱 28957 35480 80771 2970 41772 4417

由表5可见：大鼠所灌服药物组成的初始比例为盐酸小檗碱∶醇式小檗碱＝2∶1，而在30min后大鼠体内药物浓度之比是盐酸小檗碱∶醇式小檗碱约为0.45∶0.55，在60min后盐酸小檗碱∶醇式小檗碱约为0.96∶0.04，提示本发明制得的小檗碱衍生物为已有小檗碱的前体药物，在体内可能转化为小檗碱而发挥其药理作用。