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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510636105.0 (22)申请日 2015.09.30 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105085607 A (43)申请公布日 2015.11.25 (73)专利权人 河南科技大学 地址 471000 河南省洛阳市涧西区西苑路 48号 (72)发明人 张红晓张羽宋玉峰王发园 王世华 (74)专利代理机构 洛阳公信知识产权事务所 (普通合伙) 41120 代理人 罗民健 (51)Int.Cl. C07K 1/22(2006.01) C07K 14/4。
2、15(2006.01) 审查员 任长辉 (54)发明名称 一种利用蛋白变性分离特定金属结合蛋白 的方法 (57)摘要 一种利用蛋白变性分离特定金属结合蛋白 的方法， 涉及蛋白质化学领域技术领域； 该方法 首先， 取生物组织或细胞用液氮充分研磨后， 加 入蛋白提取液， 混合均匀后， 低温离心， 获得变性 的蛋白溶液； 将Ni-NTA琼脂糖中Ni替换成Cu装入 层析柱中； 将变性的蛋白溶液与Cu-NTA琼脂糖孵 育， 使变性蛋白与之充分结合； 然后低温条件下， 注入洗脱液1， 对蛋白进行复性， 并将非特异性的 铜结合蛋白洗脱出来； 然后再注入洗脱液2将特 异性的铜结合蛋白分离出来； 本发明利用琼脂。
3、 糖-NTA来分离变性条件下的铜结合蛋白， 大大提 高了铜结合蛋白的获得效率， 建立了一套适合于 过量重金属处理条件下生物组织或细胞中特定 金属结合蛋白的分离技术。 权利要求书1页 说明书6页 附图4页 CN 105085607 B 2018.05.29 CN 105085607 B 1.一种利用蛋白变性分离特定金属结合蛋白的方法， 其特征在于： 包括以下步骤： （1） 、 取生物组织或细胞用液氮充分研磨后， 加入蛋白提取液， 混合均匀后， 低温离心， 获得变性的蛋白溶液； 研磨后生物组织或细胞与蛋白提取液的固液比为： 1:4； 所述蛋白提 取液的组成成份为： 每升蛋白溶液中含50mmol/L。
4、磷酸钠， pH 7.8， 300mmol/L氯化钠， 质量百 分比为0.1-1%的Triton X-100， 8mol/L尿素， 余量为水； （2） 、 将Ni-NTA琼脂糖中Ni2+替换成Cu2+装入层析柱中； 将上述步骤 （1） 所获得的变性的 蛋白溶液以0.25ml/min流速注入Cu-NTA琼脂糖， 37条件下孵育15-40min， 使变性蛋白与 之充分结合； 然后低温条件下， 以0.25ml/min流速缓慢注入洗脱液1， 对蛋白进行复性， 并将 非特异性的铜结合蛋白洗脱出来； 然后再以0.5ml/min流速注入洗脱液2将特异性的铜结合 蛋白分离出来； 所述洗脱液1组成成份为： 每升洗。
5、脱液1中含50mmol/L磷酸钠， 300mmol/L氯化钠， 10-50 mmol/L咪唑， 余量为水； 洗脱液1的pH值为6.5； 所述洗脱液2组成成份为： 每升洗脱液2中含50mmol/L磷酸钠， 300mmol/L氯化钠， 40- 100mmol/L咪唑； 洗脱液2的pH值为5.8。 2.如权利要求1所述的利用蛋白变性分离特定金属结合蛋白的方法， 其特征在于： 步骤 （1） 中所述低温离心， 4低温下， 15000g离心30min。 3.如权利要求1所述的利用蛋白变性分离特定金属结合蛋白的方法， 其特征在于： 步骤 （2） 中所述的Ni-NTA琼脂糖购自GE Healthcare公司，。
6、 所述的将Ni-NTA琼脂糖中Ni2+替换成 Cu2+的方法为： 将2ml的Ni-NTA琼脂糖装入层析柱中， 注入10倍体积的含有0.05mol/L EDTA 和0.5mol/L氯化钠的溶液去除Ni2+， 再用3倍体积的0.5mol/L氯化钠水溶液去除EDTA， 随后1 倍体积的0.2mol/L硫酸铜水溶液室温下放置30min后用平衡缓冲液， 洗脱30min， 直到紫外 检测基线稳定； 流速均为0.5ml/min。 4.如权利要求3所述的利用蛋白变性分离特定金属结合蛋白的方法， 其特征在于： 所述 平衡缓冲液的组成成份为： 每升平衡缓冲液中含有50mmol/L磷酸钠， pH 7.8， 300m。
7、mol/L氯 化钠， 质量百分比为0.1-1%的Triton X-100， 余量为水。 5.如权利要求1所述的利用蛋白变性分离特定金属结合蛋白的方法， 其特征在于： 步骤 （2） 中所述将 （1） 中蛋白溶液和Cu-NTA琼脂糖37孵育30min， 使变性蛋白与Cu-NTA琼脂糖 充分结合。 6.如权利要求1所述的利用蛋白变性分离特定金属结合蛋白的方法， 其特征在于： 步骤 （2） 所述加入洗脱液1， 以0.25ml/min流速的洗脱， 直到紫外检测基线达到稳定； 所述加入洗 脱液2， 以0.5ml/min流速的洗脱， 直到紫外检测基线达到稳定， 收集特异性铜结合蛋白。 7.如权利要求1所述的。
8、利用蛋白变性分离特定金属结合蛋白的方法， 其特征在于： 步骤 （1） 中所述蛋白提取液的组成成份为： 每升蛋白溶液中含50mmol/L磷酸钠， pH 7 .8， 300mmol/L氯化钠， 质量百分比为0.2%的Triton X-100， 8mol/L尿素， 余量为水。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105085607 B 2 一种利用蛋白变性分离特定金属结合蛋白的方法 技术领域 0001 本发明涉及蛋白质化学领域技术领域， 具体的说是一种利用蛋白变性分离特定金 属结合蛋白的方法。 背景技术 0002 全国污染状况调查公报显示， 全国土壤污染总超标率为16.1%， 其中重金属污染占 80%。
9、以上。 土壤中的重金属大多数容易在植物体内积累， 并通过食物链危害人类的健康。 。 另 一方面， 由于蛋白质的半胱氨酸、 甲硫氨酸和组氨酸残基对二价金属离子有很高的亲和力， 因此细胞内过量的重金属可能干扰必需金属元素与蛋白的结合， 造成蛋白变性或酶失活， 干扰正常的代谢过程。 0003 固定化金属亲和层析 （IMAC） 与质谱偶联是鉴定金属结合蛋白的重要技术。 IMAC是 利用蛋白中的一些氨基酸， 如半胱氨酸、 组氨酸和色氨酸等， 能与固体柱 （如琼脂糖-IDA） 上 吸附的金属阳离子 （如Zn2+, Cu2+, Ni2+和Cd2+等） 发生结合的特性， 来分离具有该金属结合 位点的蛋白质。 。
10、但是在重金属污染环境中， 植物细胞内蛋白质的金属结合位点可能被提前 进入细胞内的金属离子占据， 使蛋白质没有多余的金属结合位点与亲和层析柱上固定金属 结合， 从而导致金属结合蛋白不能被分离或分离不完全。 更重要的是， 绝大多数蛋白的金属 结合位点存在于分子内部， 因此自然状态下， 我们很难通过IMAC方法分离到特异的金属结 合蛋白， 但是之前对金属结合蛋白的研究文献中均未对此加以考虑。 发明内容 0004 本发明目的是为解决上述技术问题的不足， 提供一种利用蛋白变性分离特定金属 结合蛋白的方法， 利用琼脂糖- NTA （氮川三乙酸） 来分离变性条件下的铜结合蛋白， 大大提 高了铜结合蛋白的获得。
11、效率， 建立了一套适合于过量重金属处理条件下组织或细胞中金属 蛋白质组的分离技术。 0005 一种利用蛋白变性分离特定金属结合蛋白的方法， 包括以下步骤： 0006 （1） 、 取生物组织或细胞用液氮充分研磨后， 加入蛋白提取液， 混合均匀后， 低温离 心， 获得变性的蛋白溶液； 研磨后生物组织或细胞与蛋白提取液的固液比为： 1:4； 所述蛋白 提取液的组成成份为： 每升蛋白溶液中含50 mmol/L磷酸钠, pH 7.8， 300mmol/L 氯化钠, 质量百分比为0.1-1% 的Triton X-100, 8mol/L尿素， 余量为水； 0007 （2） 、 将购买的Ni-NTA 琼脂糖中。
12、Ni2+替换成Cu2+装入层析柱中； 将上述步骤 （1） 所 获得的变性的蛋白溶液以0.25ml/min流速注入Cu-NTA 琼脂糖， 37条件下孵育15-40min， 使变性蛋白与之充分结合； 然后低温条件下， 以0.25ml/min流速缓慢注入洗脱液1， 对蛋白 进行复性， 将非特异性的铜结合蛋白洗脱出来； 然后再以0.5ml/min流速注入洗脱液2将特 异性的铜结合蛋白分离出来； 0008 所述洗脱液1组成成份为： 每升洗脱液1中含50 mmol/L磷酸钠， 300 mmol/L氯化 钠， 10-50 mmol/L余量为水； 洗脱液1的pH值为6.5； 说明书 1/6 页 3 CN 10。
13、5085607 B 3 0009 所述洗脱液2组成成份为： 每升洗脱液2中含50 mmol/L磷酸钠， 300 mmol/L氯化 钠， 40-100 mmol/L咪唑； 洗脱液2的pH值为5.8。 0010 步骤 （1） 中所述低温离心， 其方法优选为， 4低温下， 15000g离心30min。 0011 步骤 （2） 中所述将Ni-NTA 琼脂糖 (GE Healthcare)中Ni替换成Cu， 其方法为： 将 2ml的Ni-NTA 琼脂糖装入层析柱中， 注入10倍体积的含有0.05mol/L EDTA和0.5mol/L氯化 钠的溶液去除Ni2+， 再用3倍体积的0.5mol/L氯化钠水溶液。
14、去除EDTA， 随后1倍体积的 0.2mol/L硫酸铜水溶液室温下放置30min后用平衡缓冲液， 洗脱30 min， 直到紫外检测基线 稳定； 流速均为0.5 ml/min。 所述平衡缓冲液的组成成份为： 每升平衡缓冲液中含有50 mmol/L 磷酸钠, pH 7.8, 300 mmol/L氯化钠, 质量百分比为0.1-1% 的Triton X-100， 余 量为水。 0012 步骤 （2） 中所述将 （1） 中蛋白溶液和Cu-NTA 琼脂糖37孵育30min， 使变性蛋白与 Cu-NTA 琼脂糖充分结合。 0013 步骤 （2） 所述加入洗脱液1， 以0.25ml/min流速的洗脱， 直到紫。
15、外检测基线达到稳 定； 所述加入洗脱液2， 以0.5ml/min流速的洗脱， 直到紫外检测基线达到稳定， 收集特异性 铜结合蛋白。 0014 步骤 （1） 中所述蛋白提取液的组成成份为： 所述蛋白提取液的组成成份为： 每升蛋 白溶液中含50 mmol/L磷酸钠, pH 7.8， 300mmol/L 氯化钠, 质量百分比为0.2% 的Triton X-100, 8mol/L尿素， 余量为水。 0015 有益效果是： 0016 本发明提供的利用蛋白变性分离特定金属结合蛋白的方法， 程序简单， 大大提高 了铜结合蛋白的获得效率， 建立了一套适合于过量重金属处理条件下生物组织或细胞中金 属蛋白质组的分。
16、离技术。 本发明中的变性条件能够使蛋白多肽链处于伸展状态， 更利于与 固定金属离子的亲和吸附作用， 而在去除变性条件的蛋白质复性过程由于在磁珠表面进 行， 避免了变性蛋白的聚集沉淀， 而且形成的配合物更稳定， 保证分离到尽可能多的铜结合 蛋白。 附图说明 0017 图1是非特异性铜结合蛋白 （I） 和特异性铜结合蛋白 （II） 的紫外检测图； 0018 图2是水稻铜结合蛋白的2-DE对照图谱； 0019 图3是水稻铜结合蛋白的2-DE图谱； 0020 图4 鉴定到铜结合蛋白 （GST） 的质谱图； 0021 图中标记： con为对照； cu为铜。 具体实施方式 0022 一种利用蛋白变性分离特。
17、定金属结合蛋白的方法， 包括以下步骤： 0023 （1） 、 取生物组织或细胞用液氮充分研磨后， 加入蛋白提取液， 混合均匀后， 低温离 心， 获得变性的蛋白溶液； 研磨后生物组织或细胞与蛋白提取液的固液比为： 1:4； 所述蛋白 提取液的组成成份为： 每升蛋白溶液中含50 mmol/L磷酸钠, pH 7.8， 300mmol/L 氯化钠, 质量百分比为0.1-1% 的Triton X-100, 8mol/L尿素， 余量为水； 说明书 2/6 页 4 CN 105085607 B 4 0024 （2） 、 将购买的Ni-NTA 琼脂糖 (GE Healthcare)中Ni2+替换成Cu2+装入。
18、层析柱中； 将上述步骤 （1） 所获得的变性的蛋白溶液以0.25ml/min流速注入Cu-NTA 琼脂糖， 37条件 下孵育15-40min， 使变性蛋白与之充分结合； 然后低温条件下， 以0.25ml/min流速缓慢注入 洗脱液1， 对蛋白进行复性， 将非特异性的铜结合蛋白洗脱出来； 然后再以0.5ml/min流速注 入洗脱液2将特异性的铜结合蛋白分离出来； 0025 所述洗脱液1组成成份为： 每升洗脱液1中含50 mmol/L磷酸钠， 300 mmol/L氯化 钠， 10-50 mmol/L余量为水； 洗脱液1的pH值为6.5； 0026 所述洗脱液2组成成份为： 每升洗脱液2中含50 m。
19、mol/L磷酸钠， 300 mmol/L氯化 钠， 40-100 mmol/L咪唑； 洗脱液2的pH值为5.8。 0027 步骤 （1） 中所述低温离心， 其方法优选为， 4低温下， 15000g离心30min。 0028 步骤 （2） 中所述将Ni-NTA 琼脂糖 (购买于GE Healthcare公司)中Ni2+替换成Cu2 +， 其方法为： 将2ml的Ni-NTA 琼脂糖装入层析柱中， 注入10倍体积的含有0.05mol/L EDTA 和0.5mol/L氯化钠的溶液去除Ni2+， 再用3倍体积的0.5mol/L氯化钠水溶液去除EDTA， 随后1 倍体积的0.2mol/L硫酸铜水溶液室温下。
20、放置30min后用平衡缓冲液， 洗脱30 min， 直到紫外 检测基线稳定； 流速均为0.5 ml/min。 所述平衡缓冲液的组成成份为： 每升平衡缓冲液中含 有50 mmol/L 磷酸钠, pH 7.8, 300 mmol/L氯化钠, 质量百分比为0.1-1% 的Triton X- 100， 余量为水。 0029 步骤 （2） 中所述将 （1） 中蛋白溶液和Cu-NTA 琼脂糖37孵育30min， 使变性蛋白与 Cu-NTA 琼脂糖充分结合。 0030 步骤 （2） 所述加入洗脱液1， 以0.25ml/min流速的洗脱， 直到紫外检测基线达到稳 定； 所述加入洗脱液2， 以0.5ml/min。
21、流速的洗脱， 直到紫外检测基线达到稳定， 收集特异性 铜结合蛋白。 0031 步骤 （1） 中所述蛋白提取液的组成成份为： 所述蛋白提取液的组成成份为： 每升蛋 白溶液中含50 mmol/L磷酸钠, pH 7.8， 300mmol/L 氯化钠, 质量百分比为0.2% 的Triton X-100, 8mol/L尿素， 余量为水。 0032 本发明中提到的Cu-NTA 琼脂糖中Cu2+也可以替换为Ni2+Zn2+Cd2+等其他二价金 属离子， 从而获得相应的金属结合蛋白。 以下实施例用于解释说明本发明， 并不对本发明的 保护范围有任何形式的限定。 0033 实施例1 0034 一、 植物蛋白的提取。
22、 0035 用100 mol L-1硫酸铜处理的萌发的水稻种胚， 铜处理5天后取新鲜的水稻种胚， 用液氮充分研磨， 然后加入4倍体积的蛋白提取液充分混匀后放在4下提取30 min， 在4 下、 15,000g离心30 min， 收集上清。 用修改的Bradford法 （Ramagli， 1999） 对变性蛋白进 行定量， 以鸡卵清蛋白作为标准蛋白。 所述蛋白提取液的组成成份为： 每升蛋白溶液中含50 mmol/L磷酸钠, pH 7.8， 300mmol/L 氯化钠, 质量百分比为0.1-1% 的Triton X-100, 8mol/L尿素， 余量为水. 0036 二、 Cu-NTA琼脂糖亲和层。
23、析过程 0037 （1） 装柱： 将2 ml床体积的Ni-NTA 琼脂糖 (GE Healthcare)沿管壁加入到玻璃管 中， 待胶沉淀后将活塞推到合适的位置。 加入10倍体积的0.05mol/L EDTA和0.5mol/L氯化 说明书 3/6 页 5 CN 105085607 B 5 钠的混合溶液去除Ni2+， 再用3倍体积的0.5mol/L氯化钠去除EDTA， 然后用蒸馏水洗， 流速为 0.5 ml/min， 直到紫外检测达到稳定基线。 0038 （2） 结合Cu2+： 加入1倍床体积的0.2 mol/L 硫酸铜溶液， 室温下放置30 min， 使Cu2 +充分结合到填料上。 用平衡缓冲。
24、液洗柱子30 min， 流速为0.5 ml/min， 紫外检测基线稳定。 0039 （3） 孵育结合： 将蛋白含量为25mg的蛋白溶液和Cu-NTA sepharose在37条件下 孵育20min， 使变性蛋白与固定Cu离子充分结合； 随后用平衡缓冲液洗30 min， 流速为0.5 ml/min。 0040 （4） 复性及非特异性洗脱： 用洗脱液1 （洗脱液1的组成为： 50 mmol L磷酸钠, pH 6.5, 300 mmol/L 氯化钠, 20 mmol/L 咪唑） 洗脱， 流速为0.25 ml/min， 保证蛋白复性顺 利进行， 洗脱至30 min左右， 紫外检测示数开始增加， 开始采。
25、集图像， 收集非特异洗脱峰。 图 像采集至48 min时， 紫外检测基线已经达到稳定。 0041 （5） 特异性洗脱： 用洗脱液2 （洗脱液2的组成为： 50 mmol/L磷酸钠, pH 5.8, 300 mmol/L 氯化钠l, 60 mmol/L咪唑） 进行特异性洗脱， 流速为0.5 ml/min。 10 min后开始出 现特异性洗脱峰， 开始收集样品， 15 min后达到紫外检测基线， 停止收集样品。 图1为特异性 和非特异性铜结合蛋白的紫外检测结果。 0042 三、 特异性铜结合蛋白的2-DE分析和质谱鉴定 0043 将以上收集的特异性铜结合蛋白中加入4倍体积冰丙酮 （含10%三氯乙酸。
26、） ， 在-20 下沉淀过夜， 然后用80%冰丙酮洗沉淀23遍， 真空冻干后， 加入裂解液充分溶解， 裂解液 的组成为： 8 mol/L尿素, 4% CHAPS, 65 mmol/L DTT 和0.2% (w/v)两性电解质， 4下12, 000g离心15 min。 随后用修改的Bradford法 （Ramagli， 1999） 对变性蛋白进行定量。 取100 g总蛋白， 用裂解液稀释至300 l， 采用PROTEAN IEF CELL （Bio-Rad, USA） 等电聚焦系统， 17 cm pH 47 线性IPG胶条 （Bio-Rad, USA） 。 等电聚焦参数： 20下主动水化12 h。
27、； 20等 电聚焦， 最大电流50 mA/strip， 聚焦总Vh为60,000。 第二向SDS-PAGE在Protean Plus Dodeca cell apparatus （Bio-Rad, USA） 垂直板电泳槽中进行。 用胶体考马斯亮蓝染色方 法对胶进行染色。 考染后的胶用UMAX Powerlook III （UMAX Technologies, USA） 扫描仪进 行透射扫面， 分辨率为300 dpi。 最后取差异蛋白点进行脱色、 酶解及脱盐等程序后， 用 MALDI-TOF-TOP （Reflex III, Bruker-Daltonics） 质谱仪进行鉴定。 0044 对2-。
28、DE图谱 （图2和图3） 分析后发现， 在对照 （Con） 和铜处理 （Cu） 的2-DE图谱上分 别鉴定到4677.05和4529.13个铜结合蛋白点， 比非变性条件下鉴定的铜结合蛋白增加 了36.2%和43.1% （非变性条件下对照和铜处理的2-DE图谱上分别鉴定到2984.15和257 3.33个铜结合蛋白点） 。 对照和铜处理之间达到2倍的差异点有65个， 差异蛋白点比非变性 条件下鉴定的铜结合蛋白增加了46% （非变性条件下对照和铜处理之间达到2倍的差异点有 35个） 。 通过本发明获得的铜结合蛋白 （GST） 的质谱图见图4。 0045 实施例2 0046 一种利用蛋白变性分离特定。
29、金属结合蛋白的方法， 包括以下步骤： 0047 （1） 、 取生物组织或细胞用液氮充分研磨后， 加入蛋白提取液， 混合均匀后， 低温离 心， 获得变性的蛋白溶液； 蛋白提取液的加入量为， 研磨后生物组织或细胞与蛋白提取液的 固液比为： 1:4； 所述蛋白提取液的组成成份为： 每升蛋白溶液中含50 mmol/L磷酸钠, pH 7.8， 300mmol/L 氯化钠, 质量百分比为0.1-1% 的Triton X-100, 8mol/L尿素， 余量为水； 说明书 4/6 页 6 CN 105085607 B 6 0048 （2） 、 将购买的Ni-NTA 琼脂糖 (GE Healthcare)中Ni。
30、2+替换成Cu2+装入层析柱中； 将上述步骤 （1） 所获得的变性的蛋白溶液以0.25ml/min流速注入Cu-NTA 琼脂糖， 37条件 下孵育15-40min， 使变性蛋白与之充分结合； 然后低温条件下， 以0.25ml/min流速缓慢注入 洗脱液1， 对蛋白进行复性， 将非特异性的铜结合蛋白洗脱出来； 然后再以0.5ml/min流速注 入洗脱液2将特异性的铜结合蛋白分离出来； 0049 所述洗脱液1组成成份为： 每升洗脱液1中含50 mmol/L磷酸钠， 300 mmol/L氯化 钠， 10-50 mmol/L余量为水； 洗脱液1的pH值为6.5； 0050 所述洗脱液2组成成份为： 每。
31、升洗脱液2中含50 mmol/L磷酸钠， 300 mmol/L氯化 钠， 40-100 mmol/L咪唑； 洗脱液2的pH值为5.8。 0051 步骤 （1） 中所述低温离心， 其方法优选为， 4低温下， 15000g离心30min。 0052 步骤 （2） 中所述将Ni-NTA 琼脂糖 (购买于GE Healthcare公司)中Ni2+替换成Cu2 +， 其方法为： 将2ml的Ni-NTA 琼脂糖装入层析柱中， 注入10倍体积的含有0.05mol/L EDTA 和0.5mol/L氯化钠的溶液去除Ni2+， 再用3倍体积的0.5mol/L氯化钠水溶液去除EDTA， 随后1 倍体积的0.2mol。
32、/L硫酸铜水溶液室温下放置30min后用平衡缓冲液， 洗脱30 min， 直到紫外 检测基线稳定； 流速均为0.5 ml/min。 所述平衡缓冲液的组成成份为： 每升平衡缓冲液中含 有50 mmol/L 磷酸钠, pH 7.8, 300 mmol/L氯化钠, 质量百分比为0.1-1% 的Triton X- 100， 余量为水。 0053 步骤 （2） 中所述将 （1） 中蛋白溶液和Cu-NTA 琼脂糖37孵育30min， 使变性蛋白与 Cu-NTA 琼脂糖充分结合。 0054 步骤 （2） 所述加入洗脱液1， 以0.25ml/min流速的洗脱， 直到紫外检测基线达到稳 定； 所述加入洗脱液2，。
33、 以0.5ml/min流速的洗脱， 直到紫外检测基线达到稳定， 收集特异性 铜结合蛋白。 0055 步骤 （1） 中所述蛋白提取液的组成成份为： 所述蛋白提取液的组成成份为： 每升蛋 白溶液中含50 mmol/L磷酸钠, pH 7.8， 300mmol/L 氯化钠, 质量百分比为0.2% 的Triton X-100, 8mol/L尿素， 余量为水。 0056 实施例3 0057 一种利用蛋白变性分离特定金属结合蛋白的方法， 包括以下步骤： 0058 （1） 、 取生物组织或细胞用液氮充分研磨后， 加入蛋白提取液， 混合均匀后， 低温离 心， 获得变性的蛋白溶液； 蛋白提取液的加入量为， 研磨后。
34、生物组织或细胞与蛋白提取液的 固液比为： 1:4； 所述蛋白提取液的组成成份为： 每升蛋白溶液中含50 mmol/L磷酸钠, pH 7.8， 300mmol/L 氯化钠, 质量百分比为0.2% 的Triton X-100, 8mol/L尿素， 余量为水； 0059 （2） 、 将购买的Ni-NTA 琼脂糖 (GE Healthcare)中Ni替换成Cu装入层析柱中； 将 上述步骤 （1） 所获得的变性的蛋白溶液以0.25ml/min流速注入Cu-NTA 琼脂糖， 37条件下 孵育15-40min， 使变性蛋白与之充分结合； 然后低温条件下， 以0.25ml/min流速缓慢注入洗 脱液1， 对蛋。
35、白进行复性， 将非特异性的铜结合蛋白洗脱出来； 然后再以0.5ml/min流速注入 洗脱液2将特异性的铜结合蛋白分离出来； 0060 所述洗脱液1组成成份为： 每升洗脱液1中含50 mmol/L磷酸钠， 300 mmol/L氯化 钠， 20mmol/L余量为水； 洗脱液1的pH值为6.5； 0061 所述洗脱液2组成成份为： 每升洗脱液2中含50 mmol/L磷酸钠， 300 mmol/L氯化 说明书 5/6 页 7 CN 105085607 B 7 钠， 60mmol/L咪唑； 洗脱液2的pH值为5.8。 0062 步骤 （1） 中所述低温离心， 其方法优选为， 4低温下， 15000g离心。
36、30min。 0063 步骤 （2） 中所述将Ni-NTA 琼脂糖 (购买于GE Healthcare公司)中Ni替换成Cu， 其 方法为： 将2ml的Ni-NTA 琼脂糖装入层析柱中， 注入10倍体积的含有0.05mol/L EDTA和 0.5mol/L氯化钠的溶液去除Ni2+， 再用3倍体积的0.5mol/L氯化钠水溶液去除EDTA， 随后1倍 体积的0.2mol/L硫酸铜水溶液室温下放置30min后用平衡缓冲液， 洗脱30 min， 直到紫外检 测基线稳定； 流速均为0.5 ml/min。 所述平衡缓冲液的组成成份为： 每升平衡缓冲液中含有 50 mmol/L 磷酸钠, pH 7.8, 。
37、300 mmol/L氯化钠, 质量百分比为0.1-1% 的Triton X- 100， 余量为水。 0064 步骤 （2） 中所述将 （1） 中蛋白溶液和Cu-NTA 琼脂糖37孵育30min， 使变性蛋白与 Cu-NTA 琼脂糖充分结合。 0065 步骤 （2） 所述加入洗脱液1， 以0.25ml/min流速的洗脱， 直到紫外检测基线达到稳 定； 所述加入洗脱液2， 以0.5ml/min流速的洗脱， 直到紫外检测基线达到稳定， 收集特异性 铜结合蛋白。 0066 步骤 （1） 中所述蛋白提取液的组成成份为： 所述蛋白提取液的组成成份为： 每升蛋 白溶液中含50 mmol/L磷酸钠, pH 7.8， 300mmol/L 氯化钠, 质量百分比为0.2% 的Triton X-100, 8mol/L尿素， 余量为水。 说明书 6/6 页 8 CN 105085607 B 8 图1 说明书附图 1/4 页 9 CN 105085607 B 9 图2 说明书附图 2/4 页 10 CN 105085607 B 10 图3 说明书附图 3/4 页 11 CN 105085607 B 11 图4 说明书附图 4/4 页 12 CN 105085607 B 12 。