甘草醇在制备免疫抑制剂和相关药物中的应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101235038 B (45)授权公告日 2011.04.27 CN 101235038 B *CN101235038B* (21)申请号 200710003022.3 (22)申请日 2007.01.31 C07D 493/04(2006.01) A61K 31/37(2006.01) A61P 37/06(2006.01) A61K 36/484(2006.01) A61K 125/00(2006.01) (73)专利权人 北京师范大学 地址 100875 北京市海淀区新街口外大街 19 号 (72)发明人 魏群 屠颖 李家玉 骆静 吴大伟 柏超然 . 中医药治。

2、疗白塞病 98 例临床研 究 .中医杂志 .2000, 第 41 卷 ( 第 8 期 ), 柏超然 . 中医药治疗白塞病 98 例临床研 究 .中医杂志 .2000, 第 41 卷 ( 第 8 期 ), (54) 发明名称 甘草醇在制备免疫抑制剂和相关药物中的应 用 (57) 摘要 一种新颗的免疫抑制剂甘草醇， 具有显著的 免疫抑制活性， 可以作为免疫抑制剂来治疗相关 的疾病。所述甘草醇为一种从甘草中提取的考迈 斯托醇类化合物， 是一种化学结构新颖的小分子 量化合物。通过实验发现其能抑制刀豆蛋白 A 诱 导的 T 淋巴细胞增殖， 并且对单向混合淋巴细胞 反应也表现出明显的抑制作用。此外， 甘草。

3、醇能 缓解迟发型超敏反应的炎性症状， 并且可以抑制 同种异体器官移植排斥反应。甘草醇作为一种高 效、 低毒的免疫抑制剂， 因其分子量小， 结构简单， 易于改造修饰， 可以制成不同的药物制剂。 因此本 化合物能成为新一代免疫抑制剂。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 金英 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 CN 101235038 B1/1 页 2 1. 一种从甘草中提取的醇类化合物作为唯一活性成份在制备免疫抑制剂中的应用， 所 述醇类化合物为甘草醇。 2.一种从甘草中提取的醇类化合物作为唯一活性成份在制备抑。

4、制刀豆蛋白A诱导的T 淋巴细胞增殖药物中的应用， 所述醇类化合物为甘草醇。 3. 一种从甘草中提取的醇类化合物作为唯一活性成份在制备抑制单向混合淋巴细胞 药物中的应用， 所述醇类化合物为甘草醇。 4. 一种从甘草中提取的醇类化合物作为唯一活性成份在制备缓解迟发型超敏反应炎 性症状药物中的应用， 所述醇类化合物为甘草醇。 5. 一种从甘草中提取的醇类化合物作为唯一活性成份在制备抑制同种异体器官移植 排斥反应药物中的应用， 所述醇类化合物为甘草醇。 权 利 要 求 书 CN 101235038 B1/5 页 3 甘草醇在制备免疫抑制剂和相关药物中的应用 背景技术 0001 甘 草 (Glyoyrr。

5、hiza uralensis) 系 豆 科 (Leguminame) 甘 草 属 (Glycyrrhiza Linn)多种植物的根和根茎。 甘草的化学组成极为复杂， 主要为三萜皂苷类、 黄酮类、 香豆素 类以及多糖类等成分。而甘草的多种化学成分都是非常重要的天然活性物质， 因此国内外 学者先后对甘草提取物及其中一些单体的药理活性进行了深入的研究， 并取得了一些可喜 的成绩。 0002 甘草醇 (glycyrol) 是甘草中的一类香豆素类化合物， 国内也有报道称该化 合物为新甘草酚 ( 王彩兰， 张如意等， 乌拉尔甘草中新香豆素的化学研究， 药学学报， 1991 ： 26(2) ： 147-15。

6、1)， 国内外学者对该化合物及其类似物的药理活性研究已取得很 多有价值的成果。Hattori， Masao 报道甘草醇及其它一些香豆素类化合物可以有效 地抵抗造成龋齿的细菌 - 转糖链球菌 (Studies on dental caries prevention by traditionalmedicines(IX).Potent antibacterial action of coumarin derivatives from licorice rootsagainst Streptococcus mutans， Shoyakugaku Zasshi， 1986， 40(4) ： 406-4。

7、12) ； 同时甘草醇还可以抑制黑色素的生成， 一些美白肌肤用的化妆品中都含有这类 单体 (Skin-lightening agents and cosmetics containing coumestrol derivatives， Patent， Application ： JP 93-114904 19930517)， Saki， Tokimasa 等 又 指 出 包 括 glycyrol 在内多种成分均表现出对 - 葡萄糖苷酶的抑制作用 (Glycyrrhiza extracts as-glucosidase inhibitors， Patent， Application ： JP 2。

8、002-51909 20020227)， 而 -葡萄糖苷酶活性又与高血糖相关， 由此可见甘草醇及其类似物具有多种生物活性。 但目 前单独对该单体药理活性的研究很少， 并且鲜有报道这个成分在免疫抑制方面的作用， 本 发明发现该化合物具有免疫抑制活性， 可作为一种新颖的免疫抑制剂。 0003 免疫抑制剂是一类具有免疫抑制作用的药物， 主要功能为抑制机体异常的免疫反 应， 应用于自身免疫性疾病和过敏反应及器官移植(如心、 肝、 肾、 肺和骨髓移植等)后排斥 反应的治疗。 自身免疫性疾病是由于自身免疫应答过强或持续时间过长以至破坏自身正常 组织结构并引起的相应临床症状 ； 过敏反应即为机体抗原持续刺激。

9、或同一抗原再次刺激后 产生的一种以生理功能紊乱和组织损伤为主要表现的 病理性免疫反应 ； 临床器官移植手 术后， 受者免疫系统可识别移植物抗原并产生应答， 移植物中免疫细胞也可以识别受者组 织抗原并产生免疫应答， 此为移植排斥反应。这些症状都是机体 “不适当” 的免疫应答引起 的， 而免疫抑制剂在一定程度上能够起到治疗这些疾病的作用， 尤其是在器官移植后排斥 反应的治疗中能够起到很明显的疗效， 在临床上得到了广泛的应用。 0004 目前所有的免疫抑制剂可分为以下几种 ： (1) 抗代谢类 ： 硫唑嘌呤、 氨甲蝶呤等 ； (2) 烃化剂 ： 环磷酰胺等 ； (3) 皮质固醇类 ： 强的松、 地赛。

10、米松等 ； (4) 抗生素类 ： 环孢菌素 A(CsA)、 他克莫司 (FK506)、 雷帕霉素等 ； (5) 抗体类 ： 抗淋巴细胞球蛋白等 ； (6) 中草药 ： 雷 公藤多苷、 冬虫夏草等。临床常用的免疫抑制药物如激素、 环磷酰胺、 环抱菌素 A 等， 疗效虽 已被证实， 但只能改善症状， 不能有效地从根本上控制疾病的发生和发展， 且毒副作用大， 不能长期持续应用。但与化药免疫抑制剂相比， 中药免疫抑制剂有以下特点 ： (1) 成分多 说 明 书 CN 101235038 B2/5 页 4 样化、 药理作用广泛且复合， 除免疫抑制作用外， 还有抗炎、 抗过敏及免疫双向调节等作用 ； (2。

11、) 毒性小、 副作用少， 有的虽有毒副作用， 但减量或停药即消失 ； (3) 与其它免疫抑制剂合 用， 能提高疗效， 降低后者毒副作用。 因此， 应用中药免疫抑制剂治疗免疫性疾病， 越来越受 到药学工作者的青睐。本发明化合物甘草醇即为一种高效、 低毒的免疫抑制剂。 发明内容 0005 本发明目的在于克服现有免疫抑制剂的各种缺点， 找到一种低毒、 高效的免疫抑 制剂， 并提供甘草醇作为免疫抑制剂治疗相关的疾病上的应用。 0006 所述甘草醇为考迈斯托醇类化合物， 含有 ， - 不饱和六元环内酯和两个芳环， 其结构式为 ： 5 一甲氧基一 6 一异戍烯基一 7， 12- 二羟基香豆苯醚， 结构式如。

12、下 ： 0007 0008 所述甘草醇分子量小、 化学结构新颖， 有别于迄今所有的免疫抑制剂， 并且甘草醇 对细胞毒性很低。 0009 所述甘草醇能抑制刀豆蛋白 A(ConA) 诱导的 T 淋巴细胞增殖， 并且对单向混合淋 巴细胞反应也表现出明显的抑制作用。此外其能缓解迟发型超敏反应的炎性症状， 并且可 以抑制同种异体器官移植排斥反应。 0010 所述甘草醇已经在动物实验模型上证实具有显著的免疫抑制作用， 因此可作为一 种新颖的免疫抑制剂， 用于预防和治疗自身免疫性疾病、 过敏反应和器官移植后的排斥反 应， 以及与机体免疫系统功能及反应状态异常相关的疾病。 0011 本发明的优点在于 ： 所述。

13、甘草醇为一种中草药免疫抑制剂， 其免疫抑制作用与当 今临床上广泛使用的免疫抑制剂 - 环孢菌素 A 相似或稍弱， 但其非特异性淋巴细胞毒性比 环胞菌素 A 低很多， 即其作用剂量远远低于毒性剂量， 是一种高效、 低毒的免疫抑制剂 ； 同 时其分子量小， 结构简单， 易于改造修饰， 可以制成不同的药物制剂。因此本化合物有可能 成为更有特点的新一代免疫抑制剂。 附图说明 ： 0012 图 1 是甘草醇抑制 ConA 诱导的 T 淋巴细胞增殖及单向混合淋巴细胞反应示意图 说 明 书 CN 101235038 B3/5 页 5 0013 图 2 是甘草醇和 CsA 的非特异性淋巴细胞毒性示意图 具体实。

14、施方式 0014 实施例 1 ： 甘草醇的纯化 0015 将干燥的甘草粉碎至 10 20 目颗粒大小， 放入渗漉装置中后， 用乙醇渗漉提取， 收集渗漉液。 渗漉液经减压浓缩后用乙酸乙酯萃取， 萃取液浓缩后制样， 然后进行硅胶柱层 析， 以石油醚 - 乙酸乙酯系统进行梯度洗脱， 收集馏分， 保留有固体析出的馏分。这些馏分 采用高速逆流色谱 (HSCCC) 进行纯化， 得到白色针状晶体， 经核磁共振光谱 (NMR) 的氢谱、 碳谱、 氢 - 氢相关谱、 碳 - 氢相关谱等谱图以及质谱谱图分析该化合物为甘草醇。 0016 实施例 2 ： 甘草醇对 ConA 诱导小鼠 T 淋巴细胞增殖的抑制作用 00。

15、17 将近交系 BALB/c 小鼠处死， 取脾脏， 用培养液制成细胞悬液。然后将 100l 细 胞悬液植入 96 孔培养板中， 加入 90l 不同浓度的甘草醇， 同时还加入 10l 有丝分裂原 ConA， 对照组加 90l 含 10血清的培养液， 于 37， 5二氧化碳条件下培养 72 小时。待 培养结束时， 从各孔小心吸出上清， 再加入 10l MTT， 继续放入培养箱中孵育。4 小时后， 各孔再加入 100l 甲臜裂解液， 放回培养箱中孵育过夜， 酶标仪上读取 OD570。 0018 分析实验数据可知 ： 甘草醇对ConA诱导的T细胞增殖能起到明显的抑制作用(见 图 1)， 且抑制作用和剂。

16、量有依赖性关系， 即剂量越高， 抑制越明显。 0019 实施例 3 ： 甘草醇对单向混合淋巴细胞反应 (MLR) 的抑制作用 ： 0020 将近交系 BALB/c 和 C57BL 小鼠处死， 取脾脏， 用培养液制成细胞悬液。其中近交 系 C57BL 小鼠脾细胞经丝裂霉素 C 处理， 作为反应细胞， 近交系 BALB/c 小鼠脾细胞为刺激 细胞， 两种细胞悬液等体积混合。然后于 96 孔培养板中加入 100l 混合细胞悬液， 药物溶 液 100l， 对照组加 100l 含 10血清的培养液， 并设两种细胞的单独培养作为对照。于 37， 5二氧化碳条件下培养72小时。 待培养结束时， 从各孔小心吸。

17、出上清， 再加入10l MTT， 继续放入培养箱中孵育。 4小时后， 各孔再加入100l甲臜裂解液， 放回培养箱中孵育 过夜， 酶标仪上读取 OD570。 0021 分析实验数据可知 ： 甘草醇能明显地抑制单向混合淋巴细胞的增殖作用， 且这 种 抑制作用与剂量呈依赖关系 ( 见图 1)， 且高剂量时抑制作用最强。 0022 实施例 4 ： 非特异性淋巴细胞毒性试验 0023 将近交系 BALB/c 小鼠处死， 取脾脏， 用培养液制成细胞悬液。然后将 100l 细胞 悬液加入 96 孔培养板中， 加入 100l 不同浓度的甘草醇和 CsA， 对照组加 100l 含 10 血清的培养液， 于 37。

18、， 5二氧化碳条件下培养 72 小时。待培养结束时， 从各孔小心吸出 上清， 再加入 10l MTT， 继续放入培养箱中孵育。4 小时后， 各孔再加入 100l 甲臜裂解 液， 放回培养箱中孵育过夜， 酶标仪上读取 OD570。 0024 分析实验数据可知 ： 甘草醇只有在高浓度时对正常小鼠的淋巴细胞有一定的毒 性， 在 12.5g/ml 的浓度以下对淋巴细胞的毒性就很弱 ( 见图 2)， 而 CsA 在同浓度范围内 对淋巴细胞的毒性就强得多， 故甘草醇一定浓度范围内对淋巴细胞的毒性很低。 0025 实施例 5 ： 甘草醇对迟发型超敏反应 (DTH) 的抑制 ： 0026 将近交系BALB/c。

19、小鼠随机分组， 分别用绵羊红细胞(SRBC)进行皮下免疫， 同天腹 腔注射不同浓度的药品溶液， 对照组给予等量的生理盐水或者 CsA 溶液。注射 5 天后， 右足 说 明 书 CN 101235038 B4/5 页 6 垫皮下再次注射 SRBC， 左足垫皮下注射等量生理盐水作为对照。24 小时后， 用游标卡尺测 量每只小鼠左右足足垫的厚度， 并处死小鼠， 检测脾细胞中活细胞的数目。 0027 比较每只小鼠左右足足垫的厚度， 经过分析得出甘草醇对SRBC诱导小鼠DTH的抑 制率， 如 Table 1。 0028 Table 1 甘草醇对 SRBC 诱导小鼠 DTH 的抑制作用 0029 组别 剂。

20、量 (mg/kg) 足垫厚度 (mm) 抑制率 ( ) 对照 0 0.680.19 0 甘草醇 10 0.410.16 39.7 甘草醇 20 0.320.02 52.9 甘草醇 40 0.260.09 61.7 CsA 50 0.200.08 70.6 0030 与对照组相比， 不同浓度甘草醇和 CsA 均可以抑制迟发型超敏反应的发生， 且甘 草醇 40mg/kg 与 CsA50mg/kg 同样有显著的免疫抑制效应。 0031 比较对照组和实验组小鼠脾细胞数目， 统计分析数据， 结果如 Table 2。Table 2 不同浓度甘草醇对 DTH 小鼠脾细胞的抑制 0032 组别 剂量 (mg/。

21、kg) 脾细胞数目 (104) 存活率 ( ) 对照 0 20323 100 甘草醇 10 17141 84.2 甘草醇 20 13321 65.5 甘草醇 40 9712 47.8 CsA 50 11811 57.6 0033 与对照组相比， 不同浓度甘草醇和 CsA 在体内均可以抑制小鼠脾细胞数目， 且甘 草醇 40mg/kg 比 CsA 50mg/kg 的抑制作用更强。 0034 实施例 6 ： 在小鼠同种异型皮肤移植中的作用 0035 将近交系 BALB/c 和 C57BL 小鼠麻醉后， 无菌环境下同时剪去左侧背部皮肤 (1cm1cm)。然后 BALB/c 小鼠和 C57BL 小鼠皮片。

22、互换， 平铺于背部左边的植床上， 缝合、 包 扎和固定。 而每只小鼠背部右侧皮肤进行自体移植， 以验证实验人的技术误差。 在皮肤移植 手术结束 24 小时后， 给药 10 天， 分为 CsA 阳性对照组和实验组， 均为腹腔注射。观察 7-14 天， 记录皮片存活时间， 移植皮片以发生完全损伤干燥 为发生排斥标准。 0036 观察小鼠移植皮片生长情况， 并记录实验组和对照组小鼠同种异体移植皮片存活 时间， 初步实验结果如 Table 3。 0037 Table 3 甘草醇对同种异体皮肤移植的延缓作用 0038 组别 剂量 (mg/kg) 皮片存活天数 空白组 0 7.40.55 CsA 20 1。

23、0.40.55 甘草醇 20 11.80.45 0039 初步实验结果揭示本发明化合物可以延缓BALB/c小鼠对同种异体C57BL小鼠皮肤 移植的排斥反应， 同时也可以延缓C57BL小鼠对同种异体BALB/c小鼠皮肤移植的排斥反应， 这显示了本发明化合物有希望应用于临床预防器官移植排斥反应。 说 明 书 CN 101235038 B5/5 页 7 0040 上述实施例仅供说明本发明之用， 而并非是对本发明的限制， 有关技术领域的普 通技术人员， 在不脱离本发明的精神和范围的情况下， 还可以作出各种变化和变型， 因此所 有等同的技术方案也应属于本发明的范畴， 本发明的专利保护范围应由各权利要求限定。 说 明 书 CN 101235038 B1/2 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 101235038 B2/2 页 9 图 2 说 明 书 附 图 。