技术领域
本发明涉及生物技术，尤其涉及一种可同时检测包括单核细胞增多性李斯特菌（以下简称“单增李斯特菌”）、蜡样芽孢杆菌、阪崎克罗诺杆菌、金黄色葡萄球菌4种食源性致病菌的含扩增内标的多重体系的试剂盒，可以在一个反应管中同时对单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、阪崎克罗诺杆菌、金黄色葡萄球菌的样品进行鉴别检测。
背景技术
食源性疾病（foodborne disease）涵盖范围非常广泛，在全世界范围无论发达国家还是发展中国家都是严重的公共卫生问题。监测数据显示，2011年，中国每6.5人中就有一人曾经发生过食源性疾病 。食源性疾病的全球发病率难以估计，但据报告，仅2005年就有180万人死于腹泻病。这些病例的大部分可归因于食品和饮用水污染，而食源性致病菌是是主要的根源。
2012年9月25日，卫生部公布了《食品中致病菌限量》征求意见稿，提出了沙门氏菌、大肠杆菌等主要致病菌在多类食品中的限量要求，同时宣布该标准将在正式发布后6个月施行。单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、阪崎克罗诺杆菌、金黄色葡萄球菌是几种最常见的食源性致病菌，它们能够直接或间接污染食品及水源，人经口感染可导致肠道传染病的发生及食物中毒以及畜禽传染病的流行。目前，对这几种常见的食源性致病菌的常用方法主要有传统生物学方法、胶体金试纸条检测、酶联免疫吸附（ELISA）等。传统生物学方法耗时比较长、检测步骤比较复杂，胶体金试纸条检测价格比较昂贵、检测灵敏度偏低，酶联免疫吸附法（ELISA）价格昂贵、操作需要一定技术，因此需要建立一种操作简单、快速、敏感、特异的检测方法，特别是对大量样品的高通量、快速、同时检测。多重PCR方法是一种操作简单、敏感性高、特异性强的分子生物学检测方法，除具有普通PCR的优点之外，还可以在一个反应体系中同时扩增两份或者多份DNA样本的不同目的基因片段，特别适合用于食源性致病菌多重体系的快速诊断。本发明在多重PCR方法的基础上又增加了一对扩增内标引物，可以有效排除因为样品处理过程中存在对DNA聚合酶活性具有抑制作用的物质或操作失误等原因而导致的结果呈现假阴性，可以提高检测结果的准确性。
发明内容
本发明的目的是提供一种可同时检测单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、阪崎克罗诺杆菌、金黄色葡萄球菌4种食源性致病菌的含扩增内标的多重体系的试剂盒，其优点是操作简单、敏感性高、特异性强，适合高通量的快速检测，能够避免因为样品处理过程中存在DNA聚合酶的抑制因子得到假阴性结果而导致的误判。
本发明的技术解决方案是：
一种同时检测单核细胞增多性李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、阪崎克罗诺杆菌、金黄色葡萄球菌4种常见食源性致病菌的试剂盒，其特殊之处在于：
该试剂盒包含：无菌去离子水、PCR反应预混液、对照品和DNA染料；
所述PCR反应预混液含有PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、Taq DNA聚合酶，检测用引物；
所述PCR反应缓冲液中含Mg2+的浓度为0.8 mM，脱氧核糖核苷三磷酸的浓度为0.12 mM，Taq DNA聚合酶的浓度为0.03 U/μl；
所述检测用引物为如下10条引物的混合物，其序列和产物片段长度分别为：
扩增内标27F序列：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R序列：TACGGYTACCTTTGTTACGACTT，扩增产物片段长度约1500 bp（见序列表11、12、13、14和15）；
单增李斯特菌inlAF序列：ATGCTAAGTTTCATGTGGACGGCAAAG，inlAR序列：TCGCTATCGCCAGTTGTAGGGAGTG，扩增产物片段长度为826 bp（见序列表16）；
蜡样芽孢杆菌hblAF序列：AAGAATCCTGATGTGAATTTTGAGG，hblAR序列：CCCTTGCTACTCCGACTATAATACC，扩增产物片段长度为544 bp（见序列表17）；
阪崎克罗诺杆菌grxBF序列：AGCGGGAAGAGGATGAAATCGGTGG ，grxBR序列：GGATATTGTGCGTTACGTGGATGGG，扩增产物片段长度为333 bp（见序列表18）；
金黄色葡萄球菌nucF序列GCGATTGATGGTGATACGGTT，nucR序列：AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC，扩增产物片段长度为279 bp（见序列表19）；
所述对照品分为阴性对照品和阳性对照品，阴性对照品模板为无菌去离子水，阳性对照品模板为各对引物相应的扩增产物连接至T载体后获得的质粒基因组混合物。
本发明的具体使用方法是：
（1）样品采集：无菌采集可疑乳及乳制品样品；
（2）增菌培养：将采集的可疑乳及乳制品样品混合均匀后无菌取样，液体乳及乳制品直接量取，固体奶制品放入无菌研钵、组织研磨器或均质袋内均质2～5 min，加入预热至45℃的无菌营养肉汤培养基，37±1℃振荡培养6～8 h，得到增菌液；
（3）DNA提取：取培养后的增菌液，振荡混匀，取1 ml于离心管中1000～1500 r/mim离心1～2 min，除去较大块的碎片，取上清8000～12000 r/mim离心1～2 min，倾去上清液，倒置于吸水纸上不同的位置，吸干残留液体，再用无菌去离子水重悬、洗涤沉淀，8000～12000 r/mim离心1～2 min，弃上清，用少量无菌去离子水重悬沉淀，沸水浴5～10 min，冰浴5～10 min，1000～5000 r/mim离心5～10 min，上清液即为样品模板DNA，调整浓度至约为10～30 ng/μl备用，或-20℃保存；
（4）PCR反应管制备：所有操作均需在冰上进行；先将PCR反应预混液置于冰上融化，吸取50 μl置于PCR反应管中，再加入1 μl样品模板DNA，用手指轻弹制备好的PCR反应管或用微量移液器吹打混匀，瞬时高速离心2 s；按照阴性对照品、实际检测样品、阳性对照品的顺序分别制备PCR反应管；
（5）扩增检测：将制备的阴性对照品、样品模板DNA和阳性对照品的PCR反应管置于PCR仪上，进行PCR扩增，反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性40 s，56.7℃退火40 s，72℃延伸70 s，进行35个循环；72℃延伸10 min，4 ℃保存；扩增得到PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，判定检测结果；
（6）检测结果判定：将1 g琼脂糖溶于100 ml的0.5×TBE电泳缓冲液中，然后加入5 μl DNA染料，混匀煮沸，倾倒凝胶板；凝胶冷却凝固后，用微量移液器吸取PCR产物5 μl加入凝胶孔中进行电泳；电泳结束后取出凝胶置于紫外灯下观察、拍照，判定结果：（a）阳性对照的凝胶孔有5条电泳条带而阴性对照的凝胶孔无任何条带，则PCR反应检测成功；（b）若阴性对照有条带，说明PCR反应管制备过程中有交叉污染，结果不可靠，建议重新进行PCR检测；（c）阳性对照有5条带，阴性对照没有条带，被检样品的凝胶孔只出现1条约1500 bp的电泳条带与阳性对照的凝胶孔相应位置的条带大小一致，则结果判断为阴性；（d）被检样品的凝胶孔出现两条以上电泳条带，且与阳性对照的凝胶孔中相应位置的条带大小一致，而阴性对照无条带，则判定为与相应条带大小对应的目的细菌呈阳性；单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、阪崎克罗诺杆菌和金黄色葡萄球菌4种细菌相对应的特异性条带大小分别为826 bp、544 bp、333 bp和279 bp；（e）阳性对照的凝胶孔有5条电泳条带，阴性对照的凝胶孔无任何条带，而被检样品的凝胶孔在1500 bp位置没有电泳条带，说明样品处理过程中存在酶抑制剂，建议换其他方法进行样品处理；（f）阳性对照没有条带，说明试剂盒失效，本次检测结果无效。
本发明的有益效果：检测用引物均是根据该细菌的特异性基因或特异片段而设计的特征性引物，组装成试剂盒后可以用于食品中目的细菌的快速检测、流行病学调查、药物疗效监测等方面。 与现有的检测方法相比，该方法使用方便、可靠性好、检测周期短、灵敏度高、特异性强、成本低廉、操作步骤简单，适用于高通量操作、标准化操作，而且可以检测因为样品处理过程中存在DNA聚合酶的抑制因子得到假阴性结果而导致的误判，对提高食品安全检测水平具有重要意义。
附图说明
图1：检测成功的PCR扩增产物电泳结果。阴性对照无条带，而阳性对照在约1500 bp、826 bp、544 bp、333 bp和279 bp处分别有5条电泳条带，说明检测成功。检样1只在约1500 bp处有1条扩增内标条带，与阳性对照相应位置条带大小一致，在其他位置无条带，说明检样1中单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、阪崎克罗诺杆菌、金黄色葡萄球菌4种细菌均为阴性；第2泳道在1500 bp和826 bp处有2个条带与阳性对照位置一致，说明检样1单增李斯特菌呈阳性；第3泳道在1500 bp和544 bp处有2个条带与阳性对照位置一致，说明检样3蜡样芽孢杆菌呈阳性；第4泳道在1500 bp和333 bp处有2个条带与阳性对照位置一致，说明检样4阪崎克罗诺杆菌呈阳性；第5在1500 bp和279 bp处有2个条带与阳性对照位置一致，说明检样5金黄色葡萄球菌呈阳性。
图2：检测过程中发生交叉污染而导致检测失败的PCR扩增产物电泳结果。阴性对照有电泳条带出现，说明样品处理过程中被交叉污染，检测结果不可信，需要重新进行检测。
图3：样品处理过程中存在抑制DNA聚合酶活性的物质或操作失误而导致检测失败的PCR扩增产物电泳结果。阴对照无条带，阳性对照有5条电泳条带，而检样1在约1500 bp处无扩增内标条带，说明样品处理过程中存在抑制DNA聚合酶活性的物质或操作失误，检测结果不可信，需要重新进行处理后检测。
图4：对应实施例1的部分实际样品检测结果。
图1到图4中，M：250 bp DNA分子量标准；阳：阳性对照；阴：阴性对照；1-13：对应实施例1的部分实际样品（图中的编号是按顺序排列，不同图中的同一个数字编号可能并非同一份样品）。
具体实施方式
实施例1
（a）样品采集：根据符合规定的标准及采样方法，从不同的农贸市场、超市等无菌采集蔬菜、水产品、肉及肉制品、乳及乳制品、蛋类及蛋制品等各种食品样品；
（b）样品的增菌培养：将无菌采集的样品无菌取样25 g，放入无菌研钵或者组织研磨器内匀浆，或置于无菌均质袋内均质2 min，加入225 ml无菌的含1%氯化钠的胰蛋白胨大豆肉汤培养基于37℃条件培养8-12 h，得到增菌液；
（c）DNA提取：取培养后的增菌液，振荡混匀后，取1 ml于离心管中1000 r/mim离心1 min，除去较大块的碎片，取上清10000 r/mim离心2 min，倾去上清液，倒置于吸水纸上不同的位置，吸干残留液体，再用无菌去离子水重悬、洗涤沉淀，10000 r/mim离心2 min，弃上清，用少量无菌去离子水重悬沉淀，再采用商品化的试剂盒提取DNA或者采取反复冻融法提取DNA，即直接沸水浴，冰浴，离心，取上清液，得样品模板DNA，用无菌蒸馏水调整至浓度约为10 ng/μl，直接进行PCR扩增或于-20℃冷冻保存备用；
（d）PCR反应管制备：所有操作均需在冰上进行；先将PCR反应预混液置于冰上融化，吸取50 μl置于无菌PCR反应管中，再加入1 μl样品模板DNA，用手指轻弹制备好的PCR反应管或用微量移液器吹打混匀，瞬时高速离心2 s；按照阴性对照品、实际检测样品、阳性对照品的顺序分别制备PCR反应管；
（e）扩增检测：将制备的阴性对照品、样品模板DNA和阳性对照品的PCR反应管置于PCR仪上，进行PCR扩增，得PCR扩增产物；反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性40 s，56.7℃退火40 s，72℃延伸70 s，进行35个循环；72℃延伸10 min，4 ℃保存；
（f）检测结果判定：将1 g琼脂糖溶于100 ml的0.5×TBE电泳缓冲液中，然后加入5 μl DNA染料，混匀煮沸，倾倒凝胶板；凝胶冷却凝固后，用微量移液器吸取PCR产物5 μl加入凝胶孔中进行电泳；电泳结束后取出凝胶置于紫外灯下观察、拍照，判定结果：（a）阳性对照的凝胶孔有5条电泳条带而阴性对照的凝胶孔无任何条带，则PCR反应检测成功；（b）若阴性对照有条带，说明PCR反应管制备过程中有交叉污染，结果不可靠，建议重新进行PCR检测；（c）阳性对照有5条带，阴性对照没有条带，被检样品的凝胶孔只出现1条约1500 bp的电泳条带与阳性对照的凝胶孔相应位置的条带大小一致，则结果判断为阴性；（d）被检样品的凝胶孔出现2条或2条以上电泳条带，且与阳性对照的凝胶孔中相应位置的条带大小一致，而阴性对照无条带，则判定为与相应条带大小对应的目的细菌呈阳性；单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、阪崎克罗诺杆菌和金黄色葡萄球菌4种细菌相对应的特异性条带大小分别为826 bp、544 bp、333 bp和279 bp；（e）阳性对照的凝胶孔有5条电泳条带，阴性对照的凝胶孔无任何条带，而被检样品的凝胶孔在1500 bp位置没有电泳条带，说明样品处理过程中存在酶抑制剂，建议换其他方法进行样品处理；（f）阳性对照没有条带，说明试剂盒失效，本次检测结果无效。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 渤海大学
<120> 一种同时检测单核细胞增多性李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、阪崎克罗诺杆菌、
金黄色葡萄球菌4种常见食源性致病菌的试剂盒
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
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<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 2
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<212> DNA
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
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<212> DNA
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 4
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<213> 蜡样芽孢杆菌
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<213> 蜡样芽孢杆菌
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<213> 阪崎克罗诺杆菌
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<213> 金黄色葡萄球菌
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<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
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<212> DNA
<213> 大肠杆菌
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<210> 12
<211> 1561
<212> DNA
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 12
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a 1561
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<213> 蜡样芽孢杆菌
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<213> 阪崎克罗诺杆菌
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ggtggcgaag gcggccccct ggacgaagac tgacgctcag gtgcgaaagc gtggggagca 780
aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gtcgacttgg aggttgtgcc 840
cttgaggcgt ggcttccgga gctaacgcgt taagtcgacc gcctggggag tacggccgca 900
aggttaaaac tcaaatgaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 960
tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctggtc ttgacatcca gagaatcctg cagagatgcg 1020
ggagtgcctt cgggaactct gagacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct cgtgttgtga 1080
aatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttatcc tttgttgcca gcggttcggc 1140
cgggaactca aaggagactg ccggtgataa accggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc 1200
atcatggccc ttacgaccag ggctacacac gtgctacaat ggcgcataca aagagaagcg 1260
acctcgcgag agcaagcgga cctcataaag tgcgtcgtag tccggattgg agtctgcaac 1320
tcgactccat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgtggatca gaatgccacg gtgaatacgt 1380
tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt gggttgcaaa agaagtaggt 1440
agcttaacct tcgggagggc gcttaccact ttgtgattca tgactggggt gaagtcgtaa 1500
caaggtaacc gtaggggaac ctgcggttgg atcacctcct ta 1542
<210> 15
<211> 1555
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 15
ttttatggag agtttgatcc tggctcagga tgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca 60
agtcgagcga acggacgaga agcttgcttc tctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac 120
acgtggataa cctacctata agactgggat aacttcggga aaccggagct aataccggat 180
aatattttga accgcatggt tcaaaagtga aagacggtct tgctgtcact tatagatgga 240
tccgcgctgc attagctagt tggtaaggta acggcttacc aaggcaacga tgcatagccg 300
acctgagagg gtgatcggcc acactggaac tgagacacgg tccagactcc tacgggaggc 360
agcagtaggg aatcttccgc aatgggcgaa agcctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat 420
gaaggtcttc ggatcgtaaa actctgttat tagggaagaa catatgtgta agtaactgtg 480
cacatcttga cggtacctaa tcagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta 540
atacgtaggt ggcaagcgtt atccggaatt attgggcgta aagcgcgcgt aggcggtttt 600
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tgagtgcaga agaggaaagt ggaattccat gtgtagcggt gaaatgcgca gagatatgga 720
ggaacaccag tggcgaaggc gactttctgg tctgtaactg acgctgatgt gcgaaagcgt 780
ggggatcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg 840
ttagggggtt tccgcccctt agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt 900
acgaccgcaa ggttgaaact caaaggaatt gacggggacc cgcacaagcg gtggagcatg 960
tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaaatct tgacatcctt tgacaactct 1020
agagatagag ctttcccctt cgggggacaa agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc 1080
tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttaag cttagttgcc 1140
atcattaagt tgggcactct aagttgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg 1200
acgtcaaatc atcatgcccc ttatgatttg ggctacacac gtgctacaat ggacaataca 1260
aagggcagcg aaaccgtgag gtcaagcaaa tcccataaag ttgttctcag ttcggattgt 1320
agtctgcaac tcgactacat gaagctggaa tcgctagtaa tcgtagatca gcatgctacg 1380
gtgaatacgt tcccgggtct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc 1440
cgaagccggt ggagtaacct tttaggagct agccgtcgaa ggtgggacaa atgattgggg 1500
tgaagtcgta acaaggtagc cgtatcggaa ggtgcggctg gatcacctcc tttct 1555
<210> 16
<211> 826
<212> DNA
<213> 单增李斯特菌
<400> 16
atgctaagtt tcatgtggac ggcaaagaaa caaccaaaga agtggaagct gggaatttat 60
tgactgaacc agctaagccc gtaaaagaag gtcacacatt tgttggttgg tttgatgccc 120
aaacaggcgg aactaaatgg aatttcagta cggataaaat gccgacaaat gacatcaatt 180
tatatgcaca atttagtatt aacagctaca cagcaacctt tgataatgac ggtgtaacaa 240
catctcaaac agtagattat caaggcttgt tacaagaacc tacaccacca acaaaagaag 300
gttatacttt taaaggctgg tatgacgcaa aaactggcgg tgacaagtgg gattttgcaa 360
ctagtaagat gcctgctaaa aacatcacct tatatgctca atatagcgcc aatagctata 420
cagcaacctt tgatgttgat ggaaaaacaa cgactcaagc agtagactat caaggacttc 480
taaaagaacc aaaaacgcca acaaaagccg gatatacttt caaaggttgg tatgacgaaa 540
aaacagatgg taaaaaatgg gattttgcga cagataaaat gccagcaaat gatattacgc 600
tgtacgctca attcacgaaa aatcctgtgg caccaccaac aactggaggg aacacgccgc 660
cgactacaaa taacggaggg aatactacac caccttccgc aaatatacct ggaagcgaca 720
catctaacac atcaactggg aattcagcta gcacaacaag tacaatgaac gcttatgacc 780
cttataattc aaaagaagct tcactcccta caactggcga tagcga 826
<210> 17
<211> 544
<212> DNA
<213> 蜡样芽孢杆菌
<400> 17
aaatcatttc aatgtcatcg ctccctttaa caaaggaggg gacgattgat cggcaacaat 60
taatgtcttt gctatgcata acagctgacg aagagatgcg attgcagcaa agctatggaa 120
aagagaagat ggcaattact tatgaagaag tatttcgcct tccgaatgtg aaccacgttt 180
atgatgtgat gaaggtgaag gaaacctctc aaaaagtcgt ttcacgagaa aagcaagcca 240
aagagcattt tgcgcagcac atacctgcat atatggtggg agaagatttg acacaatttg 300
atatgagtca agaaccaaaa actttagtcg aagtgattca caatgcggcg aaaaactatg 360
gtaatcatgg aattacgttt attgatgagc atggtaaaac cgagttttta acttataaaa 420
tgattttgat ggaagcagag aggatgctga aagggttgcg agcattccaa cttcaaccac 480
aggacaaaat cattttccaa atgaataatg acaaagtttt tgtcattact ttctgggcgt 540
gtgt 544
<210> 18
<211> 333
<212> DNA
<213> 阪崎克罗诺杆菌
<400> 18
agcgggaaga ggatgaaatc ggtggtatca atggcgcgcc gtccggccac cagcggctca 60
agcgcattta gctgcgcgtt gacctgcgcc agcaaggcag gcgtctgcgc gcgcagcgcg 120
gctaaatcgc caaacgcgcg ctcttcacgc gcggtatagg cgcgacgggc ctcagtggtc 180
gccagctcgg cgaaatcgcc ctcggtaaag cgtgggatcg ccagattaaa cagcggggtc 240
gaaaccgact cgcaccactg tttaatcgcc tcatcaaccg gcgcgtcggt cacgcgcggc 300
ggcgcaagcc catccacgta acgcacaata tcc 333
<210> 19
<211> 279
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 279
gcgattgatg gtgatacggt taaattaatg tacaaaggtc aaccaatgac attcagacta 60
ttattggttg atacacctga aacaaagcat cctaaaaaag gtgtagagaa atatggtcct 120
gaagcaagtg catttacgaa aaagatggta gaaaatgcaa agaaaattga agtcgagttt 180
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