可高效降解长残留除草剂异噁草酮的降解菌及其培养方法
(一)技术领域
本发明涉及的是一种生物制剂，本发明也涉及一种是物制剂的制备方法，本 发明还涉及一种生物制剂的应用方法。
(二)背景技术
化学农药的使用大大促进了农业现代化的发展，为农业生产挽回了大量因草 害等原因造成的损失，在推进农业生产的现代化进程中起了至关重要的作用。但 农药作为环境外来物质，它们进入生态系统后，必定对生态系统产生影响。
高活性、长残效除草剂，如阿特拉津、绿磺隆、氯嘧磺隆、咪唑乙烟酸、胺 苯磺隆、异噁草酮等，近年来在我国东北地区得到了广泛的应用，对农业的增产 增收起到了不可估量的作用，它们在土壤中残效期长达2-3年，而且连续使用在 土壤中会累积，这使其在轮作换茬中，对后茬敏感作物(蔬菜、水稻、甜菜、油 菜等)易造成严重药害，给农业生产造成重大损失，甚至绝产，这一事实已严重 影响我国特别是黑龙江省农业种植结构的调整和经济的发展，农药残留直接影响 到绿色食品的生产和农产品进入国际市场的竞争力。除此之外，长残留除草剂给 退耕还林工作带来很大的困难与挑战，药剂残留严重地降低了树种的成活率，造 成了巨大的浪费和损失，严重阻碍了我国生态目标的实现。
解决长残留除草剂危害的途径主要有：①开发除草剂新品种以代替现有长残 留性除草剂，但由于对靶标酶的了解程度不够，加之开发一个农药新品种要投入 资金数亿美元，所以难度很大。②转向抗除草剂转基因作物品种的选育，寻找、 发现并分离出抗性基因，进而将抗性基因导入作物。目前仅有抗草甘膦大豆、棉 花、玉米、小麦、油菜和甜菜等商品化，而且有关转基因的产品和食物还有很大 的争议；而且需要投入大量的研究经费和人力，要经历较长的研究过程，距离实 际应用还很遥远。③使用安全剂，这有涉及到另外一种化学物质的投放于环境中， 会造成二次污染的问题。④利用内源植物生长调节剂(赤霉素、吲哚乙酸、芸薹 素内酯和康凯等)缓解除草剂的药害，但不能起到净化土壤的作用⑤利用源于土 壤的微生物降解，才是真正能消除长残留除草剂污染的有效途径。微生物源于自 然，又回归自然，高效、安全，无二次污染。因此，生物降解是环境中去除有机 污染物的主要途径，是生物修复的主要过程，也是目前解决长残留除草剂危害的 切实可行的有效途径。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种可高效降解长残留除草剂异噁草酮的降解菌，本 发明的目的还在于提供一种降解菌的培养方法。
本发明的目的是这样实现的：
本发明提供的可高效降解长残留除草剂异噁草酮的降解菌是分类命名为木糖 氧化无色杆菌木糖氧化亚种(Achromobacter xylosoxidans ss xylosoxidans)； 具有如下特性：最适生长温度是30℃，最适pH为6.0-9.0，能以异噁草酮为唯一 碳源生长，在普通的培养条件下活菌数就可以达到和超过1亿/克(毫升)。
本发明的可高效降解长残留除草剂异噁草酮的降解菌是采用这样的方法来培 养的：
1、土样：采自长期施用长残留性除草剂的土壤；
2、菌体的富集和分离
将长期施用长残留性除草剂的土壤样品混合均匀，称取10g加入到含有 200mg·L-1异噁草酮的50ml富集培养液中，置于30℃，120r·min-1的摇床培养， 以后每周添加10ml新鲜培养液，每次增加异噁草酮的浓度，使其浓度分别为200、 400、800、1600、2000、3000、4000、5000mg·L-1，富集培养时间分别为2个月， 培养液中异噁草酮浓度达到5000mg·L-1后，适应性培养一周，用平板稀释法将其 涂布在含有200mg·L-1异噁草酮的无机盐培养基上，挑取单菌落，划线纯化，将纯 化后的单菌落保存。
所述培养基(液)的成分及配比如表1：
表1培养基(液)的成分及配比
培养基名称 培养基成分 富集培养液 无机盐培养基 牛肉膏：3g，蛋白胨：5g，NaCl：5g，K2HPO4：5g， 蒸馏水：1000ml，pH：7.0-7.2 KH2PO4：1.70g，K2HPO4：5.17g，(NH4)2SO4：2.6g， 水：1000ml.，盐溶液：10ml，PH：7.0-7.2 盐溶液构成：MgSO4：19.5g，MnSO4：5g，FeSO4：5g， CaCl2：0.3g，水：1000ml
本发明提供的可高效降解长残留性除草剂异噁草酮的降解菌的鉴定
1、可高效降解长残留除草剂异噁草酮的降解菌菌株的形态特征
W2菌株在牛肉膏蛋白胨培养基中划线，置于30℃恒温培养箱中培养24h后， 观察菌落特征为：表面光滑、湿润、凸起，边缘微锯齿状，平面生长，不透明， 培养基暗黄色。
将可高效降解长残留除草剂异噁草酮的降解菌接种在装有牛肉膏蛋白胨培养 液的试管中，置于30℃恒温培养箱中培养24h后，观察培养液状态发现，培养液 呈混浊状态，无沉淀，表面无菌膜。
2、可高效降解长残留除草剂异噁草酮的降解菌菌株的生理生化特征
可高效降解长残留除草剂异噁草酮的降解菌菌株呈杆状，革兰氏染色阴性， 接触酶阳性，氧化酶阴性，能广泛利用氨基酸、有机酸，具体特征见表2.
表2W2菌株的生理生化特征
项目 结果 项目 结果 革兰氏染色 阴性 甲酸 + 细胞形状 杆状 D-半乳糖酸内酯 + 接触酶 + D-半乳糖醛酸 - 氧化酶 - 丙二酸 +W a-环糊精 - 丙酸 + 糊精 - 丁二酸 + 糖原 +W 溴代丁二酸 + Tween40 + 琥珀酰胺酸 + Tween80 + D-丙氨酸 + N-乙酰半乳糖胺 - L-天冬氨酸 + N-乙酰葡萄糖胺 - L-谷氨酸 + 核糖醇 - 甘氨酰天冬氨酸 + L-阿拉伯糖 + 甘氨酰谷氨酸 + D-阿糖醇 - L-组氨酸 + D-纤维二糖 - 羟基脯氨酸 - i-赤藓醇 - L-亮氨酸 + D-果糖 - L-鸟氨酸 + L-果糖 - L-苯丙氨酸 + D-半乳糖 - L-脯氨酸 + 龙胆二糖 - D-丝氨酸 - a-D-葡萄糖 + L-丝氨酸 + 麦芽糖 - L-苏氨酸 +W 甲基葡糖苷 - 肌苷 - D-棉子糖 - 脲苷 - D-鼠李糖 - 胸苷 - D-山梨醇 - 苯基乙胺 + 蔗糖 - 腐胺 - 木糖醇 - 2-氨基乙醇 - 丙酮酸甲酯 + 2，3-丁二醇 -W 丁二酸-甲酯 + 甘油 - 乙酸 + D-葡糖-1-磷酸 - 柠檬酸 + D-葡糖-6-磷酸 -
根据生理生化特性结合形态特征最终将可高效降解长残留除草剂异噁草酮的 降解菌菌株归类于木糖氧化无色杆菌木糖氧化亚种(Achromobacter xylosoxidans ss xylosoxidans)。
本发明提供的可高效降解长残留性除草剂异噁草酮的降解菌的用途：
该菌株可降解长残留性除草剂异噁草酮，可用于受到该物质污染的土壤的生 物修复。
1、可高效降解长残留除草剂异噁草酮的降解菌W2菌株在灭菌土壤中对
200μg·kg-1的异噁草酮的降解作用：
可高效降解长残留除草剂异噁草酮的降解菌W2菌株先在牛肉膏蛋白胨液体培 养液中培养至OD650＝0.4时，分别接种5ml·kg-1和20ml·kg-1的菌株至含药量为 200μg·kg-1的异噁草酮的土壤中，保持土壤的湿度为田间持水量的60％，定期测 定异噁草酮的降解情况如图1。从图1中可以看出，W2菌株经过20天左右的环境 适应后对土壤中残留的异噁草酮有了快速的利用，到第90天，有W2菌株的处理要 比对照多降解将近70％的异噁草酮。
2、可高效降解长残留除草剂异噁草酮的降解菌W2菌株在灭菌土壤中对 200μg·kg-1的异噁草酮的降解作用：
可高效降解长残留除草剂异噁草酮的降解菌W2菌株先在牛肉膏蛋白胨液体培 养液中培养至OD650＝0.4时，分别接种5ml·kg-1和20ml·kg-1的菌株至含药量为 200μg·kg-1的异噁草酮的土壤中，保持土壤的湿度为田间持水量的40％，定期测 定异噁草酮的降解情况如图2。从图2中可以看出，可高效降解长残留除草剂异噁 草酮的降解菌菌株在田间持水量的40％的土壤湿度下，适应环境条件需要的时间 稍长，快速利用异噁草酮的时间出现在第30天到第70天之间，到第90天时，土 壤中异噁草酮的残留率也只剩下20％左右。
3、可高效降解长残留除草剂异噁草酮的降解菌W2菌株在自然土壤中对 500μg·kg-1的异噁草酮的降解作用：
可高效降解长残留除草剂异噁草酮的降解菌W2菌株先在牛肉膏蛋白胨液体培 养液中培养至OD650＝0.4时，分别接种5ml·kg-1和20ml·kg-1的菌株至含药量为 500μg·kg-1的异噁草酮的土壤中，保持土壤的湿度为田间持水量的60％，定期测 定异噁草酮的降解情况如图3。从图3中可以看出，在自然条件下，异噁草酮可以 进行缓慢的降解，到第90天时，降解率达到将近40％，而在有可高效降解长残留 除草剂异噁草酮的降解菌菌株的情况下降解的速度整体表现出加快的趋势，到第 90天时，土壤中异噁草酮的残留率也只剩下10％左右。
(四)附图说明
图1是可高效降解长残留除草剂异噁草酮的降解菌W2菌株在田间持水量60 ％灭菌土壤中对200μg·kg-1的异噁草酮的降解情况；
图2是可高效降解长残留除草剂异噁草酮的降解菌W2菌株在田间持水量40 ％灭菌土壤中对200μg·kg-1的异噁草酮的降解情况；
图3是可高效降解长残留除草剂异噁草酮的降解菌W2菌株在田间持水量60 ％自然土壤中对500μg·kg-1的异噁草酮的降解情况。
(五)具体实施方式
下面举例对本发明做更详细地描述：
1、土样：采自黑龙江省哈尔滨市东北农业大学实验实习基地内长期施用长残 留性除草剂的土壤；
2、菌体的富集和分离
将长期施用长残留性除草剂的土壤样品混合均匀，称取10g加入到含有 200mg·L-1异噁草酮的50ml富集培养液中，置于30℃，120r·min-1的摇床培养， 以后每周添加10ml新鲜培养液，每次增加异噁草酮的浓度，使其浓度分别为200、 400、800、1600、2000、3000、4000、5000mg·L-1，富集培养时间分别为2个月， 培养液中异噁草酮浓度达到5000mg·L-1后，适应性培养一周，用平板稀释法将其 涂布在含有200mg·L-1异噁草酮的无机盐培养基上，挑取单菌落，划线纯化，将纯 化后的单菌落保存。
所述培养基(液)的成分及配比如表1：
表1培养基(液)的成分及配比
培养基名称 培养基成分 富集培养液 无机盐培养基 牛肉膏：3g，蛋白胨：5g，NaCl：5g，K2HPO4：5g， 蒸馏水：1000ml，pH：7.0-7.2 KH2PO4：1.70g，K2HPO4：5.17g，(NH4)2SO4：2.6g， 水：1000ml.，盐溶液：10ml，PH：7.0-7.2 盐溶液构成：MgSO4：19.5g，MnSO4：5g，FeSO4：5g， CaCl2：0.3g，水：1000ml