抗肌抑制素抗体.pdf

在人肌抑制素的成熟形式的氨基酸40-64内鉴定了中和表位。相对于与GDF-11的结合，结合该表位的抗体以高亲和力优先结合GDF-8，所述抗体可以是嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体、抗体的免疫连接物或其抗原结合片段。本发明的抗体用于增加肌肉质量、增加骨的密度或在哺乳动物和禽类物种中用于治疗多种病症。

1.抗肌抑制素单克隆抗体，其包含轻链可变区LCVR和重链可变区HCVR，其中所述LCVR包含：a)如SEQ ID NO：27所示的CDRL1，b)如SEQ ID NO：30所示的CDRL2，和c)如SEQ ID NO：31所示的CDRL3，并且其中所述HCVR包含：a)如SEQ ID NO：37所示的CDRH1，b)如SEQ ID NO：43所示的CDRH2，c)如SEQ ID NO：48所示的CDRH3。 2.抗肌抑制素单克隆抗体，其包含轻链可变区LCVR和重链可变区HCVR，其中所述LCVR包含：a)如SEQ ID NO：27所示的CDRL1，b)如SEQ ID NO：30所示的CDRL2，和c)如SEQ ID NO：33所示的CDRL3，并且其中所述HCVR包含：a)如SEQ ID NO：36所示的CDRH1，b)如SEQ ID NO：45所示的CDRH2，c)如SEQ ID NO：51所示的CDRH3。 3.抗肌抑制素单克隆抗体，其包含如SEQ ID NO：10所示的LCVR和如SEQ ID NO：26所示的HCVR。 4.权利要求1到3任一项的单克隆抗体，其中所述抗体是全长抗体或Fab片段。 5.阻断GDF-8活性的药物组合物，其包含权利要求1到4任一项的抗体和可药用的载体。

发明领域

本发明在药物领域内，特别是抗肌抑制素的单克隆抗体的领域内。更 具体地本发明涉及与GDF-11相比优先结合肌抑制素的高亲和力嵌合抗肌 抑制素抗体、人源化抗肌抑制素抗体或人抗肌抑制素抗体以及抗体用于治 疗、预防或诊断哺乳动物和禽类物种中的多种疾病或病症的用途。

发明背景

转化生长因子β(TGF-β)蛋白质超家族的成员参与胚胎发育和成年组 织的体内稳态。TGF-β超家族成员共有共同的结构，包括蛋白质的分泌所 需要的肽信号序列和氨基末端片段，所述氨基末端片段是从大的前体蛋白 质的羧基末端蛋白水解切割的大约105-140个氨基酸，从而产生成熟蛋白。 成熟蛋白的特征在于高度保守的半胱氨酸残基，而成熟蛋白的活性形式是 经蛋白水解切割的前蛋白的二硫键连接的同型二聚体(Gray，A.，和Maston， A.，Science，247：1328，1990)。

肌抑制素，也称作生长分化因子8(GDF-8)，是TGF-β蛋白质超家族的 成员。肌抑制素与其他TGF-β家族成员共有结构相似性。其包含充当分泌 信号的疏水性氨基末端和对于蛋白酶解加工是重要的保守的RSRR结构 域。蛋白质切割产生氨基末端潜在相关肽(latency associated peptide)和 形成生物活性的同型二聚体的羧基末端成熟信号肽。肌抑制素主要在发育 中的和成年的骨骼肌中表达并且作用为骨骼肌的负调节剂。成年小鼠中肌 抑制素的全身性过量表达导致肌萎缩(Zimmers，等人，Science， 296：1486-1488，2002)，然而相反地，肌抑制素敲除小鼠的特征在于为骨骼 肌的肥大和过度增生，从而导致比它们的野生型同胞仔(littermate)大2 至3倍的肌肉质量以及脂肪积累的减少(McPherron，等人Nature， 387：83-90，1997)。已报导具有肌抑制素敲除突变的人与严重的肌肥厚 (muscle hypertrophy)相关(Scheulke，等人，New Eng.J.Med.350：2682， 2004)。

目前可获得的用于治疗肌萎缩或将受益于肌肉质量和/或肌肉力量的 增加的疾病或病症(包括，例如肌营养不良、虚弱、废用性萎缩和恶病质 以及与肌萎缩关联的疾病例如肾病、心力衰竭或疾病和肝病)的疗法非常 有限。由于其作为骨骼肌生长的负调节剂的作用，肌抑制素是用于治疗或 预防干预此类疾病或病症或监控此类疾病或病症的进程的希望的靶。除了 其在骨骼肌调节中的直接作用外，肌抑制素还可以参与其他的生理过程， 包括前脂肪细胞(preadipocyte)至脂肪细胞的分化(Kim等人BBRC， 281：902-906，2001)和间接参与葡萄糖的体内稳态(McPherron，A和Lee S-J. JCI 109：595，2002)以及骨形成的抑制(Hamrick，M.Mol.Cell Evol.Biol. 272 388-91，2003；Hamrick等人Calcif Tissue Int.71：63，2002)。因此，肌 抑制素特异性拮抗剂例如肌抑制素特异性抗体也可证明在治疗、预防或监 控疾病或病症例如受益于增加骨的密度的疾病或病症(例如骨质疏松症)、 II型糖尿病、代谢综合征、肥胖症和骨关节炎中是有用的。

肌抑制素是跨物种高度保守的；人、小鼠、大鼠、鸡、火鸡和家牛中 的肌抑制素的成熟形式的氨基酸序列是100％的同一(参见图2和3)。在牛 中存在天然发生的肌抑制素突变，该突变与肌肉加倍的表型关联 (McPherron，等人PNAS，94：12457-61，1997)。由于肌抑制素在序列和功能 上是跨物种高度保守的，因此抗肌抑制素抗体不仅在人中而且还在其他哺 乳动物(包括，例如家养动物(例如，狗和猫)、运动动物(例如，马)、 食物来源动物(例如，牛、猪和羊))以及在禽类物种(例如，鸡、火鸡、 鸭和其他猎禽和家禽)中提供了增加肌肉质量、或治疗或预防上面所列的 此类疾病或病症的具有前景的方法。

生长分化因子11，也称作GDF-11或BMP-11，是与肌抑制素最同源的 TGF-β蛋白质超家族的成员。人肌抑制素的成熟形式与GDF-11的氨基酸 序列具有大约90％的同一性；然而，GDF-11相对于GDF-8在更广泛的组 织中表达，包括牙髓、脑、心脏、肾脏和肺以及肌肉和脂肪组织(Nakashima， 等人Mech.of Development 80：185，1999)。GDF-11敲除小鼠具有多种畸 形而在出生后24小时内死亡。特别地，小鼠展示额外的肋骨对、缺少肾脏 和显示胃、脾和胰脏的缺陷(McPherron等人，Nature Genetics 22：260，1999； Esquela和Lee，Dev.Biol.257：356，2003；Harmon等人，Devpt.131：6163， 2004)。最近发现人GDF-11控制时间窗(temporal window)，在所述时 间窗期间多能祖先保持产生不同的神经后代的能力(Kim，J.等人Science 308：1927-1930，2005)。

为了使肌抑制素拮抗剂对另一种TGF-β蛋白质超家族的结合引起的不 希望的副作用减少至最低程度，存在对特异性抑制肌抑制素的活性同时不 抑制或最低限度地抑制其他TGF-β超家族蛋白质特别是GDF-11的活性的 治疗性需要。此外，存在对抗肌抑制素抗体的需要，所述抗体不与另一种 TGF-β超家族蛋白质特别是GDF-11交叉反应或与其发生最低限度的交叉 反应，从而更精确地监控或确定样品中的肌抑制素的水平。此外，存在对 肌抑制素特异性抗体的需要，所述抗体以高亲和力特异性地和优先地结合 肌抑制素，从而允许患者接受的剂量水平被减少至最低，因而这可使使用 这样的抗体的给药频率比使用以更低的亲和力(即，更高的KD)与肌抑制素 结合的抗体的给药频率更低。高亲和力抗体也是想要的，因为其可以使给 患者施用抗体的途径更灵活，因为例如相对于皮下施用，静脉内施用的药 物是较不想要的。为了产生具有最低有效治疗剂量的治疗性抗肌抑制素抗 体，也存在对在生物活性测定法中具有较低的或有利的IC50值的肌抑制素 特异性抗体的需要。也希望提供对于肌抑制素是特异性的抗体，其中由患 者接受该抗体诱发的对该抗体的任何免疫反应减少至最小。本发明满足这 些需要和提供相关的有利方面。

发明概述

本发明的抗体是拮抗或中和与肌抑制素或其部分相关的至少一种体外 或体内生物学活性或性质的嵌合的、人源化的或完全人的抗肌抑制素单克 隆抗体和其抗原结合部分。

在一个实施方案中，特异性和/或优先结合肌抑制素的本发明的抗体与 GDF-11的反应性显著低于与肌抑制素的反应性，即，如通过本领域内的 技术例如通过竞争ELISA或通过BIACORE或KINEXA测定法测量的， 本发明的单克隆抗体与肌抑制素的结合比其与GDF-11的结合至少高大约 2、3、5、10、20、22、24或25倍，从而证明抗体对GDF-8的亲和力比 对GDF-11的亲和力更高(即，更低的KD)。最优选本发明的抗体，当以 Fab的形式表达时，在本领域内可获得的任何结合测定法中不以高于背景 的水平结合GDF-11。优选本发明的抗体在横跨成熟肌抑制素的氨基酸 40-64[对于人为ANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQA]、43-57[对于人 为CSGECEFVFLQKYPH或CSGESEFVFLQKYPH]和/或45-59[对于人 GECEFVFLQKYPHTH]的结构域内特异性结合肌抑制素或它们特异性结 合由成熟的肌抑制素的氨基酸40-64、43-57和/或氨基酸45-59组成的多肽。

在一个实施方案中，本发明的抗体在体外肌抑制素/SBE报告基因测定 法中具有低于或等于大约25nM、20nM、16nM、14nM、10nM、9nM、 6nM或5.2nM的IC50(参见实施例6)。优选地，本发明的此类抗体的进一 步特征在于它们与GDF-11的反应性显著低于与GDF-8的反应性，即，如 通过本领域内的技术例如通过竞争ELISA或通过BIACORE或KINEXA 测定法测量的，其对肌抑制素的结合比其对GDF-11的结合至少高大约2、 3、5、10、20、22、24或25倍，从而证明抗体对GDF-8的亲和力比对 GDF-11的亲和力更高(即，更低的KD)。且甚至更优选它们在横跨成熟的 肌抑制素的氨基酸40-64、43-57和/或45-59的结构域内结合肌抑制素或它 们结合由成熟肌抑制素的氨基酸40-64、43-57和/或45-59组成的多肽。

在一个实施方案中，本发明的抗体的特征在于对于肌抑制素的强结合 亲和力(KD)，即，低于大约3×10-8M、1×10-8M或1×10-9M，优选低于大 约9×10-10M、8.7×10-10M或最优选低于大约8×10-11M。可选择地，本发 明的抗体的特征在于肌抑制素的KD不大于大约3×10-8M、1×10-8M、1×10-9M或9×10-10M，更优选不大于大约8.7×10-10M和最优选不大于大约8×10-11M。优选，本发明的抗体的特征在于在体外肌抑制素/SBE报告基因测定中 上述的强结合亲和力也具有低于25nM、20nM、16nM、14nM、10nM、 9nM、6nM或5.2nM的IC50和/或与GDF-11的反应性显著低于与GDF-8 的反应性。甚至更优选它们在横跨成熟的肌抑制素的氨基酸40-64、43-57 和/或45-59的结构域内结合肌抑制素和/或它们结合由成熟的肌抑制素的 氨基酸40-64、43-57和/或45-59组成的多肽。

在另一个实施方案中，本发明的抗肌抑制素单克隆抗体包含具有选自 SEQ ID NO：5-12的氨基酸序列的轻链可变区(“LCVR”)多肽。在另一个实 施方案中，本发明的抗肌抑制素单克隆抗体包含具有选自SEQ ID NO： 13-26、55和56的氨基酸序列的重链可变区(“HCVR”)多肽。与各SEQ ID 号相关的序列示于此处的图5-9。

在另一个实施方案中，如通过本领域可获得的测定法(例如，竞争 ELISA)所证明的，本发明的单克隆抗体是可与竞争抗体竞争对人肌抑制素 的结合的抗体，其中竞争抗体包含两个具有选自：(i)SEQ ID NO：5和15， (ii)SEQ ID NO：5和16，以及(iii)SEQ ID NO：10和26的序列的多肽。优 选，与上面定义的竞争抗体竞争的本发明的抗体的另外的特征在于相对于 其与GDF-11的结合，其优先结合GDF-8；甚至更优选它们在横跨成熟的 肌抑制素的氨基酸40-64、43-57和/或45-59的结构域内结合肌抑制素和/ 或它们结合由成熟肌抑制素的氨基酸40-64、43-57和/或45-59组成的多肽。 优选，与上面定义的竞争抗体竞争的本发明的抗体的另外的特征在于具有 不高于大约3×10-8M、1×10-8M、1×10-9M或9×10-10M、8.7×10-10M或 8×10-11M的肌抑制素的KD。优选，与上面定义的竞争抗体竞争的本发明 抗体的另外的特征在于在体外肌抑制素/SBE报告基因测定中具有低于25 nM、20nM、16nM、14nM、10nM、9nM、6nM或5.2nM的IC50。

在一个实施方案中，本发明的抗肌抑制素抗体具有重链和轻链可变 区，其中重链可变区包含具有下列氨基酸序列的CDR区：CDRH1(SEQ ID NO：59)、CDRH2(SEQ ID NO：60)和CDRH3(SEQ ID NO：61)；和/ 或其中轻链可变区包含具有下列氨基酸序列的CDR区：CDRL1(SEQ ID NO：57)、CDRL2(SEQ ID NO：30)和CDRL3(SEQ ID NO：58)。

本发明的抗肌抑制素单克隆抗体可另外包含选自人(或基本上人来源 的)IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM和IgD，优选IgG1或IgG4的重链恒定区。本发明的抗肌抑制素单克隆抗体可以另外包含人κ或λ轻 链恒定区。当将抗体用作人的治疗剂时，恒定区优选基本上是人来源的。 当将抗体用作非人动物或非人动物的卵的治疗剂时，恒定区优选基本上来 源于其中将该抗体用作治疗剂的动物。(参见，例如，Clarkson，C.等人，Mol. Imm.30：1195-1204，1993；美国申请号2002/01651350；和Genbank登录 号X69797、U03778、X16701、X07174、AB016711)。

此处涉及不同的抗体形式。例如，本发明的抗肌抑制素单克隆抗体可 包含或由完整的抗体(即，全长，具有完整Fc区的)、基本上完整的抗体、 其抗原结合部分(例如，Fab、Fab’、F(ab′)2)或单链Fv片段组成。要理解 此处所有此类抗体形式都包含在本文中以及在术语“抗体”内。此外，可用 可检测的标记对本发明的抗体进行标记，将其固定在固相上和/或与异源化 合物例如酶或聚乙二醇分子缀合。此外，本发明的抗体被认为是“单克隆 的”，即使它们在糖基化模式上可以不同。

此处涉及本发明的单克隆抗体的诊断、治疗和预防性用途。在一个诊 断应用中，本发明提供了用于确定肌抑制素蛋白质的存在和/或定量的方 法，该方法包括将怀疑包含肌抑制素蛋白质的受试样品暴露于本发明的抗 肌抑制素抗体，并且确定该抗体对样品的特异性结合。通过将受试样品的 值与标准曲线进行比较，可将本发明的抗肌抑制素抗体用于确定受试样品 中肌抑制素的水平，标准曲线是通过使用本领域可获得的任何方法例如 ELISA测定法将所述抗体与具有已知量的肌抑制素的样品结合来产生的。 本发明还提供了包含本发明的抗体和优选使用抗体检测例如受试样品中的 肌抑制素的说明书的试剂盒。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含本发明的抗肌抑制素单克隆 抗体的药物组合物。本发明的药物组合物还可包含可药用的载体。在所述 药物组合物中，本发明的抗肌抑制素单克隆抗体是活性成分。优选药物组 合物包含同质的或基本上同质的本发明的抗肌抑制素单克隆抗体的群体。 用于治疗用途的组合物是无菌的和可以是冻干的(优选补充以合适的稀释 剂)。

本发明提供了在需要其的动物，优选哺乳动物或禽类物种，优选人中 抑制至少一种肌抑制素的生物学活性的方法，其包括对所述哺乳动物或禽 类物种施用治疗有效量的、或预防有效量的或中和肌抑制素或抑制肌抑制 素的量的本发明的抗肌抑制素单克隆抗体。本发明还提供了增加肌肉质量 或治疗或预防通过中和或拮抗肌抑制素生物学活性而改善的疾病或障碍或 病症的方法，该方法包括对需要该治疗或预防的患者(例如，人)施用治 疗或预防有效量的本发明的单克隆抗体。

本发明包括用于药物制造的本发明的抗肌抑制素单克隆抗体，所述药 物用于给哺乳动物(优选人)施用，通过对所述哺乳动物施用治疗有效量 或预防有效量的本发明的抗肌抑制素单克隆抗体在需要其的哺乳动物(优 选人)中治疗例如，虚弱、恶病质、年龄相关少肌症(age-related sarcopenia)、肌萎缩或肌无力、肌病、肌营养不良、骨质疏松症、肥胖 症、COPD、肾衰竭或疾病、肝衰竭或疾病、心力衰竭或疾病、代谢综合 征和II型糖尿病。

本发明包括制造品，所述制造品包含包装材料和包括在所述包装材料 内的本发明的抗体，其中包装材料包含优选指明抗体特异性中和或拮抗肌 抑制素活性或减少肌抑制素水平的药品说明书。任选地，药品说明书还标 明抗体通过优先结合肌抑制素(相对于与GDF-11的结合)，优先中和或 拮抗肌抑制素的活性(相对于GDF-11的活性)或相对于减少GDF-11的 水平，优先减少肌抑制素的水平。

本发明还提供了编码本发明的抗体的核酸；包含该核酸的一个载体(或 多个载体)，所述核酸任选地与被用该载体转化的宿主细胞识别的控制序 列有效连接；包含该载体的宿主细胞；用于产生本发明的抗体的方法，其 包括培养宿主细胞以使核酸表达和任选地从宿主细胞培养基回收抗体。

附图概述

图1显示人肌抑制素的氨基酸序列，其信号序列以下划线标示，位于 羧基末端的形成肌抑制素的成熟形式单体的蛋白质部分以粗体字母标示。

图2显示单体人成熟的肌抑制素的氨基酸序列。活性人肌抑制素是通 过二硫键结合的该多肽的同型二聚体。本发明的抗原表位以下划线标示。 该序列与小鼠、大鼠、鸡、火鸡、狗、马和猪的成熟的肌抑制素的序列同 一。

图3显示多种哺乳动物和禽类物种的成熟的肌抑制素的氨基酸序列 的比对。

图4显示人肌抑制素与人GDF-11的成熟形式的氨基酸序列的比对， 本发明的抗原表位以下划线标示，抗原表位中肌抑制素和GDF-11之间相 异的残基以粗体印刷。

图5显示具有VH2-70构架的HCVR的氨基酸序列的比对。CDR结 构域以粗体印刷。

图6显示具有VH4-39构架的HCVR的氨基酸序列的比对。CDR结 构域以粗体印刷。

图7和8显示具有O2构架的LCVR的氨基酸序列的比对。CDR结 构域以粗体印刷。

图9显示本发明的多种抗体的LCVR和HCVR的CDR的氨基酸序列。

图10显示多种鼠类抗肌抑制素抗体的LCVR的氨基酸序列，其任一 可以是本发明的抗体的示例性亲本分子(parent molecule)。参见此处引 用的美国申请60/559,621和60/555,456。

图11显示多种鼠类抗肌抑制素抗体的HCVR的氨基酸序列，其任一 可以是本发明的抗体的示例性亲本分子。参见美国专利申请60/559,621和 60/555,456。

发明详述

本发明提供能够特异性结合哺乳动物或禽类肌抑制素(前蛋白或成熟 蛋白或其部分；单体或同型二聚体)的抗肌抑制素单克隆抗体，其中抗体 另外表征为能够在体外和/或体内中和或拮抗至少一种肌抑制素的活性的 嵌合抗体、人源化抗体或完全的人抗体或其抗原结合部分；优选在肌抑制 素/SBE报告基因测定中显示低于大约25nM、20nM、16nM、14nM、 10nM、9nM、6nM或5.2nM的IC50和/或优选显示与肌抑制素的高结合 亲和力。本发明的抗体另外的特征在于它们在横跨肌抑制素的成熟形式的 残基40-64的氨基酸(例如，SEQ ID NO：53)的结构域内结合肌抑制素并且 与肌抑制素的最接近的同源物GDF-11的反应显著更低。

定义

当在此处使用时，术语“成熟的肌抑制素”(对于人、鼠类、大鼠、鸡、 火鸡、狗、马和猪物种参见SEQ ID NO：2)是指在肌抑制素的375个氨基 酸的前蛋白形式的Arg 266处蛋白水解切割后产生的蛋白质的单体或同型 二聚体形式。当在此处使用时，术语“肌抑制素”是指成熟肌抑制素。当在 此处使用时，术语“前肌抑制素(promyostatin)”或“肌抑制素的前蛋白形 式”，当用于指人蛋白时，是指包含SEQ ID NO：1中显示的序列、作为单 体或同型二聚体的蛋白质。

全长抗体(当其天然存在时)是由通过二硫键互相连接的4条肽链(2 条重(H)链(当全长时大约为50-70kDa)和2条轻(L)链(当全长时大 约为25kDa))组成的免疫球蛋白分子。各条链的氨基末端部分包含大约 100-110或更多个氨基酸的主要负责抗原识别的可变区。各条链的羧基末端 部分确定了主要负责效应子作用的恒定区。

轻链分类为κ或λ链并且由本领域内已知的特定恒定区表征。重链分 类为γ、μ、α、δ、ε链，并将抗体的同种型分别定义为IgG、IgM、IgA、 IgD和IgE，这些同种型中的几种可另外的分为亚类(同种型)例如，IgG1、 IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。各重链类型的特征在于本领域内已知的 特定恒定区。不同种类的抗体的亚基结构和三维构型在本领域内是熟知的。 各重链由N末端重链可变区(在此处为“HCVR”)和重链恒定区组成。对于 IgG、IgD和IgA，重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2和CH3)组成；和 对于IgM和IgE，由4个结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)组成。各轻链 由轻链可变区(在此处为“LCVR”)和轻链恒定区CL组成。HCVR和LCVR 区域可另外被再分成其间散布更加保守的称为构架区(FR)的区域的高变 区(称为互补性决定区域(CDR))。各HCVR和LCVR由3个CDR和4 个FR组成，从氨基末端至羧基末端按下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、 CDR2、FR3、CDR3、FR4。此处重链的3个CDR称为“CDRH1、CDRH2 和CDRH3”，轻链的3个CDR称为“CDRL1、CDRL2和CDRL3”。CDR 包含大多数与抗原形成特异性相互作用的残基。按照熟知的常规[例如， Kabat，“Sequences of Proteins of Immunological Interest，”National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)或Al-Lazikani等人，J.Mol.Biol. 273：927-948，1997中描述的Chothia编号方案，也参见国际互联网网址 http:www.rubic.rdg.ac.uk/～andrew/bioinf.org/abs]来将氨基酸分配至各 链。抗体结合特定抗原的功能能力极大地受到6个CDR的影响。

关于本发明的抗肌抑制素单克隆抗体(或简单地，“本发明的单克隆抗 体”)，术语“抗体”，如此处所用的，是指单克隆抗体。除非此处另外指出， 此处所用的术语“单克隆抗体”是指嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。 优选本发明的单克隆抗体存在于同质的或基本上同质的群体中。可使用例 如本领域内熟知的杂交瘤技术以及重组技术、噬菌体展示技术、合成技术 或此类技术的组合或本领域内熟知的其他技术产生发明的单克隆抗体。“单 克隆抗体”是指从单个拷贝或克隆(包括例如任何真核、原核或噬菌体克隆) 产生的抗体，而不是借以产生其的方法。“单克隆抗体”可以是完整的抗体 (包含完整的或全长的Fc区)、基本上完整的抗体或抗体的包含抗原结合 部分的部分或片段，例如，嵌合抗体、人源化抗体或人抗体的Fab片段、 Fab’片段或F(ab’)2片段。

各轻链/重链对的可变区形成了抗体的抗原结合位点。因此，完整的IgG 抗体具有两个结合位点。除了在双功能或双特异性抗体中外，两个结合位 点相同。如此处所用的，“抗原结合部分”或“抗原结合区”或“抗原结合片段” 此处可互换，表示可变区内抗体分子部分，其包含与抗原相互作用和赋予 抗体对于抗原的其特异性和亲和力的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包 括保持抗原结合残基的恰当构象所必需的构架氨基酸残基。优选，本发明 的抗体的抗原结合区的CDR或完整的抗原结合区是鼠类来源的或基本上 是鼠类来源的，其中某些氨基酸残基被改变以提高特定的活性(参见，例 如，图9)。优选，本发明抗体的构架区是人来源的或基本上是人来源的 (至少85％、90％、95％、97％或99％的人来源)。在另一个实施方案中， 抗原结合区或抗原结合区的CDR可来源于其他非人物种，包括但不限于 兔子、大鼠或仓鼠。在其他实施方案中，抗原结合区可以完全是人来源的 或基本上是人源的，其具有某些氨基酸残基经改变以提高特定的活性例如 亲和力或特异性(参见，例如，图9的以粗体印刷和下划线标示的氨基酸 位置)。

此外，此处所用的“单克隆抗体”可以是可通过用连接体序列连接编码 LCVR和HCVR的DNA产生的单链Fv片段。(参见，Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore 编著，Springer-Verlag，New York，第269-315页，1994)。要理解无论是指 定片段或部分，此处所用的术语“抗体”包括这样的片段或部分以及单链形 式。只要蛋白质保持特异性或优先结合其预期的靶(即，表位或抗原)的能 力，其就可包含在术语“抗体”的范围内。

“单克隆抗体的群体”是指同质的或基本上同质的抗体群体(即，群体中 至少大约85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％， 更优选至少大约97％或98％或最优选至少99％的抗体在ELISA测定中竞 争相同的抗原或表位)。抗体可以被或可以不被糖基化并且仍然可落于本 发明的范围内。如果单克隆抗体具有同一的氨基酸序列，尽管它们可以在 翻译后修饰例如糖基化模式中不同，但它们可以是同质的。

“变体”抗肌抑制素抗体，此处是指通过在亲本抗体序列中添加、缺失 和/或取代一个或多个氨基酸残基而导致在氨基酸序列上与“亲本”抗肌抑 制素抗体的氨基酸序列不同的分子。在优选实施方案中，变体在亲本抗体 的一个或多个CDR区中包含一个或多个氨基酸取代。例如，变体可在亲 本抗体的一个或多个CDR区中包含至少一个(例如，从大约1至大约10 个，和优选从大约2至大约5个)取代。关于变体序列的同一性或同源性， 此处定义为在比对序列和如果需要引入空位(以获得最大的百分数序列同 一性)后，变体序列中与亲本抗体的残基相同的氨基酸残基的百分数。抗 体序列中的N末端、C末端或内部的延伸、缺失或插入不应当解释为影响 序列的同一性或同源性。变体保留了结合肌抑制素的能力并且优选具有优 于亲本抗体的性质。例如，变体在SBE/报告基因测定中可以具有更强的结 合亲和力、更低的IC50或增强的抑制肌抑制素的生物学活性的能力。此处 特定目的变体抗体是当与亲本抗体相比时，在生物活性上展示至少大约2 倍、5倍，优选至少大约10倍，和更优选至少大约20、30或50倍增强的 抗体。

此处的“亲本”抗体是由用于变体的制备的氨基酸序列编码的抗体。亲 本抗体可以具有鼠类构架区，但优选具有人构架区。亲本抗体可以是鼠类 (参见，例如，此处的图10和11)抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗 体。

此处所用的术语“特异性结合是指这样的情况，其中特定结合对的一个 成员不显著地结合除了其特异性结合伴侣外的分子(即，低于大约35％、 33％、30％、20％或10％的交叉反应性)，如可通过本领域的技术例如通过 竞争ELISA或通过使用BIACORE或KINEXA测定法测量KD测得的。 当例如本发明抗体的抗原结合结构域对于许多抗原具有的特定表位是特异 性的，也可使用该术语，在该情况下，具有抗原结合结构域的特异性抗体 将能够特异性结合具有该表位的不同抗原。因此，本发明的单克隆抗体特 异性结合位于肌抑制素的成熟形式的氨基酸40-64、43-57和/或45-59内的 表位。

此处使用的术语“优先结合”是指这样的情况，其中抗体对特异性抗原 的结合，如通过本领域的技术例如通过竞争ELISA或通过使用BIACORE 或KINEXA测定法测量KD测量的，比其对不同的抗原的结合大至少大约 2、3、5、10、20、22、24或25倍。因此，本发明的单克隆抗体相对于对 GDF-11的结合优先结合GDF-8。类似地，抗体可优先于相同抗原内的不 同表位而与抗原内的一个表位优先结合。

术语“表位”是指分子的能够被抗体在一个或多个抗体的抗原结合区域 识别和结合的部分。表位通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或糖 的侧链组成并且具有特定的三维结构特征和特定的电荷特征。“抑制性表 位”和/或“中和表位”)是指当在完整分子(在本案中，肌抑制素)的背景 中时和当被对于该表位是特异性的抗体所结合时在体内或体外导致分子或 包含该分子的生物的生物学活性的丧失或减小的表位。

术语“表位”，如此处所用的，还指在动物优选哺乳动物例如小鼠或人 中具有抗原和/或免疫原性活性的多肽的部分。术语“抗原性表位”，如此处 所用的，定义为多肽的抗体可特异性结合(如可通过本领域内熟知的任何 方法例如通过常规免疫测定法确定的)的部分。抗原表位不需要一定是免 疫原性的，但可以是免疫原性的。“免疫原性表位”，如此处所用的，定义 为多肽的在动物中引起抗体应答(通过本领域内已知的任何方法确定的) 的部分。(参见，例如，Geysen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3998-4002 (1983))。

关于本发明的抗体，术语“生物学性质”或“生物活性”、“活性”、“生物 学活性”此处可互换使用，其包括但不限于表位/抗原亲和力和特异性，在 体内或体外中和或拮抗肌抑制素的活性的能力、肌抑制素/SBE报告基因测 定法中的IC50或体外活性测定法中其他、抗体的体内稳定性和抗体的免疫 原性质。抗体的其他可鉴定的生物学性质包括例如交叉反应性(即，通常 地，与被靶向的肽的非人同源物或与其他蛋白质或组织的交叉反应性)和 在哺乳动物细胞中保持蛋白质的高表达水平的能力。可使用本领域承认的 技术观察或测量或估量上述性质或特征而不限制受体结合、细胞因子或生 长因子的产生和/或分泌、爪蟾属(Xenopus)动物冠发育、信号转导和使 用来自不同来源包括人、灵长类动物或当需要时任何其他所需来源的组织 切片的免疫组织化学，所述技术包括但不限于ELISA、竞争ELISA、表面 等离振子共振(surface plasma resonance)分析、体外和体内中和测定法。

此处使用的术语“肌抑制素的活性”是指与活性肌抑制素蛋白质关联的 一种或多种生理生长调节或形态发生活性。例如，活性肌抑制素是骨骼肌 质量的负调节子。活性肌抑制素也可调节肌肉特异性酶(例如，肌酸激酶) 的产生、刺激成肌细胞增殖和调控前脂肪细胞分化成脂肪细胞。

关于本发明的抗体的活性，此处使用的术语“抑制”或“中和”是指基本 上拮抗、抑制、阻止、限制、减缓、中断、消除、终止、减少或逆转例如 要被抑制的那些(包括但不限于生物学活性或性质、疾病或病症的进程或 严重性)。抑制或中和优选是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、 70％、80％、90％、95％或更高。

术语“分离的”，当用于核酸或蛋白质(例如，抗体)方面时，是指被 鉴定的并且从至少一种通常在其天然来源中与其结合的污染物分离的核酸 序列和蛋白质。优选，“分离的抗体”是基本上不含具有不同抗原特异性的 其他抗体的抗体(例如，本发明的药物组合物包含特异性结合肌抑制素的 分离的抗体并且基本不含特异性结合除了肌抑制素以外的抗原的抗体)。

术语“Kabat编号”和“Kabat标记”此处可互换使用。在本领域内承认 的这些术语是指给抗体的重链和轻链可变区中比其他氨基酸残基更可变 (即，高变的)的氨基酸残基编号的系统(Kabat，等人，Ann.NY Acad.Sci. 190：382-93(1971)；Kabat，等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH公 开号No.91-3242(1991))。

当将其置于与另一种多核苷酸的功能关系中时，多核苷酸被“有效连 接”。例如，如果启动子或增强子影响序列的转录那么它们有效连接至编码 序列。当编码肽的多核苷酸有效连接时，优选当它们处于相同的可读框中 时，所述肽“有效连接至”另一个肽。

术语“个体”、“受试者”和“患者”此处可互换使用，意指动物优选哺乳 动物(包括非灵长类和灵长类动物)或禽类物种，包括但不限于鼠类、猿、 人、哺乳动物农场动物(farm animal)(例如，牛、猪、羊)、哺乳动物运 动动物(例如，马)和哺乳动物宠物(例如，狗和猫)；优选该术语是指人。 术语也指禽类物种，包括但不限于鸡和火鸡。在某些实施方案中，受试者， 优选哺乳动物(优选人)另外的特征在于患有可受益于肌抑制素的减少的 水平或减少的生物活性的疾病或障碍或病症。在另一个实施方案中受试者 (优选哺乳动物优选人)另外表征为处于发生可受益于肌抑制素的减少的 水平或肌抑制素的减少的生物活性的障碍、疾病或病症的风险中。

术语“载体”包括能够运输其所连接的另一种核酸的核酸分子，包括但 不限于质粒和病毒载体。某些载体能够在它们被导入的宿主细胞中自主复 制，而其他载体可在导入宿主细胞后被整合入宿主细胞的基因组，从而随 着宿主基因组被复制。此外，某些载体能够指导有效连接至其的基因的表 达。这样的载体此处称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)，示例 性载体在本领域内是熟知的。

如此处所用的，措辞“细胞”、“宿主细胞”、“细胞系”和“细胞培养物” 此处可互换使用，包括作为本发明的任何分离的多核苷酸或包含编码本发 明的HCVR、LCVR或单克隆抗体的序列的任何重组载体的受者的单个细 胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，由于天然的、意外 的或有意的突变和/或改变，后代可以不必与原始亲本细胞完全同一(在形 态学上或在总DNA套(DNA complement)上)。宿主细胞包括在体内或 体外用一个或多个重组载体或表达本发明的单克隆抗体或其轻链或重链的 多核苷酸转化、转导或感染的细胞。包含本发明的重组载体(稳定地掺入 宿主染色体或没有)的宿主细胞也可称为“重组宿主细胞”。用于本发明的 优选的宿主细胞是CHO细胞(例如，ATCC CRL-9096)、NS0细胞、SP2/0 细胞和COS细胞(ATCC例如，CRL-1650、CRL-1651)、HeLa(ATCC CCL-2)。用于本发明的其他宿主细胞包括植物细胞、酵母细胞、其他哺乳 动物细胞和原核细胞。

抗体表征

本发明涉及以高亲和力特异性结合肌抑制素的分离的单克隆抗体。本 发明的抗体优选是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体或其抗原结合部分并且 优选在横跨氨基酸40-64的肌抑制素的成熟形式的区域内或更优选在横跨 氨基酸43-57和/或45-59的肌抑制素的成熟形式区域中的区域内结合肌抑 制素。此外，本发明的抗体在体内或体外中和肌抑制素的生物学活性。本 发明的抗肌抑制素单克隆抗体对肌抑制素的特异性结合允许本发明的抗体 用作肌抑制素相关性病症、疾病或障碍(即，受益于降低肌抑制素的水平 或拮抗或抑制肌抑制素的生物学活性的病症、疾病或障碍)的治疗剂或预 防剂。此外，本发明的抗体可用于诊断或监控受益于改变的肌抑制素的水 平或生物活性的病症、疾病或障碍或用于确定样品中肌抑制素的水平。

在优选实施方案中，本发明提供了以低于或等于大约3×10-8M、1×10-8M或1×10-9M，优选低于大约9×10-10M或8.7×10-10M或8×10-11M的对 于肌抑制素的结合亲和力(KD)结合肌抑制素或其部分的抗肌抑制素单克隆 抗体。优选本发明的抗体的特征在于不高于大约3×10-8M、1×10-8M、1×10-9M或9×10-10M的对于肌抑制素的KD和最优选不高于大约8.7×10-10M或 8×10-11M的对于肌抑制素的KD。可如此处下面的实施例中所描述的或使 用本领域内可获得的任何合适的方法确定抗体亲和力。

在另一个优选实施方案中，本发明提供了在以下的实施例中描述的体 外肌抑制素/SBE报告基因测定中具有低于或等于大约25nM、20nM、16 nM、14nM、10nM、9nM、6nM、5.2nM或更低的IC50的抗肌抑制素 单克隆抗体。这样的抗体可以另外表征为不高于大约3×10-8M、1×10-8M、 1×10-9M或9×10-10M的对于肌抑制素的KD和最优选表征为不高于大约 8.7×10-10M或8×10-11M.的对于肌抑制素的KD。这样的抗体可另外表征为： 当使用任何本领域可获得的方法例如ELISA测定法或竞争ELISA测定法 或例如用BIACORE或KINEXA测定法测量的KD值来与它们结合 GDF-11的能力相比较时，其优先结合肌抑制素。

在一个实施方案中，如通过本领域内的标准技术例如ELISA测定法、 竞争ELISA测定法或例如使用BIACORE或KINEXA测定法测量的KD值测量的，本发明的单克隆抗体与非肌抑制素蛋白质(例如，GDF-11)或 与至少由15、14、13、12、11、10或9个连续氨基酸组成的非肌抑制素肽 的交叉反应性低于大约35、33、30、28、25、23或20％(更优选，低于大 约19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7或6％，甚至更优 选低于大约5或4％的交叉反应性)。优选，如通过例如竞争ELISA或 BIACORE或KINEXA测定法所确定的，本发明的抗体与肌抑制素的结合 高于其与GDF-11的结合至少2、3、5、10、20、22、24或25倍。最优选， 当使用人们或本领域普通技术人员可获得的任何结合测定法时，本发明的 抗体不以大于背景水平的水平结合GDF-11。本发明的单克隆抗体结合单 体或二聚体形式的肌抑制素或包含横跨残基40-64、43-57和/或45-59的氨 基酸的其部分或成熟肌抑制素。

优选，就本发明的抗体的优先结合而被检测的肌抑制素和GDF-11多 肽都是成熟蛋白(优选哺乳动物或禽类来源的，甚至更优选人来源的)的 同型二聚体形式。然而，就本发明的抗体的优先结合而被检测的肌抑制素 和GDF-11多肽可以是成熟蛋白的单体形式或前蛋白形式或包含横跨蛋白 质成熟形式的氨基酸40-64、43-57和/或45-59的成熟蛋白的部分的多肽。

本发明的抗肌抑制素单克隆抗体结合发现位于成熟肌抑制素的氨基酸 40-64(对于人SEQ ID NO：53)内(优选成熟的肌抑制素的氨基酸43-57和/ 或45-59内)的抗原表位。此外，本发明的肌抑制素的免疫原性表位位于 成熟肌抑制素的氨基酸40-64(对于人SEQ ID NO：53)内，优选任何哺乳动 物或禽类物种的成熟肌抑制素的氨基酸43-57和/或45-59内。本发明的免 疫原性表位也可以理解为是抗原表位。抗原表位可以具有成熟的肌抑制素 的氨基酸40-64外的额外的肌抑制素残基，但本发明的单克隆抗体不需要 这些额外的残基来特异性结合肌抑制素。此外，氨基酸40-64外的肌抑制 素的残基可影响抗原结构域的构象结构，从而改变本发明的抗体对抗原表 位的结合。优选，本发明的单克隆抗体，与它们结合GDF-8的水平相比， 不显著地与GDF-11反应(即，结合)。更优选，如由ELISA测定法或竞 争ELISA测定法或BIACORE或KINEXA测定法中的KD值所确定的， 本发明的单克隆抗体与肌抑制素的结合水平比其结合GDF-11的水平大至 少2、3、5、10、20、22、24或25倍(例如，更大的亲和力或更大的特异 性)。

通过使用本领域技术人员可获得的方法，由成熟肌抑制素的氨基酸 40-64(包括界限)、43-57或45-59组成的肽或由此处描述的免疫原性表位 组成的任何肽可用作免疫原性肽(优选缀合至载体蛋白例如KLH)，以产 生本发明的单克隆抗体。预期这些肽中的半胱氨酸残基可以被改变成丝氨 酸残基并且仍然作用为免疫原性表位。可将免疫原性肽用于免疫非人动物， 优选哺乳动物，更优选小鼠。对于完全的人抗体，可将免疫原性肽用于免 疫小鼠的转基因品系，在所述小鼠中，抑制小鼠的抗体基因表达并用人抗 体的基因表达有效替代所述表达。然后通过本领域内熟知的方法从被免疫 的动物分离和筛选抗肌抑制素抗体以分离这样的抗体，所述抗体在横跨成 熟的肌抑制素的氨基酸40-64的结构域内，优选在横跨氨基酸43-57和/或 45-59的结构域内特异性结合，优选就结合亲和力低于大约3×10-8M、1×10-8M或1×10-9M，优选低于大约9×10-10M、8.7×10-10M或8×10-11M来筛选， 和/或就在体外肌抑制素/SBE测定法(参见此处实施例6中描述的测定法) 中IC50低于或等于大约25nM、20nM、16nM、14nM、10nM、9nM、 6nM、5.2nM或更少来筛选。

可使用本领域内广泛已知的杂交瘤方法(参见例如，Kohler等人， Nature，256：495，1975)或可使用重组DNA方法(例如，如美国专利中 4,816,567中所描述的)或本领域内可获得的其他方法制备单克隆抗体。通 常，可通过将合适的无限增殖细胞系(例如，骨髓瘤细胞系例如SP2/0)与被 免疫的动物的抗体产生性细胞融合来产生杂交瘤。从用目的抗原免疫的动 物获得抗体产生性细胞，优选脾或淋巴节的抗体产生性细胞。可使用选择 培养条件分离融合的细胞(杂交瘤)，然后通过有限稀释对其进行克隆。 就针对抗原的单克隆抗体的产生测定杂交瘤细胞在其中生长的培养基。优 选，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法例如放射免疫测定(RIA)或 ELISA确定杂交瘤细胞产生的mab的结合特异性。可通过合适的筛选测 定法选择产生具有希望的结合性质的抗体的细胞。用于这样的分离和筛选 的方法在本领域内是熟知的。

可使用产生或分离在横跨成熟肌抑制素的氨基酸40-64、43-57和/或 45-59的结构域内结合的抗体(包括人抗体或人造抗体)的其他合适的方法， 所述方法包括例如从文库选择重组抗体(例如，单链Fv或Fab)的方法或 依赖于能够产生人抗体谱的转基因动物(例如，小鼠)免疫的方法(参见例 如，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551-2555，1993； Jakobovits等人，Nature，362：255-258，1993；Lonberg等人，美国专利号 5,545,806；Surani等人，美国专利号5,545,807)。

本发明和术语“抗体”也包括包含来源于不同物种的部分的单链抗体和 嵌合抗体、人源化抗体或灵长类源化(primatized)(移植CDR的)抗体 以及嵌合的或移植CDR的单链抗体等。可通过常规技术化学地、合成地 将这些抗体的不同部分连接在一起，或可使用基因工程技术将其制备为连 续的蛋白质。例如，可表达编码嵌合的或人源化的链的核酸来产生连续的 蛋白质。参见例如，美国专利号4,816,567；欧洲专利号0,125,023 B1；美国 专利号4,816,397；欧洲专利号0,120,694 B1；WO 86/01533；欧洲专利号 0,194,276 B1；美国专利号5,225,539；欧洲专利号0,239,400 B1和美国专 利号5,585,089和5,698,762。关于灵长类源化抗体也参见，Newman，R.等 人BioTechnology，10：1455-1460，1993，关于单链抗体，参见Ladner等人， 美国专利号4,946,778和Bird，R.E.等人，Science，242：423-426，1988。

此外，也可产生抗体的功能性部分，包括嵌合抗体、人源化抗体、人 抗体或单链抗体的抗原结合部分。上述抗体的功能性部分保留了其所来源 的全长抗体的至少一种抗原结合功能和/或生物学功能或生物活性。优选功 能性部分保留相应的全长抗体的抗原结合功能(例如，结合哺乳动物的肌 抑制素的成熟形式的能力)。特别优选的功能性部分或片段保留抑制哺乳 动物成熟肌抑制素的一种或多种功能或生物活性特征例如结合活性、信号 传导活性和/或细胞应答的刺激的能力。例如，在一个实施方案中，功能性 部分或片段可抑制成熟的肌抑制素与一种或多种其配体的相互作用和/或 可抑制一种或多种受体介导的功能。

能够结合成熟的肌抑制素或其部分(优选在成熟的肌抑制素的氨基酸 40-64、43-57和/或45-59内)的抗体部分或片段包括但不限于Fv、Fab、Fab’ 和F(ab’)2片段并且包含在本发明内。可通过酶促切割或通过重组技术产生 此类片段。例如，木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割可以分别产生Fab或F(ab’)2片段。最小的抗原结合片段是Fv，其由HCVR和LCVR结构域组成。Fab 片段由在恒定区之间通过二硫链共价连接的HCVR-CH1和LCVR-CL结 构域组成。为克服当在宿主细胞内共表达时Fv中的非共价连接的HCVR 和LCVR结构域分离的倾向，可构建所谓的单链(sc)Fv片段(scFv)，在该 片段中柔性的和足够长的多肽将HCVR的C末端连接至LCVR的N末端 或将LCVR的C末端连接至HCVR的N末端。最常使用的连接体具有15 个残基(Gly4Ser)3的肽，但其他连接体在本领域内也是已知的。也可使用 其中已在天然终止位点的上游导入一个或多个终止密码子的抗体基因产生 以许多种截短的形式存在的抗体。例如，可设计编码F(ab’)2重链部分的嵌 合基因以包含编码重链的CH1结构域和铰链区的DNA序列。

使用富集技术例如噬菌体展示(Matthews DJ和Wells JA.Science. 260：1113-7，1993)、核糖体展示(Hanes，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 95：14130-5，1998)、细菌展示(Samuelson P.，等人，Journal of Biotechnology.96：129-54，2002)或酵母展示(Kieke MC，等人，Protein Engineering，10：1303-10，1997)从文库选择抗体片段已证明是经典的杂交 瘤技术的成功的另一种选择(近年来的综述：Little M.等人，Immunology Today，21：364-70，2000；)。

变体抗体

针对本发明的免疫原性表位(成熟的肌抑制素的氨基酸40-64、43-57 或45-59)或包含本发明的免疫原性表位的蛋白质产生的鼠类单克隆抗体 或人抗体(在例如转基因小鼠中产生的)是亲本抗体。可使用本领域内熟 知的方法进一步改变鼠类亲本抗体以产生抗体的嵌合形式或人源化形式。 此类嵌合抗体或人源化抗体可用作用于进一步变异或诱变的亲本抗体。可 另外的在CDR结构域内(参见例如，图9)诱变处理本发明的亲本抗体以 产生具有本发明的最优化的目的性质(例如，结合亲和力、IC50、特异性 等)的变体抗体。氨基酸取代的变体抗体是优选的，其为亲本抗体分子的 至少一个氨基酸残基被除去，然后在其位置插入不同的残基。进行取代型 诱变的最吸引人的位点包括CDR区，但也涉及FR的改变。保守性氨基酸 取代是优选的。如果这样的取代导致抗体的生物学活性改变，那么可导入 更实质的改变，即非保守性氨基酸的改变，并且筛选产物。

用于产生取代型变体的常规方法是使用噬菌体展示的亲和力成熟法。 简而言之，突变几个CDR区的位点以在各位点上产生所有可能的氨基酸 取代。所产生的抗体变体作为与包装在各颗粒内的M13的基因III产物的 融合在丝状噬菌体颗粒上以单价形式展示。然后就此处公开的它们的生物 学活性(例如，结合亲和力、特异性、IC50)筛选噬菌体展示的变体。为了 鉴定用于修饰的候选CDR区的位点，可进行丙氨酸分区诱变以鉴定显著 促进抗原结合的CDR区的残基。可选择地，或另外地，分析抗原-抗体复 合物的晶体结构对于鉴定抗体和肌抑制素之间的接触点可以是有益的。该 接触残基和相邻的残基是按照此处详述的或本领域内已知的技术进行取代 的候选残基。可选择地，或另外地，当CDR有效连接至可变区或当CDR 不依赖于其他可变区序列时可在一个或多个残基位置对一个或多个CDR 序列进行随机诱变，然后使用重组DNA技术将改变的CDR返回至可变区。 一旦产生和表达这样的变体抗体后，如此处所描述的将成组变体进行筛选， 可选择在一个或多个在相关测定中具有优良性质的抗体以进行进一步开 发。

可取代(通常用丝氨酸)不参与保持本发明的抗肌抑制素抗体的适当 构象的任何半胱氨酸残基以改善分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反 地，可向抗体中加入半胱氨酸键以提高其稳定性(特别是当抗体是抗体片 段例如Fv片段时)。

另一种类型的抗体的氨基酸变体改变了抗体的原始糖基化模式。改变 是指缺失一个或多个抗体中发现的糖类部分，和/或加入一个或多个在亲本 抗体中不存在的糖基化位点。

抗体的糖基化通常是N连接或O连接的。N连接是指将糖类部分附着 至天冬酰胺残基的侧链。当X是除了脯氨酸外的任何氨基酸时，三肽序列 天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸是糖类部分至天冬酰胺侧链的酶 促附着的识别序列。因此多肽中的这些三肽序列的存在产生了潜在的糖基 化位点。O连接的糖基化是指将糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一 种附着至羟氨基酸(最常见地丝氨酸或苏氨酸，尽管也可使用5-羟脯氨酸 或5-羟赖氨酸)。

通过改变氨基酸序列以使其包含一个或多个上述三肽序列(对于N连 接的糖基化位点)来常规地实现向抗体加入糖基化位点。还可通过向原始 抗体序列加入一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或用所述残基进行取代(对 于O连接的糖基化位点)来产生改变(对于O连接的糖基化位点)。

序列

本发明的优选单克隆抗体具有LCVR和/或HCVR，所述LCVR包含 具有选自：SEQ ID NO：5-12的序列的肽，所述HCVR包含具有选自SEQ ID NO：13-26、55和56的序列的肽(参见此处的图5-9)。此外，本发明的 单克隆抗体是其与成熟的人肌抑制素(或其部分)的结合被包含两个多肽的 单克隆抗体竞争性抑制的抗体，所述两个多肽具有(i)SEQ ID NO：5和15、 (ii)SEQ ID NO：5和16、以及(iii)SEQ ID NO：10和26中显示的序列。可 通过本领域技术人员熟知的测定法例如竞争ELISA测定法测量抗体之间 的该竞争抑制。

在另一个实施方案中，本发明的抗肌抑制素单克隆抗体包含(i)具有选 自SEQ ID NO：5-12的氨基酸序列的LCVR多肽和(ii)具有选自SEQ ID NO：13-26、55和56的氨基酸序列的HCVR多肽。优选，包含具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的LCVR多肽的抗体还包含具有选自EQ ID NO： 13-20的氨基酸序列的HCVR多肽。优选，包含具有SEQ ID NO：6的氨 基酸序列的LCVR多肽的抗体还包含具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的 HCVR多肽。优选，包含具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的LCVR多肽 的抗体还包含具有选自SEQ ID NO：21-25和56的氨基酸序列的HCVR多 肽。优选，包含具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的LCVR多肽的抗体还 包含具有SEQ ID NO：26或55的氨基酸序列的HCVR多肽。优选，包含 具有SEQ ID NO：55的氨基酸序列的HCVR多肽的抗体还包含具有选自 SEQ ID NO：8-12的氨基酸序列的LCVR多肽。

本领域技术人员将认识到本发明的抗体不限定于此处图5-9中所述的 HCVR和LCVR的具体序列，而且还包括保留了抗原结合能力的这些序列 的变体。使用上述的本领域内已知的技术可从提供的序列衍生出此类变体。

在另一个实施方案中，本发明的抗肌抑制素抗体具有重链和轻链可变 区，其中重链可变区包含具有下列氨基酸序列：CDRH1(SEQ ID NO： 59)、CDRH2(SEQ ID NO：60)和CDRH3(SEQ ID NO：61)的CDR区；和 /或其中轻链可变区包含具有下列氨基酸序列：CDRL1(SEQ ID NO： 57)、CDRL2(SEQ ID NO：30或52)和CDRL3(SEQ ID NO：58)的CDR 区。优选，本发明的抗体的重链CDR示于图5、6或9中，本发明的抗体 的轻链CDR示于图7、8或9中，CDR在图中界定的CDR位置上存在于 抗体中。例如，本发明的一个抗体拥有具有SEQ ID NO：27的CDRL1、 具有SEQ ID NO：30的CDRL2、具有SEQ ID NO：31的CDRL3、具有 SEQ ID NO：36的CDRH1、具有SEQ ID NO：43的CDRH2和具有SEQ ID NO：47的CDRH3(如图9中的抗体IC7.1一样)。

还涉及的是：本发明的抗肌抑制素抗体包含重链可变区，所述重链可 变区包含具有选自SEQ ID NO：36-42中所示序列的序列的CDRH1区和/ 或具有选自SEQ ID NO：43-46中所示序列的序列的CDRH2区和/或具有 选自SEQ ID NO：47-51中所示序列的序列的CDRH3区。在另一个实施方 案中，本发明的抗肌抑制素抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含具 有选自SEQ ID NO：27-29中所示序列的序列的CDRL1区和/或具有选自 SEQ ID NO：30或52中所示序列的序列的CDRL2区和/或具有选自SEQ ID NO：31-35中所示序列的序列的CDRL3区。在优选实施方案中，本发 明的抗肌抑制素抗体包含重链可变区且另外包含轻链可变区，所述重链可 变区包含具有选自SEQ ID NO：36-42中所示序列的序列的CDRH1区和/ 或具有选自SEQ ID NO：43-46中所示序列的序列的CDRH2区和/或具有 选自SEQ ID NO：47-51中所示序列的序列的CDRH3区，所述轻链可变区 包含具有选自SEQ ID NO：27-29中所示序列的序列的CDRL1区和/或具 有选自SEQ ID NO：30或52中所示序列的序列的CDRL2区和/或具有选 自SEQ ID NO：31-35中所示序列的序列的CDRL3区。

具有本发明的CDR的结构通常是抗体重链或轻链序列或其实质部 分，其中CDR位于对应于天然发生的HCVR和LCVR的CDR的位置 (Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Dept of HHS，1991)。优选，例如作为由下式：

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4代表的连续序列，在人构架区中提 供给各链(重链和轻链)三个高变区(CDR)。当与CDR以所述顺序排列为 连续序列时，重链或轻链FR1、FR2、FR3和FR4组合形成完整的构架。

除了CDR序列外，LCVR和HCVR还包含构架序列。在人源化抗体 (所述抗体在人中用于治疗用途)中，构架序列优选完全或基本上是人来 源的(即，至少85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％ 的人来源)。优选本发明的人源化抗体、人抗体或嵌合抗体的轻链构架区是 图7中所示的O2，其由具有SEQ ID NO：65的FR1、具有SEQ ID NO：66 的FR2、具有SEQ ID NO：67的FR3和具有SEQ ID NO：68的FR4组成。 优选本发明的人源化抗体、人抗体或嵌合抗体的重链构架区是分别在图5 和6中显示的VH2-70或VH4-39。VH2-70构架由具有SEQ ID NO：69的 FR1、具有SEQ ID NO：70的FR2、具有SEQ ID NO：71的FR3，和具有 SEQ ID NO：72的FR4组成。VH4-39构架区由具有SEQ ID NO：73的 FR1、具有SEQ ID NO：74的FR2、具有SEQ ID NO：75的FR3和具有 SEQ ID NO：76的FR4组成。在用于非人动物的抗体中，构架区序列可以 基本上来源于人基因组(优选在当其是胚胎或新生的非人动物中使用)或 来源于其中其被治疗性使用的动物的基因组。

在一个实施方案中，本发明的抗肌抑制素抗体进一步被表征为在体内 或体外拮抗或中和至少一种肌抑制素活性的嵌合抗体、人源化抗体或完全 人抗体或其抗原结合部分，在所述抗肌抑制素抗体中，可变区的全部或部 分受到此处的SEQ ID NO中所示特定序列的限制。本发明的抗肌抑制素 抗体优选另外被表征为与GDF-11的结合相比其优先结合GDF-8，在所述 抗肌抑制素抗体中，可变区的全部或部分受到此处的SEQ ID NO中所示 的特定序列的限制。更优选此类抗体与肌抑制素的结合比其与GDF-11的 结合高至少大约2、3、5、10、20、22、24或25倍。最优选此类抗体，当 以Fab的形式表达时，不以高于背景的水平结合GDF-11。

优选，本发明的抗肌抑制素抗体被另外表征为(i)结合由SEQ ID NO： 53中所示的氨基酸序列组成的肽(优选由SEQ ID NO：62中所示的氨基酸 序列组成的肽)；和/或(ii)在体外肌抑制素/SBE报告基因测定中具有低于 或等于大约25nM、20nM、16nM、10nM、9nM、6nM、5.7nM的 IC50和/或(iii)具有低于大约3×10-8M、1×10-8M或1×10-9M(优选低于大 约9×10-10M或8.7×10-10M或8×10-11M)的对于肌抑制素的结合亲和力 (KD)；可选择地表征为对于肌抑制素的KD不高于大约3×10-8M、1×10-8M、1×10-9M或9×10-10M；更优选KD不高于大约8.7×10-10M和最优选 KD不高于大约8×10-11M，在所述抗肌抑制素抗体中，可变区的全部或部 分受到此处的SEQ ID NO中所示的特定序列的限制。

抗体的表达

本发明还涉及表达本发明的抗肌抑制素单克隆抗体或其部分的细胞 系。可使用本领域内已知的标准技术产生和分离产生本发明的单克隆抗体 的细胞系。优选细胞系包括COS、CHO、SP2/0、NS0和酵母(可从公共保 藏库(repositorie)例如ATCC，美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas，VA获得)。

可使用广泛的宿主表达系统表达本发明的抗体，所述表达系统包括原 核(细菌)和真核表达系统(例如酵母、杆状病毒、植物、哺乳动物和其 他动物细胞、转基因动物和杂交瘤细胞)以及噬菌体展示表达系统。合适的 细菌表达载体的实例是pUC119，合适的真核表达载体是经修饰的具有减 弱的DHFR选择系统的pcDNA3.1载体。其他抗体表达系统在本领域内也 是已知的并且为此处所涉及。

可通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白的轻链和重链基因来制备本 发明的抗体。为了重组表达抗体，用一个或多个具有DNA片段(其编码 抗体的免疫球蛋白轻链和/或重链)的重组表达载体对宿主细胞进行转化、 转导、感染等等，从而使得轻链和/或重链在宿主细胞中表达。可在一个载 体中从与重链和轻链有效连接的不同的启动子独立地表达重链和轻链，或 可选择地，可在两个载体(一个表达重链，一个表达轻链)中从与重链和 轻链有效连接的不同的启动子独立地表达重链和轻链。任选地可在不同的 宿主细胞中表达重链和轻链。优选，将重组抗体分泌入培养宿主细胞的、 从中可回收或纯化抗体的培养基。可使用标准的重组DNA方法获得抗体 的重链和轻链基因，将这些基因掺入重组表达载体，并将所述载体导入宿 主细胞。在例如Sambrook，Fritsch和Maniatis(编著)，Molecular Cloning； A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；Ausubel， 等人(编著)Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates，1989中描述了这些标准的重组DNA技术。

可通过将编码HCVR的DNA有效连接至编码重链恒定区(CH1、CH2 和CH3)的另一种DNA分子来将分离的编码HCVR区的DNA转变成全长 重链基因。人重链恒定区基因的序列在本领域内是已知的。参见，例如， Kabat，等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S. Department of Health and Human Services，NIH公开号No.91-3242 (1991)。可以例如通过标准的PCR扩增获得包含这些区域的DNA片段。 重链恒定区可以是任何类型(例如，IgG、IgA、IgE、IgM或IgD)、种类(class) (例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)或亚类恒定区和Kabat(同上)中描述的其 任何异型变体。可选择地，抗原结合部分可以是Fab片段、Fab’片段、 F(ab’)2片段、Fd或单链Fv片段(scFv)。对于Fab片段重链基因，可将编 码HCVR的DNA有效连接至只编码重链CH1恒定区的另一个DNA分子。

可通过将编码LCVR的DNA有效连接至编码轻链恒定区CL的另一 个DNA分子来将分离的编码LCVR区的DNA转变成全长轻链基因(以及 转变成Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列在本领域内是已知的。参 见，例如，Kabat，同上。可通过标准的PCR扩增获得包含这些区域的DNA 片段。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。

为产生scFv基因，将编码HCVR和LCVR的DNA片段有效连接至 编码柔性连接体(例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3)的另一个片段，这样 HCVR和LCVR序列可以表达为连续的单链蛋白质，其中LCVR和HCVR 通过柔性连接体连接。参见，例如，Bird，等人，Science 242：423-6，1988； Huston，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-83，1988；McCafferty， 等人，Nature 348：552-4，1990。

为表达本发明的抗体，将如上所述获得的编码部分或全长轻链和/或重 链的DNA插入表达载体以使基因有效连接至转录和翻译控制序列。选择 与使用的表达宿主细胞相容的表达载体和表达控制序列。可将抗体轻链基 因和抗体重链基因插入分开的载体或更常见地，将两个基因插入相同的表 达载体。通过标准方法将抗体基因插入表达载体。此外，重组表达载体可 编码有助于抗肌抑制素单克隆抗体的轻链和/或重链从宿主细胞分泌的信 号肽。可将抗肌抑制素单克隆抗体的轻链和/或重链基因克隆入载体以使信 号肽符合读框地有效连接至抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球 蛋白的信号肽或异源信号肽。

除了抗体的重链和/或轻链基因外，本发明的重组表达载体还携带控制 宿主细胞中抗体链基因的表达的调控序列。术语“调控序列”希望包括启动 子、增强子和当需要时控制抗体链基因的转录或翻译的其他表达控制元件 (例如，多腺苷酸化信号)。表达载体的设计(包括调控序列的选择)可 以依赖于这样的因素例如待转化的宿主细胞的选择、希望的蛋白质的表达 水平。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列包括在哺乳动物细胞中 指导高水平蛋白质表达的病毒元件，例如来自细胞巨细胞病毒(CMV)、猿 猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤 病毒的启动子和/或增强子。

除了抗体的重链和/或轻链基因和调控序列外，本发明的重组表达载体 还可具有额外的序列，例如在宿主细胞中调控载体的复制的序列(例如， 复制起点)和一个或更多个选择标记基因。选择标记基因有助于已导入载 体的宿主细胞的选择。例如，通常选择标记基因在已导入载体的宿主细胞 中提供对药物例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性。优选选择标记基因包 括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于使用氨甲蝶呤进行选择/扩增的DHFR 负型宿主细胞)、neo基因(用于G418选择)和在GS阴性细胞系(例如NS0) 中用于选择/扩增的谷氨酰胺合成酶(GS)。

为了表达轻链和/或重链，通过标准的技术例如电穿孔、磷酸钙沉淀、 DEAE-葡聚糖转染、转导、感染等将编码重链和/或轻链的表达载体导入宿 主细胞。尽管理论上可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但 真核细胞是优选的，最优选哺乳动物宿主细胞，因为此类细胞更可能装配 和分泌正确折叠的和具有免疫活性的抗体。优选的用于表达本发明的重组 抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括Urlaub和 Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-20，1980中描述的、与例如 Kaufman和Sharp，J.Mol.Biol.159：601-21，1982中描述的DHFR选择标 记一起使用的DHFR-CHO细胞)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2/0 细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过 一段时间培养宿主细胞来产生抗体，所述时间足以允许抗体在宿主细胞中 表达或更优选允许抗体分泌入其中宿主细胞生长的培养基中。可使用标准 的纯化方法从宿主细胞和/或培养基回收抗体。

还可通过常规的技术将宿主细胞用于产生完整抗体的部分或片段例如 Fab片段或scFv分子。本领域技术人员理解上述方法的变化在本发明的范 围之内。例如，可能希望用编码本发明的抗体的轻链或重链的DNA转染 宿主细胞。也可以使用重组DNA技术除去一些或所有编码对于结合肌抑 制素不是必需的轻链或重链之一或轻链和重链二者的DNA。本发明的抗体 也包括从此类截短的DNA分子表达的分子。

在用于本发明的抗体的重组表达的优选系统中，通过例如磷酸钙介导 的转染将编码抗体的重链和抗体的轻链的重组表达载体导入DHFR-CHO 细胞。在重组表达载体内，抗体的重链和轻链基因各自有效连接至增强子/ 启动子调控元件(例如，来源于SV40、CMV、腺病毒等的调控元件，例如 CMV增强子/AdMLP启动子调控元件或SV40增强子/AdMLP启动子调控 元件)以驱动高水平基因转录。重组表达载体还具有DHFR基因，该基因 允许使用氨甲蝶呤选择/扩增来选择已用载体转染的CHO细胞。培养选择 的转化体宿主细胞以使抗体的重链和轻链表达，并且从培养基回收完整的 抗体。使用标准的分子生物学技术制备重组表达载体、转染宿主细胞、选 择转化体、培养宿主细胞和从培养基回收抗体。本发明的抗体或其抗原结 合部分可在动物(例如，小鼠)中表达，所述动物是人免疫球蛋白基因的 转基因的动物(参见，例如，Taylor，等人，Nucleic Acids Res.20：6287-95， 1992)。

表达后，可按照本领域内的标准方法纯化本发明的完整抗体、其二聚 体、单个轻链和重链或其他免疫球蛋白形式，所述方法包括硫酸铵沉淀法、 离子交换层析、亲和层析、反相柱层析、疏水作用柱层析、凝胶电泳等。 对于药物用途，至少大约90％、92％、94％或96％的同质性的基本上纯的 免疫球蛋白是优选的，98至99％或更高的同质性是最优选的。在某种程度 上纯化或纯化达到希望的同质性后，如此处指示的，则可治疗或预防性使 用肽。

嵌合抗体

如此处所用的，术语“嵌合抗体”包括单价、二价或多价免疫球蛋白。 单价嵌合抗体是通过二硫键将嵌合重链与嵌合轻链结合而形成的二聚体。 二价嵌合抗体是两个重链-轻链二聚体通过至少一个二硫键结合而形成的 四聚体。

抗体的嵌合重链包含来源于对于肌抑制素是特异的非人抗体的重链的 抗原结合区，该抗原结合区有效连接至人或基本上人(或与抗原结合区来 源的物种不同的特种)的重链恒定区的至少一部分。抗体的嵌合轻链包含 完全或基本上来源于非人抗体的轻链的抗原结合区，该抗原结合区有效连 接至人或基本上人(或与抗原结合区来源的物种不同的特种)的轻链恒定 区(CL)的至少一部分。也可按照已知的方法步骤通过单个多肽链的恰当 结合来制备具有嵌合重链和轻链的抗体、片段或衍生物，所述重链和轻链 具有相同或不同的可变区结合特异性。

通过该方法，将表达嵌合重链的宿主与表达嵌合轻链的宿主分开培养， 分开回收免疫球蛋白链，然后使其结合。可选择地，可共培养宿主，使链 在培养基中自发结合，然后回收装配的免疫球蛋白或片段。用于产生嵌合 抗体的方法在本领域内是已知的(参见，例如，美国专利号：6,284,471、 5,807,715、4,816,567和4,816,397)。

人源化抗体

优选用于治疗目的的本发明的抗体可具有来源于哺乳动物(其中所述 抗体将被用作治疗剂)的构架区和恒定区的序列(达到其在抗体中存在的 程度)，以减少该哺乳动物引发针对治疗性抗体的免疫应答的可能性。人 源化抗体是特别有益的，因为它们被认为对于治疗应用是有价值的并且避 免在使用啮齿类动物的抗体的情况下经常观察到的人抗小鼠抗体应答。此 外，在人源化抗体中，效应子部分是人的，这样其可更好地与人免疫系统 的其他部分相互作用(例如，通过依赖于补体的细胞毒性或抗体依赖性细 胞毒作用更有效地破坏靶细胞)。还有，注射的人源化抗体比例如鼠类抗 体具有与天然发生的人抗体的半衰期更相似的半衰期，因而允许更少量和 更低频率的给药。此处使用的术语“人源化抗体”是指包含不同来源的抗体 的部分的抗体，其中至少一个部分是人来源的。例如，人源化抗体可包含 来源于具有必需的特异性的非人来源(例如小鼠)的抗体和来源于人来源 的抗体的部分，所述部分通过常规技术(例如，合成)化学地连接在一起 或使用基因工程技术作为连续多肽被制备。

优选，“人源化抗体”具有来源于非人抗体(优选小鼠单克隆抗体)的 CDR，而构架区和恒定区(达到其存在的程度)(或其意义的或实质的部 分，即至少大约85％、87％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、 98％或99％)由存在于人种系免疫球蛋白区域(参见，the International ImMunoGeneTics数据库)或存在于其重组或突变的形式中的核酸序列信 息编码，无论所述抗体是否在人细胞中产生。可从人源化抗体CDR所来 源的非人亲本抗体的CDR优化该人源化抗体的CDR，以产生希望的性质 例如特异性、亲和力和容量(capacity)。当与亲本CDR相比时，优化的 CDR可具有氨基酸取代、添加和/或缺失。例如，图9中下划线标示和以 粗体印刷的SEQ ID NO：57、30、58、59、60和61的氨基酸位置是已从 图10和11中显示的亲本CDR优化的位置。然而，要理解：(i)针对由SEQ ID NO：53或62中所示序列组成的肽产生的或(ii)针对包含SEQ ID NO：53 或62中所示序列的肽产生的并且与由SEQ ID NO：53或62中所示序列组 成的肽反应的任何非人抗肌抑制素抗体可用作亲本抗体，可使用本领域内 可获得的标准方法将所述亲本抗体转变成人源化抗体或嵌合抗体。

非人(例如，鼠类)抗体的人源化形式包括完整的抗体、基本上完整 的抗体、包含抗原结合位点的抗体部分，或包含Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2或单链Fv片段的抗体部分。人源化抗体优选包含来源于非人免疫球蛋白 的最小序列。人源化抗体还可包含在接受体抗体和引入的CDR或构架序 列中都未发现的残基。通常，人源化抗体将基本上包含至少一个和通常两 个可变结构域的全部，在所述可变结构域中，CDR区中的所有或基本上所 有氨基酸对应于非人免疫球蛋白的CDR区，并且FR区中的所有或基本上 所有氨基酸是人免疫球蛋白共有序列的氨基酸。人源化抗体最好还包含至 少免疫球蛋白恒定区(Fc)的一部分，通常为人免疫球蛋白的恒定区的部分。 [Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature， 332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992).]

可使用本领域内常规使用的方法将人源化抗体进行体外诱变(或，当 使用人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，从而，人源化重 组抗体的HCVR和LCVR区的构架区氨基酸序列是这样的序列，即当所 述序列来源于与人种系HCVR和LCVR序列相关的序列时，其可以是非 天然地存在于体内人抗体种系库内。要理解人源化重组抗体的HCVR和 LCVR的构架区的这些氨基酸序列与人种系序列至少85％、87％、90％、 92％、94％、95％、96％、98％或最优选至少99％的同一。优选，将保 留亲本抗体(例如，鼠类抗体或通常从其衍生人源化抗体的抗体)的维持 或影响结合部位结构的那些构架残基。可通过例如亲本抗体或Fab片段的 X射线晶体分析法鉴定这些残基，从而鉴定抗原结合位点的三维结构。

本发明的人源化抗体可包含或衍生自人种系轻链构架。在特定的实施 方案中，轻链种系序列选自人VK序列，包括但不限于A1、A10、A11、 A14、A17、A18、A19、A2、A20、A23、A26、A27、A3、A30、A5、A7、 B2、B3、L1、L10、L11、L12、L14、L15、L16、L18、L19、L2、L20、 L22、L23、L24、L25、L4/18a、L5、L6、L8、L9、O1、O11、O12、O14、 O18、O2、O4和O8。在某些实施方案中，此轻链人种系构架选自V1-11、 V1-13、V1-16、V1-17、V1-18、V1-19、V1-2、V1-20、V1-22、V1-3、V1-4、 V1-5、V1-7、V1-9、V2-1、V2-11、V2-13、V2-14、V2-15、V2-17、V2-19、 V2-6、V2-7、V2-8、V3-2、V3-3、V3-4、V4-1、V4-2、V4-3、V4-4、V4-6、 V5-1、V5-2、V5-4和V5-6。关于不同种系序列的描述，参见PCT WO 2005/005604。

在其他实施方案中，本发明的人源化抗体可包含或衍生自人种系重链 构架。在特定的实施方案中，该重链人种系构架选自VH1-18、VH1-2、 VH1-24、VH1-3、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH1-8、VH2-26、 VH2-5、VH2-70、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、 VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、 VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-7、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH3-9、 VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-4、VH4-59、VH4-61、VH5-51、 VH6-1和VH7-81。关于不同的种系序列的描述参见PCT WO 2005/005604。

在特定的实施方案中，轻链可变区和/或重链可变区包含构架区或至少 构架区的一部分(例如，包含2或3个亚区例如FR2和FR3)。在某些实施 方案中，至少FRL1、FRL2、FRL3或FRL4是完全人的。在其他实施方 案中，至少FRH1、FRH2、FRH3或FRH4是完全人的。在一些实施方案 中，至少FRL1、FRL2、FRL3或FRL4是种系序列(例如，人种系)或 包含特定构架的人共有序列。在其他实施方案中，至少FRH1、FRH2、FRH3 或FRH4是种系序列(例如，人种系)或包含特定构架的人共有序列。在优 选实施方案中，构架区是人构架区。

通常，可这样产生人源化抗体，即获得编码抗体(例如鼠类抗体或通 过杂交瘤产生的抗体)的HCVR和LCVR的核酸序列(所述抗体结合本 发明的肌抑制素表位)，鉴定了所述HCVR和LCVR(非人)中的CDR， 然后将编码该CDR的核酸序列嫁接至选择的编码人构架的核酸序列上。 任选地，可通过随机诱变或在特定的位置进行诱变以在将CDR区嫁接入 构架区之前在CDR中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸最优化CDR区。 可选择地，使用本领域技术人员可获得的方法，可在插入人构架区之后优 化CDR区。优选，选择人构架氨基酸序列以使所得的抗体可能适合在人 中体内施用。这可基于例如包含该人构架序列的抗体的以前的施用进行确 定。优选，人构架序列本身将不具有显著的免疫原性。

可选择地，可将待人源化抗体的构架氨基酸序列与已知的人构架序列 进行比较，所述人构架序列被用于CDR-嫁接，并以它们包含与结合肌抑 制素的亲本抗体例如鼠类抗体的序列高度相似的序列为基础来被选择。已 分离了许多人构架序列并且在本领域内报导了它们的序列。这增加了所得 的CDR嫁接的人源化抗体将基本上保持亲本抗体的抗原结合结构，从而 保持亲本抗体的结合亲和力的可能性，所述CDR嫁接的人源化抗体包含 嫁接至选择的人构架(以及也可能有人恒定区)上的亲本(例如，鼠类) 的CDR或亲本抗体的优化的CDR。为保持显著程度的抗原结合亲和力， 选择的人构架区优选是预期适合用于体内施用即非免疫原性的构架区。

在任一方法中，获得编码优选鼠类抗肌抑制素抗体的HCVR和LCVR 区的DNA序列。用于克隆编码免疫球蛋白的核酸序列的方法在本领域内 是熟知的。此类方法可以例如包括使用合适的引物通过聚合酶链式反应 (PCR)扩增待克隆的免疫球蛋白编码序列。文献中已报导了适合于扩增 免疫球蛋白核酸序列，并且特别是鼠类HCVR和LCVR序列的引物。在 克隆这样的免疫球蛋白编码序列后，通过本领域内熟知的方法对其进行测 序。

在将编码CDR的序列嫁接至选择的编码人构架的序列上后，则表达 所得的编码“人源化”可变重链序列和可变轻链序列的DNA序列以产生结 合肌抑制素的人源化Fv或人源化抗体。人源化HCVR和LCVR可表达 为完整的抗肌抑制素抗体分子的一部分，即，表达为与人恒定结构域序列 的融合蛋白，所述人恒定结构域序列的DNA编码序列可从商购可获得的 文库获得或使用例如上述用于获得DNA序列的方法中或本领域内的一种 方法获得。然而，HCVR和LCVR序列也可在恒定序列不存在的情况下表 达，从而产生人源化抗肌抑制素Fv。然而，人恒定序列至可变区的融合是 潜在想要的，因为所得的人源化抗肌抑制素抗体可具有人效应子作用。

用于合成编码已知序列的蛋白质的DNA的方法在本领域内是熟知的。 通过使用这样的方法，合成编码主人源化HCVR和LCVR序列(与或不与 恒定区)的DNA序列，然后将其在适合用于重组抗体表达的载体系统中进 行表达。这可在任何载体系统中实现，所述载体系统提供了以与人恒定结 构域序列的融合蛋白形式表达并且结合以产生功能性(抗原结合)抗体或抗 体片段的的主人源化HCVR和LCVR序列。

人恒定结构域序列在本领域内是熟知的，并且已在文献中进行了报导。 优选人恒定轻链序列包括κ和λ恒定轻链序列。优选人恒定重链序列包括 人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4和提供改变的效应子作用(例如增加 的体内半衰期、减少的Fc受体结合或改变的脱酰胺作用谱)的其突变形式。

如果存在，人构架区优选来源于人抗体可变区，其具有与抗原结合区 供体(即，亲本抗体)的类似或相当区域的序列相似性。人源化抗体的来 源于人的部分的构架区的其他来源包括人可变共有序列(参见例如， Kettleborough，C.A.等人Protein Engineering 4：773-783(1991)；Carter 等人，WO 94/04679。例如，如Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH，U.S.Government Printing Office (1991)中所述，可将用于获得非人部分的抗体或可变区的序列与人序列比 较。在特别优选的实施方案中，人源化抗体链的构架区来源于人可变区， 所述可变区与非人供体的可变区具有至少大约60％的总的序列同一性，优 选至少大约70％的总的序列同一性和更优选至少大约85％的总的序列同 一性。人部分也可来源于人抗体，所述人抗体当与非人供体的相当部分(例 如，FR)相比时在使用的特定部分(例如，FR)内具有至少大约65％的 序列同一性和优选至少大约70％的序列同一性。。

另外描述的可使用的涉及人源化小鼠抗体的方法的参考文献是例如 Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：2869，1991；美国专利号 5,693,761；美国专利号4,816,397；美国专利号5,225,539；Levitt，M.，J.Mol. Biol.168：595-620，1983中描述的计算机程序ABMOD和ENCAD；可基 本上按照Winter和其同事的方法进行人源化[Jones等人，Nature， 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature，332：323-327(1988)； Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536(1988)]。

人抗体

作为人源化的另一选择，可产生人抗体。可使用本领域内已知的多种 技术包括噬菌体展示文库产生人抗体。Hoogenboom和Winter，J.Mol. Biol.，227：381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581(1991)。Cole等 人和Boerner等人的技术也可用于人单克隆抗体的制备。Cole等人， Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77页(1985) 和Boerner等人，J.Immunol.，147(1)：86-95(1991)。类似地，可通过将人 免疫球蛋白基因座导入其中内源免疫球蛋白基因已被部分或完全失活的转 基因动物例如小鼠来制备人抗体。在例如用包含本发明的免疫原性表位的 抗原免疫后，获得在所有方面(包括基因重排、装配和抗体谱)与人中看 到的非常相似的完全人抗体产生谱。在例如美国专利号5,545,807、 5,545,806、5,569,825、5,589,369、5,591,669、5,625,126、5,633,425、5,661,016 和下列科学出版物：Marks等人，BioTechnology 10：779-783，1992； Lonberg等人，Nature 368：856-859，1994；Morrison，Nature 368：812-13， 1994；Fishwild等人，Nature Biotechnology 14：845-51，1996；Neuberger， Nature Biotechnology 14：826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev. Immunol.13：65-93(1995)和Jobkobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 90：2551，1993中描述了该方法。

也在Bruggemann等人Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 86：6709-6713 (1989)中描述了将人免疫球蛋白基因导入小鼠从而产生能够通过具有人序 列的抗体对抗原应答的转基因小鼠。存在几种用于生成产生人抗体的哺乳 动物的策略。特别地，存在“微小基因座”方法，在该方法中通过包含来自 Ig基因座的片段(单个基因)(参见，例如，美国专利5,545,807、5,545,806、 5,625,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650和 5,814,318、5,612,205、5,721,367、5,789,215)、YAC导入Ig基因座的大的 和基本上的种系片段[见Mendez等人Nature Genetics 15：146-156(1997)， Green和Jakobovits J.Exp.Med.188：483-495(1998)]以及通过使用微细 胞融合导入完整的或基本上完整的基因座(参见欧洲专利申请号EP 0 843 961 A1)来模拟外源Ig基因座。

当使用本领域技术人员可获得的方法时，例如当用包含本发明的免疫 原性表位的多肽免疫任何转基因小鼠(所述小鼠能够通过具有人序列的抗 体应答)时，该小鼠可用于产生本发明的抗肌抑制素抗体。

用途

本发明的抗体用于此处描述的治疗、预防、诊断和研究应用。本发明 的抗体可用于诊断与人肌抑制素的表达相关的障碍或疾病。以相似的方式， 可在测定中使用本发明的抗体监控进行肌抑制素相关性病症治疗的受试者 的肌抑制素水平。诊断测定包括利用本发明的抗体和标记来检测样品中例 如人体液中或细胞或组织提取物中的肌抑制素的方法。可使用具有修饰或 不具有修饰的本发明的抗体，并且通过可检测部分的共价附着或非共价附 着标记所述本发明的抗体。可检测部分可以是能够直接或间接产生可检测 信号的任何部分。例如，可检测部分可以是放射性同位素例如3H、14C、32P、 35S或125I、荧光化合物或化学发光化合物例如异硫氰酸荧光素、罗丹明或 萤光素；或酶例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。可使用 本领域内已知的用于将抗体分开缀合至可检测部分的任何方法，包括由 Hunter，等人，Nature 144：945，1962；David，等人，Biochemistry 13：1014， 1974；Pain，等人，J.Immunol.Meth.40：219，1981；和Nygren，J. Histochem.And Cytochem.30：407，1982描述的方法。

许多种用于测量肌抑制素的常规方案包括例如ELISA、RIA和FACS 在本领域内是已知的，其提供了诊断肌抑制素的表达的改变的或异常的水 平的基础。使用本领域内已知的任何技术例如通过将包含肌抑制素多肽的 样品与例如抗体在适合形成抗原：抗体复合物的条件下结合来确定正常或 标准的表达值。用可检测的物质直接或间接地标记抗体以帮助检测结合或 未结合的抗体。合适的可检测的物质包括多种酶、辅基、荧光材料、发光 材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、 β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉抗生物 素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧 光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺(dichlorotriazinylamine) 荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；以及放射性 材料的实例包括125I、131I、35S或3H。(参见，例如，Zola，Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques，CRC Press，Inc.(1987))。

使用不同的方法例如光度测定法定量形成的标准复合物的量。然后将 受试者、对照和样品(例如，来自活组织检查的组织的样品)中表达的肌 抑制素多肽的量与标准值比较。标准值和受试者的值之间的偏差建立了用 于将特定障碍、状态、病症、综合征或疾病与肌抑制素多肽的某一水平的 表达(或缺乏其)关联的参数。

一旦确定障碍、状态、病症、综合征或疾病存在，则开始进行治疗方 案，定期重复测定以监控肌抑制素表达的水平。从连续测定获得的结果用 于显示数天至数月的时期内治疗的功效。关于特定的疾病(例如，虚弱或 恶病质)，来自受试者的活组织检查的组织或液体(例如，血清或尿)中 的改变量的肌抑制素的存在可表示对于发生障碍、状态、病症、综合征或 疾病的易感性，或其可提供用于在实际临床症状出现之前检测此类障碍、 状态、病症、综合征或疾病的方法，或其可确定更可能对本发明的抗体产 生治疗性应答的群体。更确定的初步检测使得可进行更早期的治疗，从而 预防和/或改善与肌抑制素的表达相关的疾病或障碍例如肌肉或骨退化的 进一步进展。

为方便起见，可在试剂盒中提供本发明的抗体，所述试剂盒是预先确 定的量的试剂和进行诊断测定的说明书的包装组合。当用酶标记抗体时， 试剂盒将包含底物和酶所需要的辅因子(例如，提供可检测的发色团或荧 光基团的底物前体)。此外，可以包括其他添加剂例如稳定剂、缓冲液(例 如，封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。可以宽泛地变化多种试剂的相对量以 提供基本上使测定的灵敏度最优化的试剂的溶液浓度。特别地，可以以干 粉(通常为冻干的)的形式提供包含赋形剂的试剂，所述试剂在溶解后可 提供具有合适浓度的试剂溶液。

抗体的治疗用途

肌抑制素在肌肉的发育和许多相关的障碍或疾病中起着重要作用。在 成人中，主要在骨骼肌中检测到肌抑制素mRNA，虽然也在脂肪组织和心 脏组织中也发现更低的浓度(Sharma，M.，等到，J.Cell Physiol.180：1， 1999)。肌抑制素敲除小鼠具有比它们的野生型同胞仔高2至3倍的肌肉质 量。增加的肌肉质量是纤维过度生长和超常增生造成的(McPherron，A.，等 人Nature 387：83-90，1997和Zhu，X.等人，FEBS Letters 474：71)。此外， 肌抑制素敲除小鼠积累了比其野生型同胞仔更少的脂肪，但表现正常和健 康。最近也显示肌抑制素是脂肪生成的重要调节子(Rebbapragada，A.，等 人，Mol.and Cell.Bio.23：7230-7242，2003)。此外，近来已在肌抑制素缺陷 型小鼠中研究了骨结构和含量(Hamrick M.W.，等人，J.Orthopaedic Research 21：1025，2003；Hamrick，M.W.，等人，Calcif Tissue Int 71：63， 2002。

因此，包含本发明的抗肌抑制素单克隆抗体的药物组合物可用于增加 肌肉质量，增加骨的密度，减少肌萎缩，或可用于治疗或预防其中肌抑制 素的存在引起或促成不希望的病理效应或肌抑制素水平的减少在哺乳动物 (优选人)中具有治疗益处的病症，包括但不限于肌萎缩、肌肉损伤、手 术、被损伤的肌肉的修复、虚弱、年龄相关少肌症、废用性萎缩、骨质疏 松症、骨关节炎、韧带生长和修复、肥胖症、体脂肪积累的抑制、肥胖症、 任何类型的肌营养不良、重症监护性肌病(critical care myopaythy)、酒精 中毒性肌病、恶病质(例如，癌症相关性或HIV诱导的或由COPD、慢性 肺病、从脓毒症的恢复、肾衰竭、肝衰竭、心力衰竭或疾病引起的)、代谢 综合征、烧伤后肌萎缩和II型糖尿病。废用性萎缩可由许多因素或偶然事 件造成，所述因素或偶然事件包括导致长期不能运动(prolonged immobility)或废用或卧床休养的任何障碍或疾病或状态，包括但不限于 实体器官(solid organ)移植、关节置换术、中风、脊髓损伤、从重度烧 伤恢复、久坐的慢性血液透析(sedentary chronic hemodialysis)、脓毒症 后恢复和暴露于微重力。因为肌抑制素在序列和功能上是跨物种高度保守 的，因此本发明的抗体可用于增加肌肉质量，增加骨的密度或治疗或预防 非人哺乳动物或禽类物种[例如，家养动物(例如，狗和猫)、运动动物(例如， 马)、食物来源动物(例如，牛、猪和羊)、禽类物种(例如，鸡、火鸡、其他 猎禽或家禽)]中的病症，其中肌抑制素的存在引起或促成不希望的病理效 应或肌抑制素水平的降低具有治疗益处。

此处涉及本发明的抗肌抑制素单克隆抗体用于治疗或预防至少一种上 述疾病的用途，在所述疾病中肌抑制素的活性是有害的或其受益于生物活 性肌抑制素的水平降低。此外，涉及本发明的抗肌抑制素单克隆抗体用于 药物制造的用途，所述药物用于治疗至少一种上述病症。

如此处所用的，术语“治疗”、“进行治疗”等是指获得希望的药理学和/ 或生理学效应。就完全或部分地预防疾病或其症状而言，效应可以是预防 性的和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的不利影响而言效 应是治疗性的。如此处使用的，“治疗”包括施用本发明的化合物以治疗哺 乳动物特别是人中的疾病或病症，并且包括：(a)在可以是对该疾病易感但 还未被诊断为患有其的受试者中预防疾病发生；(b)抑制疾病，即，使其 停止发展；和(c)减轻疾病，即，使疾病或障碍消退或减轻其症状或并发 症。可调整剂量方案以提供最适宜的希望的应答(例如，治疗性或预防性应 答)。例如，可施用快速灌注剂(single bolus)，可在一段时间内施用几次 分开的剂量或可按照治疗状况的紧迫性所指示的按比例减少或增加剂量。

药物组合物

可将本发明的抗体掺入适合用于给受试者施用的药物组合物中。本发 明的化合物可以以单剂量或多剂量的单独地或与可药用的载体、稀释剂和/ 或赋形剂组合施用。设计适合用于选择的施用模式的用于施用的药物组合 物，根据需要使用可药用的稀释剂、载体、和/或赋形剂例如分散剂、缓冲 剂、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等。按照例如Remington， The Science and Practice of Pharmacy，第19版，Gennaro，编著，Mack Publishing Co.，Easton，PA 1995(其提供了对于医生通常是已知的配制剂 技术的概要)中的常规技术设计所述组合物。

可通过使用标准的施用技术(包括口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺 的、经皮肤、肌内、鼻内、口腔、舌下或栓剂施用)对处于此处描述的病 状的风险中或展示所述病状的受试者施用包含本发明的抗肌抑制素单克隆 抗体的药物组合物。

本发明的药物组合物优选是“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的 抗体。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间的情况下有效地获得希望的 治疗结果的量。抗体的治疗有效量可根据因素例如个体的疾病状态、年龄、 性别和体重以及抗体或抗体部分在个体中引发希望的应答的能力而变化。 治疗有效量也是其中抗体的治疗有益效应超过其任何毒性或有害效应的 量。“预防有效量”是指在必要的剂量和时间的情况下有效地获得希望的预 防结果的量。通常，由于在疾病之前或在疾病的早期将预防性剂量用于受 试者，因此预防有效量将低于治疗有效量。

治疗有效量或预防有效量是至少为受试者提供治疗益处所必需的活性 剂的最低剂量，但低于毒性剂量。换而言之，本发明的抗体的治疗有效量 是在哺乳动物优选人中增加肌肉质量、增加骨的密度或治疗病症的量，所 述病症中，肌抑制素的存在引起或促成不希望的病理效应或肌抑制素水平 的减少在哺乳动物优选人中导致有益的治疗效应，所述病症包括但不限于 肌萎缩、肌肉损伤、术后虚弱(surgery frailty)、年龄相关少肌症、废用 性萎缩、骨质疏松症、骨关节炎、韧带生长和修复、肥胖症、体脂肪积累 的抑制、任何类型的肌营养不良、重症监护性肌病、恶病质(例如，癌症相 关性或HIV诱导的或由COPD、肾衰竭、肝衰竭、心力衰竭或疾病引起的)、 代谢综合征和II型糖尿病。废用性萎缩可由许多因素或偶然事件造成，所 述因素或偶然事件包括导致长期不能运动或废用或卧床休养的任何障碍或 疾病或状态，包括但不限于实体器官移植、关节置换术、中风、脊髓损伤、 从重度烧伤恢复、久坐的慢性血液透析、脓毒症后恢复和暴露于微重力。 本发明抗体的施用途径可以是口服、肠胃外、通过吸入或局部的。优选， 可将本发明的抗体掺入适合用于肠胃外施用的药物组合物。此处使用的术 语肠胃外包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道或腹膜内施用。通过静脉 内或腹膜内或皮下注射进行的外周全身性递送是优选的。用于这样的注射 的合适的媒介物在本领域内是已知的。

药物组合物通常在制造和在提供的容器(包括例如密封的小瓶或注射 器)中贮存的条件下必须是无菌的和稳定的。因此，在产生制剂后可对药 物组合物进行过滤灭菌或使其是微生物学可接受的。用于静脉内输注的典 型组合物可具有多至250-1000ml的液体(例如无菌林格(Ringer)溶液、 生理盐水、葡萄糖溶液和Hank溶液)体积和治疗有效剂量(例如，1至 100mg/mL或更高)的抗体浓度。剂量可依赖于疾病的类型和严重度而变 化。如在医学领域内所熟知的，用于任何一个受试者的剂量依赖于许多因 素，包括患者的身材大小、体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、 施用的时间和途径、总体健康状况和同时施用的其他药物。典型剂量可以 在例如0.001至1000μg的范围内；然而，低于或高于该示例范围的剂量是 可以预期的，特别是考虑到上述因素时。日常肠胃外给药方案可以是每天 大约0.1μg/kg至大约100mg/kg的总体重，优选大约0.3μg/kg至10mg/kg 和更优选大约1μg/kg至1mg/kg，甚至更优选大约0.5至10mg/kg的体重。 通过定期估量来监控进程。对于在数天或更长时间内的重复施用，根据病 症，重复治疗直至发生希望的疾病症状的抑制。然而，其他给药方案可以 是有用的，并且不能由此排除。根据医生希望获得的药物动力学衰减模式， 可通过抗体的单次推注施用、多次推注施用或连续输注施用来递送希望的 剂量。

对抗体的这些建议的量进行大量的治疗性判断。选择合适的剂量和日 程中的关键因素是获得的结果。本文中考虑的因素包括正进行治疗的特定 疾病、被治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床情况、疾病的病因、抗体 递送的位置、抗体的特定类型、施用方法、施用日程和医生已知的其他因 素。

可将本发明的治疗剂冷冻或冻干以进行贮存和在使用之前将其在合适 的无菌载体中重建。冻干和重建可导致不同程度的抗体活性丢失。可能需 要调整剂量来补偿。通常，pH 6至pH 8是优选的。

制造品

在本发明的另一个实施方案中，提供了包含用于治疗或预防上述疾病 或病症的材料的制造品。制造品包括容器和标签。合适的容器包括例如瓶 子、小瓶、注射器和试管。可用许多种材料例如玻璃或塑料形成容器。容 器装有对于预防或治疗疾病或病症是有效的本发明的组合物并且可具有无 菌入口(例如容器可以是静脉内施用溶液袋(intravenous solution bag)或 具有可用皮下注射针穿透的塞子的小瓶)。组合物中的活性剂是本发明的抗 肌抑制素抗体。容器上的或与其连接的标签标明组合物用于治疗选择的病 病症。制造品还可包含第二容器，所述第二容器包含可药用的缓冲液例如 磷酸缓冲的盐溶液、林格溶液和葡萄糖溶液。其还可包含在商业和用户立 场考虑希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射 器和具有使用说明的说明书。

仅以举例说明的目的提供下列实施例，并且不希望其以任何方式限定 本发明的范围。

实施例

实施例1：ELISA测定

A.抗肌抑制素Fab相对于与GDF-11的结合优先结合肌抑制素。

在ELISA测定中检测本发明的抗肌抑制素Fab(或全长mAb)，在所 述测定中测量Fab对以不同浓度包被在96孔板上的成熟肌抑制素(二聚 体形式)的结合。也检测Fab对GDF-11的结合。

以200ng/孔的重组小鼠肌抑制素(安迪生物有限公司(R&D systems)， 货号788-G8/CF，无载体，于碳酸盐缓冲液中，pH 9.6)或200ng/孔的重组 人GDF-11(派柔泰克有限公司(Peprotech，Inc.)，货号120-11，无载体， 于碳酸盐缓冲液中，pH 9.6)包被两个96孔板的各个小孔。在4℃下温育 平板过夜。抽吸小孔，然后用洗涤缓冲液(20mM Tris(羟甲基)氨基甲烷、 pH 7.4、0.15M NaCl、0.1％Tween-20)洗涤两次。用每孔200μl的封闭缓 冲液(在上述洗涤缓冲液中5％的康乃馨速溶(Carnation Instant)奶粉)封 闭平板，进行5小时。

将待检测的Fab或mab以不同的浓度例如10μg/ml、2μg/ml、0.4 μg/ml、0.08μg/ml和0.016μg/ml稀释入封闭缓冲液中。将50微升的各Fab 溶液以一式两份加入GDF-8和GDF-11包被的小孔。将平板在室温下温育 1小时。然后用洗涤缓冲液洗涤小孔3次。向各小孔加入AP缀合的二抗(50 μl在封闭缓冲液中以1∶1000稀释的山羊抗κAP(南方生物技术公司 (Southern Biotech)))，然后在室温下温育1小时。然后用洗涤缓冲液洗 涤小孔3次。向各小孔加入50微升的显色底物(即，AP底物)，然后让 其在室温下显色。以560nm的OD读出小孔的吸光度。确定来自一式两 份的小孔的平均吸光度。

本发明的所有抗体预期结合与板结合的人成熟肌抑制素并且当与 GDF-11结合相比时优先结合肌抑制素。在GDF-8下ELISA(down ELISA) 中，Fab C12具有0.25μg/ml的IC50，Fab 510C2具有0.27μg/ml的IC50。

B.人源化-最优化的抗肌抑制素抗体结合肌抑制素肽

在ELISA测定中，本发明的抗体结合纯化的、生物素化的肽，该肽具 有横跨成熟人肌抑制素的氨基酸序列40-64的序列(SEQ ID NO：53)(除了 氨基丁酸在位置47上替代了半胱氨酸残基)。本发明的抗体也结合具有 SEQ ID NO：62中显示的序列(在成熟的肌抑制素的位置47上具有半胱氨 酸或丝氨酸)的肽以及以单体和二聚体形式的肌抑制素的成熟形式。

在示例性ELISA测定中，将50μl 1μg/ml的在50mM碳酸氢钠缓冲 液，pH 8.0中的山羊抗人κ抗体(UNLB，南方生物技术公司(Southern Biotech)2060-01)用于包被高结合微量滴定板(high-bind microtiter plate) (格瑞纳公司(Greiner EK)20061)。抽吸小孔，用PBST(PBS、0.1％Tween) 洗涤小孔，然后用PBST-BSA(PBS、1％BSA、0.1％Tween)封闭1小时。 然后用PBST再洗涤小孔。在室温下进行测定的所有步骤。在小孔中加入 始于50ng/孔的在PBST-BSA中稀释的人源化-最优化的抗肌抑制素抗体 (在293细胞中瞬时表达的包含IgG4 Fc区的全长抗体)的滴定，然后将平 板再温育1小时，如上所述进行洗涤，用50μl上述生物素化的肽以50nM (于PBST-BSA中稀释的)的浓度对其进行探测。然后加入50μl 2μg/ml的 NeutrAvidin-AP(在PBST-BSA中1∶1000的，皮尔斯公司(Pierce) 31002)，按照厂商说明书(皮尔斯公司(Pierce)31002)通过加入AP底物 进行检测。将单独的缓冲液用作对照。在560nm处读取吸光度。510C2 和C12 Fab结合肽，IC50值分别为6.73和5.42ng/孔。

本发明的抗体能够结合由成熟的肌抑制素的氨基酸40-64(SEQ ID NO：53)组成的肽和/或由成熟的肌抑制素的氨基酸43-57(SEQ ID NO：62) 组成的肽(在位置47上具有半胱氨酸或丝氨酸)。然而，本发明的抗体不 能结合(以显著高于背景的水平)由成熟的肌抑制素的氨基酸60-73、 74-86、87-97、96-108、16-29、1-15或30-42组成的肽。包含有效附着至 鼠类IgG1 Fc区的鼠类可变区(参见图10和11)的称为Mab 3的鼠类抗体 (参见此处引用的美国专利申请60/559,621和60/555,456)不结合由成熟的肌 抑制素的氨基酸60-73、74-86、87-97、96-108、16-29、1-15或30-42组成 的肽并且为本发明的抗体的亲本抗体。

人源化抗体510C2和C12以相似的程度结合由肌抑制素的氨基酸 43-57和45-59组成的肽(如下面表1中所示的)。这证明本发明的表位更 特异性地位于横跨成熟的肌抑制素的氨基酸45-57的肽内。当就对由成熟 肌抑制素的氨基酸47-61组成的肽的结合检测抗体时结合轻微减弱，这证 明成熟的肌抑制素的氨基酸45-46对于结合或对于保持允许结合的肽的构 象的重要性。当就对由成熟肌抑制素的氨基酸49-63组成的肽的结合检测 抗体时，结合进一步减弱，这证明成熟的肌抑制素的氨基酸47-48对于结 合或对于保持允许结合的肽的构象是重要的。当就对由成熟肌抑制素的氨 基酸39-53组成的肽的结合检测抗体时结合减弱至背景水平，这表明残基 54-57的区域的重要性。

表1

(*残基是肌抑制素中的C)

C，肌抑制素人源化-最优化的Mab ELISA测定

在其中测量抗体对包被在平板上的GDF-8抗原的结合的ELISA测定 中检测人源化抗人肌抑制素全长单克隆抗体510C2和C12。也检测了Mab 对GDF-11的交叉反应性。将无Mab的情况、同种型对照抗体和无关蛋白 质(HGF)用作负对照。

用70μl人GDF-8(无载体，在碳酸盐缓冲液的1μg/ml，pH 9.6)、重 组人GDF-11(来自派柔泰克有限公司(Peprotech，Inc.)，货号120-11，无 载体，于碳酸盐缓冲液中的1μg/ml，pH 9.6)或重组人HGF(来自安迪生物 有限公司(R&D Systems)，货号294-HG/CF，无载体，于碳酸盐缓冲液 中的1μg/ml，pH 9.6)包被96孔板的各孔。将平板在4℃下温育过夜。抽 吸小孔，并且用洗涤缓冲液(20mM Tris(羟甲基)氨基甲烷、pH 7.4、0.15 M NaCl、0.1％Tween-20)洗涤两次。用每孔200μl封闭缓冲液(在上述洗涤 缓冲液中的5％康乃馨速溶(Carnation Instant)奶粉)在室温下封闭平板 4小时。用洗涤缓冲液洗涤平板2次。

以1μg/ml、0.2μg/ml、0.04μg/ml、0.008μg/ml、0.0016μg/ml和0.00032 μg/ml将Mab稀释入封闭缓冲液中。使用由单独的封闭缓冲液组成的无 Mab对照。以1μg/ml的同种型对照抗体用作负对照。然后以一式两份向 GDF-8和GDF-11包被的小孔中加入50μl的各Mab溶液。将平板在室温 下温育1小时。然后用洗涤缓冲液洗涤小孔3次。

然后向各小孔中加入50μl以1∶2000在封闭缓冲液中稀释的过氧化物 酶缀合的二抗(山羊抗人IgG HRP，Fcγ片段特异性的，杰克免疫研究公司 (Jackson ImmunoResearch)，货号109-035-008)，并且在室温下温育1 小时。然后用洗涤缓冲液洗涤小孔3次。然后向各孔中加入50μl显色底 物(即，OPD底物)，让其在室温下显色2.5分钟。通过向各孔中加入100μl 1N HCl来终止反应。在490nm处读取小孔的吸光度。确定来自一式两份 的小孔的平均吸光度，这些值列于下面的表2中。

这些数据证明Mab 510C2和C12结合与板结合的肌抑制素。关于特 异性，这些Mab相对于与GDF-11的结合优先结合GDF-8。Mab 510C2 显示对肌抑制素(GDF-8)的结合比对GDF-11的结合高大约25倍。Mab C12 显示对肌抑制素的结合比对GDF-11的结合高大约5倍。

表2

此外，在ELISA测定中证明全长mab C12不结合其他TGF-β超家族 成员BMP-2、BMP-3、BMP-3b/GDF-10、BMP-4、BMP-7、BMP-8B、 激活蛋白A、激活蛋白B、TGF-α、TGF-β1、TGF-β2和GDF-3；其证明 了对BMP-5的最低的结合。认为本发明的其他抗肌抑制素抗体类似地不 结合或最低地结合这些其他的TGF-β超家族成员。

实施例3  肌抑制素中和测定

通过标准的方法从阶段8-9囊胚期爪蟾胚胎取出外胚层外植体并将其 在18℃下在0.5×MBS(1×MBS：88mM NaCl、1mM KCl、0.7mM CaCl2、 1mM MgSO4、5mM HEPES、2.5mM NaHCO3、1∶1000v/v艮他霉素、 0.1％牛血清清蛋白)(加入了生长因子(GDF8或GDF11)的以+标示或指明) 中培养18小时，经历该时间，对照胚胎达到早期神经胚期(阶段15-16)。 对外植体照相，并且使用设计用于动物冠定量的图像分析算法测量各外植 体的长度。未用生长因子或Fab(对照)处理的外植体长成球形表皮。肌抑 制素和GDF-11在这些外胚层外植体中诱导使外植体延长并且形成哑铃状 结构的中胚层。当就中和活性进行检测时，在整个培养期长度中将抗体或 Fab加入含有肌抑制素的培养基中，然后估量它们抑制生长因子诱导的延 伸运动的能力。以25ng/ml向外植体加入肌抑制素。以20μg/ml加入待测 试的抗体或Fab。将针对无关抗原产生的Fab用作对照。可将商购可获得 的单克隆抗小鼠GDF8抗体作为对照进行检测，这一抗体在用纯化的小鼠 GDF8免疫的山羊中产生，并由厂商证明当以大约10-20μg/ml的存在时， 中和由25ng/ml的鼠类GDF8引发的爪蟾动物冠的延伸(安迪生物有限公 司(R&D Systems)货号MAB788)。

ImagePro(v4.5.1.22，来自美迪赛博公司(Media Cybernetics))用于 图象处理。写入宏指令以使图像处理自动化。宏指令处理图像和记录以比 特为单位的长度。如本领域内已知的可使用可供选择的测量方法。本发明 的抗体在动物冠测定中涉及中和GDF8的活性但不具有GDF-11中和活性。

实施例4：Fab的亲和力测量

使用包含CM4传感器芯片的2000仪器测量本发明的抗肌抑 制素Fab的亲和力(KD)和kon以及koff率。利用表面等离振子共 振的光学性质来检测葡聚糖生物传感器基质中的相互作用的分子的蛋白质 浓度的改变。除了已指出的，所有试剂和材料均购自百克AB公司 (Upsala，Sweden)。在25℃下进行所有测量。将包含Fab 的样品溶解在HBS-EP缓冲液(150mM氯化钠、3mM EDTA、0.05％(w/v) 表面活性剂P-20和10mM HEPES，pH 7.4)中。使用氨偶联化学将肌抑制 素或GDF-11(安迪生物有限公司(R&D Systems))固定在CM4芯片的流 动室上。使用0.1M N-羟基琥珀酰亚胺和0.1M 3-(N，N-二甲氨基)丙基-N- 乙基碳二胺的1∶1混合物以20μl/分钟的流速活化流动室(1-4)。以10μL/ 分钟的流速，对单个流动室手动注射肌抑制素或GDF-11(在10mM醋酸 钠中的2.5μg/mL，pH 4.5)。监测表面密度，直至各流动室达到大约150个 反应单位(RU)的表面密度。用50μl 1M乙醇胺-HCl，pH 8.5(10μL/分钟) 的注射封闭表面。为确保完全除去任何非共价结合的肌抑制素或GDF-11， 两次注射15μl 的10mM甘氨酸，pH 1.5。用于动力学实验的运行缓冲液 包含10mM HEPES，pH 7.4、150mM NaCl、0.005％P20。

在最大流速(100μl/分钟)进行动力结合数据的收集。各分析循环由：(i) 对所有4个流动室进行250μl Fab(以2倍的稀释增量(dilution increment) 从50nM至0.4nM的浓度范围)注射，其中以流动室1作变参照流动室； (ii)20分钟的解离(缓冲液流动)，(iii)通过两次15μl 10mM甘氨酸，pH 1.5 的注射再生GDF-8或GDF-11表面，(iv)15μl运行缓冲液的空白注射，和 (v)在下一个循环开始之前进行2分钟的稳定时间。按照流动室2减去流 动室1，流动室3减去流动室1和流动室4减去流动室1来监控信号。以 随机的顺序一式两份注射样品和缓冲液空白。使用SCRUBBER(生物分子 相互作用分析中心(Center for Biomolecular Interaction Analysis)，Univ. of Utah)软件处理数据。通过使用ClampXP(生物分子相互作用分析中心， Univ.of Utah)将生物传感器数据拟合简单的关联模型来确定每一个循环的 结合和解离率，从而得出kon和koff速率常数；使用关系式Kd＝koff/kon计算 平衡结合常数Kd。测得的肌抑制素对510C2 Fab的结合的亲和力数据是： 5.4×105M-1s-1的kon、4.67×10-4秒-1的koff和0.87nM的Kd(计算值)。未 观察到510C2 Fab对GDF-11的结合。

实施例5：Mab的亲和力的测量

使用Sapidyne KINEXA测定法确定本发明的全长单克隆抗体的结合 亲和力测量。使用本发明的的抗体预包被NHS激活的快速流动琼脂糖珠子 (GE健康护理公司(GE Healthcare))(每ml的珠子50μg抗肌抑制素抗 体)，并且用1M Tris-HCl，pH 8.0中的10mg/ml BSA进行封闭。然后在 室温下将20pM和50pM的本发明的抗体与不同浓度(例如，2.4pM至20 nM，连续稀释)的肌抑制素一起在运行缓冲液(PBS、0.005％(v/v) Tween-20、1mg/ml卵清蛋白)中温育10小时。为确定平衡时游离抗体的 存在，使各样品通过包被肌抑制素的珠子。然后通过使在运行缓冲液中以 1∶4000稀释的荧光(Cy5)标记的山羊抗人Fc抗体(杰克免疫研究公司 (Jackson Immuno Research))的溶液通过珠子来定量结合珠子的抗体的 量。测量的荧光信号与平衡时游离抗体的浓度成正比。以一式两份测量肌 抑制素的各浓度。使用多重曲线、单点同质结合模型(one-site homogeneous binding model)(KINEXA软件)从竞争曲线的非线性回归获得平衡解离常 数(KD)并以95％的置信区间(CI)显示数据。

也使用Sapidyne KINEXA测定确定GDF-8的结合速率常数(kon)。使 用上述的相同条件将20pM的抗体与1nM GDF-8混合。在不同的时间点 上，使用上述的用于平衡结合的条件就游离的抗体探测样品，然后使用 KINEXA软件使所得的时间依赖性拟合以确定结合速率(kon)。使用表达式 koff＝KD×kon计算解离速率常数(koff)。当使用描述的测定测量全长510C2 和C12(有效连接至IgG4 Fc区)时，结果描述于下面的表3中。

表3

  Mab   Kd，pM(95％CI)   kon，M-1，s-1(95％CI) 计算的koff，s-1   510C2   80(41-134)   1.38×105  (1.08-1.75×105) 1.11×10-5   C12   108(23-294)   7.42×104  (6.83-8.01×104) 8.02×10-6

实施例6  肌抑制素/SBE报告基因测定法

在该报告基因测定中，当分子例如肌抑制素、GDF-11或其他TGF-β 超家族成员结合其自身受体从而触发产生能够结合SBE的磷酸化SMAD 复合物的SMAD信号传导时，编码SMAD结合元件(“SBE”)(更具体地 (CAGA)12)下游的报告基因(即萤光素酶基因)的质粒表达萤光素酶蛋白 质。以前报导CAGA序列为TGF-β诱导的基因PAI-1的启动子内的TGF-β 应答序列(Denner等人，EMBO J.，17：3091-3100，1998)。暴露于细胞的活性 肌抑制素的量与产生的萤光素酶的量直接成正比，所述萤光素酶的量与产 生的并且为可测量的光量直接成正比。抑制剂(例如，结合肌抑制素的抗 体)的存在减少了能够激活SBE的肌抑制素的量，这最终导致光的产生减 少。在此处引用的国际公开号WO 2004/037861中也描述了该测定法。

要了解肌抑制素/SBE报告基因测定法不限于此处描述的确定的条 件，也可使用其他类型的细胞，例如293HEK(ATCC)或A204 Rhabso肌 肉瘤细胞(Rhabsomyosarcoma cell)(参见，例如，Whittemore，等人 BBRC，200：965-71，2003)；可使用其他类型的报告基因例如CAT、 β-gal、GFP和用于细胞生长的其他生长条件和测定条件，包括在反应中 可使用不同量的肌抑制素。本领域技术人员将能够容易地确定测定是否落 在肌抑制素/SBE报告基因测定的范围内，这根据其具有被导入宿主细胞的 包含位于报告基因的上游的SBE元件的载体，其中使用的SBE元件应答 SMAD，所述SMAD是响应肌抑制素结合肌抑制素的受体而产生的。R.S. Thies，等人，Growth Factors，18：251-259，2001描述了相似的测定法而 Wittemore，L.等人，BBRC，300：965-971，2003描述了对响应肌抑制素结合 其受体而产生的SMAD起反应的SBE元件。

在该测定中，将DMEM/F12培养基(3∶1)(吉布克公司(Gibco) 93-0152DK)、10％FBS、20mM Hepes、4mM L-谷氨酰胺中的293E细胞 (艾格生物技术公司(Edge Biosystems))以每孔大约25000个细胞接种在 96孔板(BD生物科学系统公司(BD)Biocoat 35-4461)的多聚赖氨酸包被 的内孔中，并且在37℃下温育过夜。第二天，在PBS中洗涤细胞，并且 每孔加入50μl OptiMEM I(吉布克公司(Gibco)31985-070)。用50μl 下列SBE-萤光素酶DNA混合物转染细胞：(i)将80μl Lipofectamine(吉 布克公司(Gibco)11668-019)与1.5ml OptiMEM混合并让其放置5分钟， 然后加入(ii)试管(在所述试管中将20μg SBE萤光素酶DNA与1.5ml OptiMEM和200μl Plus试剂混合)，混合，并且使其放置5分钟。在将 两种混合物加在一起后，剧烈地混合溶液，然后在向各孔加入50μl之前 让其静置30分钟。然后在37℃下在5％CO2中温育细胞过夜。对于每块 平板的细胞，将5ml肌抑制素(安迪生物有限公司(R&D Systems)788-G8) 在完全培养基中稀释至20ng/ml。在完全培养基中滴定待检测的本发明的 各抗体，例如从大约40μg/ml至50ng/ml。从小孔中移出转染培养基，每 孔加入50μl抗体稀释液，并且每孔加入50μl GDF-8(肌抑制素)或GDF-11 (安迪生物有限公司(R&D Systems))。然后将细胞平板在37℃下在5％ CO2中温育过夜。第二天，吸取培养基，在PBS中洗涤细胞，并且加入75 μl裂解缓冲液(普洛麦格公司(Promega)E266A)。按照厂商说明书(普洛 麦格公司(Promega)E2620)使用萤光素酶试剂测量细胞裂解物中的萤光 素酶的活性。将发光对Log10 Mab浓度(μg/ml)作图，计算各Mab对于肌 抑制素和GDF-11的IC50。

当在这些条件下用GDF-8进行检测时，单克隆抗体510C2、C12分别 产生5.15nM(5.74和4.57nM)和16.07nM(23.04和9.12nM)的IC50值 (来自两个试验的平均值)。当用GDF-11取代GDF-8进行检测时，510C2 和C12mAb在该测定中都不显示中和活性。

实施例7  药物动力学

可以以1mg/kg的剂量在单次静脉内(IV)或腹膜内(IP)施用后在 C57B6/SCID小鼠中估量本发明抗体的药物动力学(PK)。使动物接受上 述剂量的未标记的和125I标记的抗体的混合物，基于血清中的125I放射性 和注射的剂量的特异性活性确定血清浓度。将静脉内或腹膜内施用的抗体 的血清浓度对时间作图。

实施例8  对肌肉质量和强度的体内效应

为确定本发明的抗体是否在体内阻断肌抑制素的活性，在成年SCID 小鼠中检测本发明的抗体。SCID小鼠患有严重的联合免疫缺陷(severe combined immune deficiency)，从而在注射本发明的抗体后不能产生免疫 反应。肌肉质量用作用本发明抗体处理的小鼠中肌抑制素活性的指标。

对雄性C57B6 SCID 8周龄小鼠进行称重，按体重将其平衡分配至8 个组。将PBS缓冲液中的本发明的抗体以不同的剂量(例如，60、10、5 和1mg/kg)每周腹膜内注射入小鼠。PBS处理的或未处理的小鼠用作对照。 处理持续4至12周。在处理后通过解剖和称重腓肠肌和四头肌肌肉来估量 肌肉质量。

为确定肌肉力量，使用握力检测计(例如，型号1027csx，哥伦布仪器 公司(Columbus Instruments))测量前肢的力量。

序列表

<110>伊莱利利公司(Eli Lilly and Company)

<120>抗肌抑制素抗体

<130>X-17158

<140>US 60/726,062

<141>2005-10-12

<150>US 60/725,235

<151>2005-10-11

<150>US 60/724,670

<151>2005-10-06

<160>87

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>375

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

Met Gln Lys Leu Gln Leu Cys Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile

1               5                   10                  15

Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn

            20                  25                  30

Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr

        35                  40                  45

Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu

    50                  55                  60

Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Val Ile Arg Gln Leu

65                  70                  75                  80

Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val

                85                  90                  95

Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His

            100                 105                 110

Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu

        115                 120                 125

Met Gln Val Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser

    130                 135                 140

Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu

145                 150                 155                 160

Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu

                165                 170                 175

Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu

            180                 185                 190

Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val

        195                 200                 205

Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly

    210                 215                 220

Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr

225                 230                 235                 240

Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys

                245                 250                 255

Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys

            260                 265                 270

Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val

        275                 280                 285

Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr

    290                 295                 300

Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys

305                 310                 315                 320

Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala

                325                 330                 335

Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr

            340                 345                 350

Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val

        355                 360                 365

Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser

    370                 375

<210>2

<211>109

<212>PRT

<213>人

<400>2

Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys

1               5                   10                  15

Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile

            20                  25                  30

Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu

        35                  40                  45

Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala

    50                  55                  60

Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser

65                  70                  75                  80

Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly

                85                  90                  95

Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser

            100                 105

<210>3

<211>109

<212>PRT

<213>羊属物种(Ovis sp.)

<400>3

Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys

1               5                   10                  15

Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile

            20                  25                  30

Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu

        35                  40                  45

Phe Leu Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala

    50                  55                  60

Asn Pro Lys Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser

65                  70                  75                  80

Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly

                85                  90                  95

LysIle Pro Gly Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser

           100                 105

<210>4

<211>109

<212>PRT

<213>人

<400>4

Asn Leu Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Ser Glu Ser Arg Cys Cys

1               5                   10                  15

Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile

            20                  25                  30

Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Gln Cys Glu

        35                  40                  45

Tyr Met Phe Met Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val Gln Gln Ala

    50                  55                  60

Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser

65                  70                  75                  80

Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Asp Lys Gln Gln Ile Ile Tyr Gly

                85                  90                  95

Lys Ile Pro Gly Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser

            100                 105

<210>5

<211>106

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>5

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met

            20                  25                  30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

        35                  40                  45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65                  70                  75                  80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Tyr Arg Asn Pro Leu Thr

                85                  90                  95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>6

<211>106

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>6

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met

            20                  25                  30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

        35                  40                  45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Val Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65                  70                  75                  80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Tyr Arg Asn Pro Leu Thr

                85                  90                  95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>7

<211>106

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>7

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met

            20                  25                  30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

        35                  40                  45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65                  70                  75                  80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Tyr Ser Asn Pro Leu Thr

                85                  90                  95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>8

<211>106

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Ser

            20                  25                  30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

        35                  40                  45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65                  70                  75                  80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Tyr Ser Asn Pro Leu Thr

                85                  90                  95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>9

<211>106

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Ala

            20                  25                  30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

        35                  40                  45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65                  70                  75                  80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Tyr Ser Asn Pro Leu Thr

                85                  90                  95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>10

<211>106

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>10

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu SerAla Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met

            20                  25                  30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

        35                  40                  45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65                  70                  75                  80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Tyr Leu Asn Pro Leu Thr

                85                  90                  95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>11

<211>106

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met

            20                  25                  30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

        35                  40                  45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65                  70                  75                  80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Tyr Glu Asn Pro Leu Thr

                85                  90                  95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>12

<211>106

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>12

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met

            20                  25                  30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

        35                  40                  45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65                  70                  75                  80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Tyr Phe Asn Pro Leu Thr

                85                  90                  95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>13

<211>124

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>13

Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln

1               5                   10                  15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Arg Lys Val

            20                  25                  30

Gly Ser Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

        35                  40                  45

Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser

    50                  55                  60

Leu Arg Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

65                  70                  75                  80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

                85                  90                  95

Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Met Asp

            100                 105                 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>14

<211>124

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>14

Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln

1               5                   10                  15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Arg Lys Val

            20                  25                  30

Gly Ser Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

        35                  40                  45

Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser

    50                  55                  60

Leu Arg Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

65                  70                  75                  80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

                85                  90                  95

Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Phe Asp

            100                 105                 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>15

<211>123

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>15

Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln

1               5                   10                  15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Arg Lys Val

            20                  25                  30

Gly Arg Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

        35                  40                  45

Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser

    50                  55                  60

Leu Arg Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

65                  70                  75                  80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

                85                  90                  95

Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Phe Asp

            100                 105                 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Val Ser Ser

        115                 120

<210>16

<211>124

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>16

Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln

1               5                   10                  15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Trp Arg Lys Val

            20                  25                  30

Gly Ser Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

        35                  40                  45

Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser

    50                  55                  60

Leu Arg Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

65                  70                  75                  80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro ValAsp Thr Ala Thr Tyr Tyr

                85                  90                  95

Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Phe Asp

            100                 105                 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>17

<211>124

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>17

Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln

1               5                   10                  15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Arg Lys Val

            20                  25                  30

Gly Ser Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

        35                  40                  45

Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Leu Arg Tyr Asn Pro Ser

    50                  55                  60

Leu Arg Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

65                  70                  75                  80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

                85                  90                  95

Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Phe Asp

            100                 105                 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>18

<211>124

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>18

Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln

1               5                   10                  15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Met Arg Lys Val

            20                  25                  30

Gly Ser Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

        35                  40                  45

Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser

    50                  55                  60

Leu Arg Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

65                  70                  75                  80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

                85                  90                  95

Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Phe Asp

            100                 105                 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>19

<211>124

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>19

Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln

1               5                   10                  15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Arg Lys Val

            20                  25                  30

Gly Ser Ser Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

        35                  40                  45

Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser

    50                  55                  60

Leu Arg Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

65                  70                  75                  80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

                85                  90                  95

Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Phe Asp

            100                 105                 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>20

<211>124

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>20

Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln

1               5                   10                  15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Arg Lys Val

            20                  25                  30

Gly Ser Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

        35                  40                  45

Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser

    50                  55                  60

Leu Arg Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

65                  70                  75                  80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

                85                  90                  95

Cys Ala Arg Arg Lys Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Phe Asp

            100                 105                 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>21

<211>124

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>21

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1               5                   10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Arg Arg Val

            20                  25                  30

Gly Ser Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

        35                  40                  45

Trp Ile Gly His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser

    50                  55                  60

Leu Arg Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65                  70                  75                  80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

                85                  90                  95

Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Phe Asp

            100                 105                 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>22

<211>124

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>22

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1               5                   10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Arg Met Val

            20                  25                  30

Gly Ser Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

        35                  40                  45

Trp Ile Gly His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Leu Asn Pro Ser

    50                  55                  60

Leu Arg Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65                  70                  75                  80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

                85                  90                  95

Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Phe Asp

            100                 105                 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>23

<211>124

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>23

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1               5                   10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Arg Lys Val

            20                  25                  30

Gly Ser Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

        35                  40                  45

Trp Ile Gly His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Leu Arg Tyr Asn Pro Ser

    50                  55                  60

Leu Arg Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65                  70                  75                  80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

                85                  90                  95

Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Phe Asp

           100                 105                 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>24

<211>124

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>24

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1               5                   10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Arg Lys Val

            20                  25                  30

Gly Ser Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

        35                  40                  45

Trp Ile Gly His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser

    50                  55                  60

Leu Arg Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65                  70                  75                  80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

                85                  90                  95

Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Phe Asp

            100                 105                 110

Met Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>25

<211>124

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>25

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1               5                   10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Arg Lys Val

            20                  25                  30

Gly Ser Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

        35                  40                  45

Trp Ile Gly His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser

    50                  55                  60

Leu Arg Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65                  70                  75                  80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

                85                  90                  95

Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Phe Asp

            100                 105                 110

Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>26

<211>124

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>26

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1               5                   10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Arg Lys Val

            20                  25                  30

Gly Ser Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

        35                  40                  45

Trp Ile Gly His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Leu Asn Pro Ser

    50                  55                  60

Leu Arg Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65                  70                  75                  80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

                85                  90                  95

Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Phe Asp

            100                 105                 110

Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>27

<211>10

<212>PRT

<213>小鼠属物种(Mus sp.)

<400>27

Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met His

1               5                   10

<210>28

<211>10

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>28

Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Ser His

1               5                   10

<210>29

<211>123

<212>PRT

<213>小鼠属物种

<400>29

Gln Val Thr Leu Lys Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Ser Ser Gln Thr

1               5                   10                  15

Leu Thr Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser Gly

            20                  25                  30

Met Ile Val Ser Trp Ile Arg Gln Ser Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp

        35                  40                  45

Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu

    50                  55                  60

Arg Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val Phe

65                  70                  75                  80

Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Arg Gly Ile Thr Thr Val Leu Gly Gly Gly Thr Met Asp Tyr

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>30

<211>7

<212>PRT

<213>小鼠属物种

<400>30

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Arg

1               5

<210>31

<211>9

<212>PRT

<213>小鼠属物种

<400>31

Gln Gln Trp Tyr Arg Asn Pro Leu Thr

1               5

<210>32

<211>9

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>32

Gln Gln Trp Tyr Ser Asn Pro Leu Thr

1               5

<210>33

<211>9

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>33

Gln Gln Trp Tyr Leu Asn Pro Leu Thr

1               5

<210>34

<211>9

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>34

Gln Gln Trp Tyr Glu Asn Pro Leu Thr

1               5

<210>35

<211>9

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>35

Gln Gln Trp Tyr Phe Asn Pro Leu Thr

1               5

<210>36

<211>12

<212>PRT

<213>小鼠属物种

<400>36

Gly Phe Ser Leu Arg Lys Val Gly Ser Ser Val Ser

1               5                   10

<210>37

<211>12

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>37

Gly Phe Ser Leu Arg Lys Val Gly Arg Ser Val Ser

1               5                  10

<210>38

<211>12

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>38

Gly Phe Ser Trp Arg Lys Val Gly Ser Ser Val Ser

1               5                   10

<210>39

<211>12

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>39

Gly Phe Ser Met Arg Lys Val Gly Ser Ser Val Ser

1               5                   10

<210>40

<211>12

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>40

Gly Phe Ser Leu Arg Lys Val Gly Ser Ser Ile Ser

1               5                   10

<210>41

<211>12

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>41

Gly Phe Ser Leu Arg Arg Val Gly Ser Ser Val Ser

1               5                   10

<210>42

<211>12

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>42

Gly Phe Ser Leu Arg Met Val Gly Ser Ser Val Ser

1               5                   10

<210>43

<211>16

<212>PRT

<213>小鼠属物种

<400>43

His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Asn

1               5                   10                  15

<210>44

<211>16

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>44

His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Leu Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Asn

1               5                   10                  15

<210>45

<211>16

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>45

His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Leu Asn Pro Ser Leu Arg Asn

1               5                   10                  15

<210>46

<211>16

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>46

His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Leu Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Asn

1               5                   10                  15

<210>47

<211>14

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>47

Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Met Asp Tyr

1               5                   10

<210>48

<211>14

<212>PRT

<213>小鼠属物种

<400>48

Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Phe Asp Tyr

1               5                   10

<210>49

<211>14

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>49

Arg Lys Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Phe Asp Tyr

1               5                   10

<210>50

<211>14

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>50

Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Phe Asp Met

1               5                   10

<210>51

<211>14

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>51

Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Phe Asp Leu

1               5                   10

<210>52

<211>7

<212>PRT

<213>人

<400>52

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Val

1               5

<210>53

<211>25

<212>PRT

<213>人

<400>53

Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr

1               5                   10                  15

Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala

            20                  25

<210>54

<211>124

<212>PRT

<213>小鼠属物种

<400>54

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Ser Ser Gln

1               5                   10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

            20                  25                  30

Gly Met Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

        35                  40                  45

Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser

    50                  55                  60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val

65                  70                  75                  80

Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

                85                  90                  95

Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Leu Gly Gly Gly Thr Met Asp

            100                 105                 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>55

<211>124

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>55

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1               5                   10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Arg Lys Val

            20                  25                  30

Gly Ser Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

        35                  40                  45

Trp Ile Gly His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser

    50                  55                  60

Leu Arg Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65                  70                  75                  80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

                85                  90                  95

Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Phe Asp

            100                 105                 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>56

<211>124

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<400>56

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1               5                   10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Arg Lys Val

            20                  25                  30

Gly Ser Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

        35                  40                  45

Trp Ile Gly His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Leu Asn Pro Ser

    50                  55                  60

Leu Arg Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65                  70                  75                  80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

                85                  90                  95

Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Phe Asp

            100                 105                 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>57

<211>10

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<220>

<221>X

<222>(9)..(9)

<223>X是S或A

<400>57

Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Xaa His

1               5                   10

<210>58

<211>9

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<220>

<221>X

<222>(5)..(5)

<223>X是S、R、L、E或F

<400>58

Gln Gln Trp Tyr Xaa Asn Pro Leu Thr

1               5

<210>59

<211>12

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<220>

<221>X

<222>(4)..(4)

<223>X是L、W或M

<220>

<221>X

<222>(6)..(6)

<223>X是K、R或M

<220>

<221>X

<222>(9)..(9)

<223>X是S或R

<400>59

Gly Phe Ser Xaa Arg Xaa Val Gly Xaa Ser Val Ser

1               5                   10

<210>60

<211>16

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<220>

<221>X

<222>(8)..(8)

<223>X是K或L

<220>

<221>X

<222>(10)..(10)

<223>X是Y或L

<400>60

His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Xaa Arg Xaa Asn Pro Ser Leu Arg Asn

1               5                   10                  15

<210>61

<211>14

<212>PRT

<213>人造

<220>

<223>合成构建体

<220>

<221>X

<222>(2)..(2)

<223>X是A或K

<220>

<221>X

<222>(12)..(12)

<223>X是M或F

<220>

<221>X

<222>(14)..(14)

<223>X是M或L

<400>61

Arg Xaa Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Xaa Asp Xaa

1               5                   10

<210>62

<211>15

<212>PRT

<213>人

<400>62

Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His

1               5                   10                  15

<210>63

<211>124

<212>PRT

<213>小鼠属物种

<400>63

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln

1               5                   10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Leu Ser Gly Phe Ser Leu Arg Thr Ser

            20                  25                  30

Gly Met Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Ser Ser Gly Lys Gly Leu Glu

        35                  40                  45

Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Glu Arg Tyr Asn Pro Ser

    50                  55                  60

Leu Arg Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Leu Arg Asn Gln Val

65                  70                  75                  80

Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Gly Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

                85                  90                  95

Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Met Asp

            100                 105                 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>64

<211>124

<212>PRT

<213>小鼠属物种

<400>64

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Met Leu Gln Ser Ser Gln

1               5                   10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Leu Ser Gly Phe Ser Leu Arg Thr Ser

            20                  25                  30

Gly Met Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Ser Ser Gly Lys Gly Leu Glu

        35                  40                  45

Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser

    50                  55                  60

Leu Arg Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Leu Arg Asn Gln Val

65                  70                  75                  80

Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Gly Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

                85                  90                  95

Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Met Asp

            100                 105                 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>65

<211>23

<212>PRT

<213>人

<400>65

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

            20

<210>66

<211>15

<212>PRT

<213>人

<400>66

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1               5                   10                  15

<210>67

<211>32

<212>PRT

<213>人

<400>67

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1               5                   10                  15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

            20                  25                  30

<210>68

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>68

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1               5                   10

<210>69

<211>24

<212>PRT

<213>人

<400>69

Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Thr Gln Thr

1               5                   10                  15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser

            20

<210>70

<211>14

<212>PRT

<213>人

<400>70

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala

1               5                   10

<210>71

<211>32

<212>PRT

<213>人

<400>71

Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr

1               5                   10                  15

Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg

            20                  25                  30

<210>72

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>72

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

1               5                   10

<210>73

<211>25

<212>PRT

<213>人

<400>73

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1               5                   10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser

            20                  25

<210>74

<211>14

<212>PRT

<213>人

<400>74

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1               5                   10

<210>75

<211>32

<212>PRT

<213>人

<400>75

Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys

1               5                   10                  15

Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

            20                  25                  30

<210>76

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>76

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1               5                   10

<210>77

<211>109

<212>PRT

<213>小鼠属物种

<400>77

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met

            20                  25                  30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

        35                  40                  45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65                  70                  75                  80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Tyr Ser Asn Pro Leu Thr

                85                  90                  95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp

            100                 105

<210>78

<211>109

<212>PRT

<213>小鼠属物种

<400>78

Gln Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val His Tyr Met

            20                  25                  30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

        35                  40                  45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65                  70                  75                  80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr

                85                  90                  95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp

            100                 105

<210>79

<211>109

<212>PRT

<213>小鼠属物种

<400>79

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

            20                  25                  30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

        35                  40                  45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65                  70                  75                  80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr

                85                  90                  95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp

            100                 105

<210>80

<211>109

<212>PRT

<213>小鼠属物种

<400>80

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

            20                  25                  30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

        35                  40                  45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65                  70                  75                  80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Leu Thr

                85                  90                  95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp

            100                 105

<210>81

<211>109

<212>PRT

<213>小鼠属物种

<400>81

Gln Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met

            20                  25                  30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

        35                  40                  45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65                  70                  75                  80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Tyr Ser Asn Pro Leu Thr

                85                  90                  95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp

            100                 105

<210>82

<211>109

<212>PRT

<213>小鼠属物种

<400>82

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met

            20                  25                  30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

        35                  40                  45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65                  70                  75                  80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Asn Pro Leu Thr

                85                  90                  95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp

            100                 105

<210>83

<211>109

<212>PRT

<213>小鼠属物种

<400>83

Gln Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Tyr Tyr Met

            20                  25                  30

His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Ala Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

        35                  40                  45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65                  70                  75                  80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Tyr Asn Pro Leu Thr

                85                  90                  95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp

            100                 105

<210>84

<211>109

<212>PRT

<213>小鼠属物种

<400>84

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

            20                  25                  30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

        35                  40                  45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65                  70                  75                  80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Tyr Ser Asn Pro Leu Thr

                85                  90                  95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp

            100                 105

<210>85

<211>109

<212>PRT

<213>小鼠属物种

<400>85

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Glu Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Met

            20                  25                  30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

        35                  40                  45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65                  70                  75                  80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Asn Pro Leu Thr

                85                  90                  95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp

            100                 105

<210>86

<211>124

<212>PRT

<213>小鼠属物种

<400>86

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Ser Ser Gln

1               5                   10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Leu Ser Gly Phe Ser Leu Arg Thr Ser

            20                  25                  30

Gly Met Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Ser Ser Gly Lys Gly Leu Glu

        35                  40                  45

Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser

    50                  55                  60

Leu Arg Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Leu Arg Asn Gln Val

65                  70                  75                  80

Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Gly Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

                85                  90                  95

Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Met Asp

            100                 105                 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>87

<211>123

<212>PRT

<213>小鼠属物种

<400>87

Gln Val Thr Leu Lys Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Ser Ser Gln Thr

1               5                   10                  15

Leu Thr Leu Thr Cys Ser Leu Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser Gly

            20                  25                  30

Met Ile Val Ser Trp Ile Arg Gln Ser Ser Gly Arg Gly Leu Glu Trp

        35                  40                  45

Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu

    50                  55                  60

Arg Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Leu Arg Asn Gln Val Phe

65                  70                  75                  80

Leu Trp Ile Ser Ser Val Gly Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Met Asp Tyr

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

        115                 120