水稻新生组织特异启动子p-EMA1及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103834655 A (43)申请公布日 2014.06.04 CN 103834655 A (21)申请号 201210482822.9 (22)申请日 2012.11.23 C12N 15/113(2010.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 15/11(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人 中国农业大学 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路 2 号 。

2、(72)发明人 孙传清 谢道昕 彭文 谭禄宾 叶盛 张永生 单晓昳 刘凤霞 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (54) 发明名称 水稻新生组织特异启动子 p-EMA1 及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种水稻新生组织特异启动子 p-EMA1 及其应用。本发明提供的启动子， 来源于 普通野生稻 （O.rufipogon Griff.） ， 为如下 1） 或 2） 或 3） 或 4） ： 1） 序列 1 自 5 末端第 1 至 1841 位 核苷酸所示的 DNA 分子 ； 2） 序列 1 所示的 DNA 分 子 ； 3） 与 1） 或 2） 限定。

3、的 DNA 序列杂交且具有启动 子功能的 DNA 分子 ； 4） 与 1） 或 2） 限定的 DNA 序 列具有 90% 以上同源性且具有启动子功能的 DNA 分子。 本发明对于水稻早熟分子机制的研究， 水稻 早熟品种的选育具有重要的理论及实际意义。本 发明对于水稻新生组织特异表达的分子机制的研 究， 以及水稻新生组织特异表达特征分子育种具 有重要的理论及实际意义。本发明在农业领域将 具有广阔的应用和市场前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表。

4、2页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103834655 A CN 103834655 A 1/1 页 2 1. 一种 DNA 片段， 为如下 1） 或 2） 或 3） 或 4） ： 1） 序列表中序列 1 自 5 末端第 1 至 1841 位核苷酸所示的 DNA 分子 ； 2） 序列表中序列 1 所示的 DNA 分子 ； 3） 在严格条件下与 1） 或 2） 限定的 DNA 序列杂交且具有启动子功能的 DNA 分子 ； 4） 与 1） 或 2） 限定的 DNA 序列具有 90% 以上同源性且具有启动子功能的 DNA 分子。 2. 含有权利要求 1 所述 DNA 片段的重组载体、 表达盒、。

5、 转基因细胞系或重组菌。 3. 如权利要求 2 所述的重组载体， 其特征在于 ： 所述重组载体为在植物表达载体 pCambia1381 的多克隆位点插入权利要求 1 所述 DNA 片段得到重组质粒。 4.如权利要求2所述的重组载体， 其特征在于 ： 所述重组载体为将权利要求1所述DNA 片段插入植物表达载体 pCambia1381 的 BamHI 和 HindIII 酶切识别位点间得到的重组质 粒。 5. 扩增权利要求 1 所述 DNA 片段的全长或其任意片段的引物对。 6. 权利要求 1 所述 DNA 片段在启动目的基因表达中的应用。 7. 如权利要求 6 所述的应用， 其特征在于 ： 所述。

6、启动目的基因表达为启动目的基因特 异性表达。 8. 一种培育转基因植物的方法， 是在出发植物中用权利要求 1 所述 DNA 片段启动目的 基因的表达， 得到表达所述目的基因的转基因植物。 权 利 要 求 书 CN 103834655 A 2 1/5 页 3 水稻新生组织特异启动子 p-EMA1 及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种水稻新生组织特异启动子 p-EMA1 及其应用。 背景技术 0002 植物新生组织 （器官） 均由原基分化发育而成， 并且植物具有持续发育新生组织 （器官） 的能力， 因此新生组织的生长发育状况对于整个植株的生长发育至关重要。 0003 水稻是世界上最重要的粮。

7、食作物之一， 其种子可供人类食用。水稻籽粒产量的决 定因素主要包括有效穗、 结实率、 每穗粒数和粒重， 而有效穗数和每穗粒数均于新生组织的 生长状态紧密相关。因此， 设计水稻新生组织特异表达的启动子对于水稻产量分子育种至 关重要。 0004 普通野生稻是亚洲栽培稻的祖先种， 野生稻在演化成栽培稻的过程中， 经过自然 选择和人工选择， 基因多样性降低， 等位基因数减少。据统计， 栽培稻的等位基因数约为野 生稻的 60%， 从而导致当前水稻品种选育所面临的遗传瓶颈 （geneticbottleneck） 问题。因 此从水稻的近缘野生种 （普通野生稻 Oryza rufipogon Griff.） 。

8、基因组中发掘和利用在栽 培稻中已丢失或削弱的优异基因， 并把它们应用于水稻育种生产中具有十分重要的理论意 义和实践价值， 也是解决当前水稻育种难题的一条行之有效的途径。 0005 我国野生稻资源丰富， 从野生稻中发掘、 定位、 克隆水稻新生组织特异启动子， 将 对水稻生产具有重要意义。 0006 云南元江普通野生稻是中国生长位置海拔最高 (780m) 的普通野生稻， 其生长环 境与栽培稻的隔离条件好， 没有栽培稻基因的渗入。Sun 等 (2002) 对元江普通野生稻核基 因组及线粒体、 叶绿体基因组的遗传分化的研究表明， 元江普通野生稻是一个非常特殊的 普通野生稻群体， 是研究亚洲野生稻起源演。

9、化和拓宽水稻遗传基础的重要材料。 发明内容 0007 本发明的目的是提供一种水稻新生组织特异启动子 p-EMA1 及其应用。 0008 本发明提供了一种具有启动子功能的 DNA 片段， 命名为 p-EMA1（或 p-EMA1)， 来源 于普通野生稻 （O.rufipogon Griff.） ， 为如下 1） 或 2） 或 3） 或 4） ： 0009 1） 序列表中序列 1 自 5 末端第 1 至 1841 位核苷酸所示的 DNA 分子 ； 0010 2） 序列表中序列 1 所示的 DNA 分子 ； 0011 3） 在严格条件下与 1） 或 2） 限定的 DNA 序列杂交且具有启动子功能的 D。

10、NA 分子 ； 0012 4） 与 1） 或 2） 限定的 DNA 序列具有 90% 以上同源性且具有启动子功能的 DNA 分 子。 0013 上述严格条件可为在 0.1SSPE （或 0.1SSC） 、 0.1 SDS 的溶液中， 65条件下 杂交并洗膜。 0014 含有所述 DNA 片段的重组载体、 表达盒、 转基因细胞系或重组菌均属于本发明的 保护范围。 说 明 书 CN 103834655 A 3 2/5 页 4 0015 所述重组载体可为在植物表达载体pCambia1381的多克隆位点插入所述DNA片段 得到重组质粒。所述重组载体具体可为将所述 DNA 片段插入植物表达载体 pCam。

11、bia1381 的 BamHI 和 HindIII 酶切识别位点间得到的重组质粒。 0016 扩增所述 DNA 片段的全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。 0017 本发明还保护所述 DNA 片段在启动目的基因表达中的应用。所述启动目的基因表 达可为启动目的基因的特异性表达。所述特异性表达具体可为组织特异表达。所述组织特 异表达可为新生组织特异表达。所述新生组织为幼芽 （特别是幼芽基部） 、 根的生长点， 新生 叶或新生穗。 0018 本发明还保护所述 DNA 片段在培育转基因植物中的应用。所述植物可为单子叶植 物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为水稻， 如水稻品种 “日本晴” 。

12、。 0019 本发明还保护一种培育转基因植物的方法， 是在出发植物中用所述 DNA 片段启动 目的基因的表达， 得到表达所述目的基因的转基因植物。所述出发植物可为单子叶植物或 双子叶植物。所述单子叶植物具体可为水稻， 如水稻品种 “日本晴” 。所述目的基因具体可 为 GUS 基因。所述方法具体可为将所述重组载体导入所述出发植物， 从而在所述出发植物 中用所述 DNA 片段启动 GUS 基因的表达。 0020 本发明公开了一个水稻新生组织特异启动子p-EMA1及其应用。 本发明提供的DNA 片段具有启动子的功能， 具有特异表达的特性。 本发明对于水稻早熟分子机制的研究， 水稻 早熟品种的选育具有。

13、重要的理论及实际意义。 本发明对于水稻新生组织特异表达的分子机 制的研究， 以及水稻新生组织特异表达特征分子育种具有重要的理论及实际意义。本发明 在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。 附图说明 0021 图 1 为目的片段在渗入系 YIL23 和特青不同生长发育时期的表达谱分析。 0022 图 2A 为融合 GUS 基因载体示意图。 0023 图 2B 为 p-EMA1 的 PCR 扩增策略。 0024 图 3 为转基因植株 GUS 组织染色结果 ； a 为 5d 幼苗 ； b 为 15 天苗的幼叶 ； c-i 为穗 发育不同时期的染色结果。 具体实施方式 0025 以下的实施例便于更好地理。

14、解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。 以下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 结果取平 均值。所用引物合成及测序工作均由北京奥科生物科技有限责任公司完成。 0026 水稻品种 “日本晴” ： 中国作物种质资源信息网 （ ， 库 编号为 I1A13071。 0027 水稻品种 “特青” ： 中国作物种质资源信息网 （ ， 库编 号为 I1A40810。 0028 植物表达载体 pCambia1381 即 NCBI 中的 Binary vector pCA。

15、MBIA-1381， 为环形 质粒， 其核苷酸序列见 NCBI 中的如下序列 ： GenBank:AF234302.1 ； VERSION ： AF234302.1 ； 说 明 书 CN 103834655 A 4 3/5 页 5 GI:7638091。植物表达载体 pCambia1381 的核苷酸序列中， 第 9810 至 10590 位核苷酸为 CaMV35S 启动子 （组成型启动子） ， 用来启动潮霉素基因 ； 第 2-1855 位核苷酸为 GUS 基因 （质 粒中没有用于启动 GUS 基因的启动子） ； 第 7214-8008 位核苷酸为 aadA 基因 ( 卡那霉素抗 性基因 ) ；。

16、 第 8749-9774 位核苷酸为 hptII 基因 ( 潮霉素抗性基因 )。 0029 实施例 1、 水稻新生组织特异启动子 p-EMA1 的发现 0030 一、 EMA1 基因的发现 0031 从以云南元江普通野生稻 (Orzya rufipogon Griff.) 为供体亲本和籼稻品种 特青 (Oryza sativa ssp.indica) 为受体亲本构建的渗入系群体中分离了一个早熟渗入 系 YIL23， 比特青提前约 28 天抽穗， 通过图位克隆的策略克隆了该早熟基因 EMA1。分析双 亲 EMA1 基因的表达显示， 苗期 EMA1 基因在叶中的表达量逐渐升高， 到顶点后迅速降低，。

17、 但 EMA1基因在渗入系YIL23中表达量升高的速度比在特青中要快 （见图1， TQ代表特青， YIL23 代表早熟渗入系 YIL23） 。即在苗期， 渗入系 YIL23 中 EMA1 的表达比特青中 EMA1 的表达更 强， 且随着幼苗长大， 双亲中 EMA1 的表达量逐渐升高。 0032 二、 水稻新生组织特异启动子 p-EMA1 的发现 0033 由于候选基因EMA1的第1内含子长约30kb， 因此无法直接从基因组序列扩增目的 基因。我们采取如下策略进行扩增 （见图 2B） ：（1） 用 P1/P2 引物从 YIL23 的基因组 DNA 扩 增片段 1， 该片段包含 EMA1 的启动子。

18、区域 （约 ATG 上游 2kb） 、 5 UTR 和第 1 外显子的部分序 列。其中， P2 引物位于第 1 外显子 ；（2） 以 P3/P4 引物从 YIL23 的第 1 链 cDNA 扩增片段 2， 该片段包含 EMA1 ORF 的大部分序列和 3 UTR 的部分序列。其中， P3 引物与 P2 引物反向互 补 ；（3） 将扩增的片段 1 和片段 2 混合， 加入除引物外的 PCR 反应组分进行如下程序 ： 预变 性 95 C 5 分钟 ； 变性 95 C 1 分钟， 退火 55 C 1 分钟， 延伸 72 C 1 分钟， 循环 5 次 ； 过度延伸 7 分钟 ； 然后加入引物 P1/P。

19、4 进行正常的 PCR 扩增获得片段 3， 该片段包含 EMA1 的启动子区域、 5 UTR 和 ORF 序列。其中， P1 和 P4 引物的 5 端分别含有内切酶 BamHI 和 HindIII 的识别位点。将 PCR 产物进行测序， 测序结果表明， PCR 产物具有序列表的序列 1 所示的 DNA 片段。 0034 将序列表的序列 1 所示的 DNA 片段命名为 p-EMA1（新生组织特异启动子） （序列 1 中， 第 1 至 1841 位核苷酸为预测的启动子序列， 余下的核苷酸为 cDNA 序列） 。 0035 实施例 2、 p-EMA1 转基因水稻的获得及其鉴定 0036 一、 植物表。

20、达载体的构建 0037 1、 合成序列表的序列 1 所示的双链 DNA 分子。 0038 2、 以步骤 1 合成的双链 DNA 分子为模板， 用 P1 和 P4 组成的引物对进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产物。 0039 P1 ： 5 -ATGGATCC ATCACCGCAAATACTCTCCC-3 ； 0040 P4 ： 5 -GCAAGCTT ACGCAGAGATCCAGCTTATTCC-3 。 0041 P1 中， 带下划线碱基为限制性内切酶 BamHI 识别位点 ； 0042 P4 中， 带下划线碱基为限制性内切酶 HindIII 的识别位点。 0043 3、 用限制性内切酶。

21、 BamHI 和 HindIII 双酶切步骤 2 的 PCR 扩增产物， 回收酶切产 物。 0044 3、 用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切植物表达载体pCambia1381， 回收载体 说 明 书 CN 103834655 A 5 4/5 页 6 骨架 （约 10650bp） 。 0045 4、将 步 骤 2 的 酶 切 产 物 和 步 骤 3 的 载 体 骨 架 连 接，得 到 重 组 质 粒 pCambia1381-pEMA1。根据测序结果， 对重组质粒 pCambia1381-pEMA1 进行结构描述如下 ： 在植物表达载体 pCambia1381 的 BamHI 和 H。

22、indIII 酶切位点之间插入了序列表的序列 1 所 示的 DNA 片段。 0046 二、 pCambia1381-pEMA1 转基因水稻的获得 0047 1、 将水稻品种 “日本晴” 的成熟胚愈伤组织作为基因枪轰击的受体， 用基因枪将重 组质粒 pCambia1381-pEMA1 轰击到愈伤组织， 具体步骤如下 ： 0048 （1） 将水稻品种 “日本晴” 的成熟胚愈伤组织在高渗透培养基 (NB 培养基 +91.2g/ L 甘露醇 ) 上进行渗透处理 4-6h（28， 暗培养） 。 0049 （2） 用重组质粒 pCambia1381-pEMA1 包裹直径 110m 金粉， 采用 PDS-1。

23、000/He 基 因枪 （Bio-Red 公司生产 )， 选择 1100Psi 的可裂膜， 载样距靶材料 6cm 进行轰击。 0050 （3） 轰击后的愈伤组织继续在原培养基上培养 16h（28， 暗培养） 。 0051 2、 将完成步骤 1 的愈伤组织转移到恢复培养基 （NB 培养基 +2mg/L 2,4-D) 上， 恢 复培养 1 周 （28， 暗培养） 。 0052 3、 将完成步骤 2 的愈伤组织转移到筛选培养基 （NB 培养基 +50mg/L 潮霉素） 上， 28暗培养 30 天。 0053 4、 将完成步骤 3 的愈伤组织转移到筛选培养基 （NB 培养基 +50mg/L 潮霉素） 。

24、上， 28暗培养 30 天。 0054 5、 将步骤 4 得到的愈伤组织转移到预分化培养基上 （NB 培养基 +5mg/L 脱落酸 +50mg/L 潮霉素 +2mg/L 萘乙酸 +1mg/L 6- 苄氨基嘌呤） ， 28暗培养 15 天。 0055 6、 将步骤 5 得到的愈伤转到分化培养基上 （NB 培养基 +2mg/L 6- 苄氨基嘌呤 +1mg/L 萘乙酸 +1mg/L 激动素 +50mg/L 潮霉素） ， 28光照培养 15 天。 0056 7、 将步骤 6 中幼苗转移到生根培养基上 （1/2MS 培养基 +0.5mg/L 萘乙酸 +0.09g/ L 肌醇 +30g/L 蔗糖） ， 2。

25、8光照培养 30 天。 0057 8、 将步骤 7 中苗高 7-8cm 且根系发达的植株移栽到花盆， 放置于温室中培养 3 周， 成活的植株即为 T0代植株。T0代植株自交产生的种子及由它所长成的植株用 T1代表示。 0058 9、 将 T0代植株进行 PCR 鉴定 （靶序列为潮霉素抗性基因， 引物对由 1F 和 1R 组成， 靶序列约为 1000bp） ， PCR 鉴定为阳性的植株即为转基因植株。 0059 1F ： 5 -tacttctaca cagccatc-3 ； 0060 1R， 5 -cgtctgtcga gaagtttc-3 。 0061 三、 转空载体植株的获得 0062 将植。

26、物表达载体pCambia1381代替重组质粒pCambia1381-pEMA1进行步骤二的操 作， 得到转空载体植株。 0063 四、 转基因水稻的组织表达特异性分析 0064 取步骤二得到的转基因植株或步骤三得到的转空载体植株分别进行如下鉴定 ： 0065 观察染色结果发现， 正常培养 T1代植株， 在不同的发育阶段取转基因植株的幼苗 整株、 叶片和穗等进行 GUS 染色分析。萌发 5 天的幼苗的 GUS 染色照片见图 3a， 转基因幼苗 中呈现了明显的 GUS 染色， 且多集中在幼芽基部和根的生长点等部位。观察第 15 天 （生长 说 明 书 CN 103834655 A 6 5/5 页 。

27、7 15 天的幼苗） 幼苗的 GUS 染色结果见图 3b， 转基因幼苗在叶上能观察到比先前更为明显的 GUS 染色， 在新生叶上尤为显著。孕穗期的照片见图 3c-i， 在穗发育的不同时期， 转基因植 株获得的小穗 （新生穗） 均能观察到明显的 GUS 染色。 0066 因此， 无论是在苗期叶片还是在进入孕穗期的穗， p-EMA1 在新生组织和细胞旺盛 分裂的部位 （如生长点、 幼穗） 表达量较高。 0067 转空载体植株在各个相应时期的各个组织部位均不具有 GUS 表达活性。 0068 实施例 2 的实验重复进行三次， 都得到同样的结果。 说 明 书 CN 103834655 A 7 1/2 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 103834655 A 8 2/2 页 9 序 列 表 CN 103834655 A 9 1/2 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103834655 A 10 2/2 页 11 图 3 说 明 书 附 图 CN 103834655 A 11 。