技术领域
本发明属于维氏气单胞菌检测技术领域，具体涉及维氏气单胞菌的LAMP 检测引物组和试剂盒。
背景技术
维氏气单胞菌(Aeromonasveronii，AV)又称维罗纳气单胞菌、凡隆气单胞菌 和维隆气单胞菌，广泛分布于人的食物链、水体环境和泥土中。可以通过饮水、 皮肤创伤等途径感染动物机体，并在体内经过不同途径对机体器官进行破坏，引 起人类食物中毒、脑膜炎和败血症等，同时，也能感染中华鳖、中华绒螯蟹、泥 鳅、锦鲤、斑点叉尾鮰等水产动物，并引起大量死亡，是一种新的人-畜-鱼共患 病的病原体，给人类健康带来危害，也给水产养殖业造成重大的经济损失。部分 国家已经将其规定为食品安全的检疫对象。因此，建立灵敏、准确、快捷、方便 的维氏气单胞菌检测方法是减少维氏气单胞菌的发生和危害的重要途径。
目前维氏气单胞菌的检测方法主要是生化鉴定和普通PCR方法，但是，前 者费时费力、检测样品量少、人为差异大、准确率低，尤其在鉴定到种的水平上， 比较困难，完全确诊需要1-3周时间，远不能满足日常快速检测工作的需要，后 者仪器设备贵、操作步骤多、人员要求高，而且灵敏度受一对引物的局限而使准 确度受到一定的影响，不适合基层单位及现场的快速检测。目前病原检测方法正 向更特异、更快速、费用低廉化的方向发展。建立检测维氏气单胞菌快速准确的 方法，是食品卫生检测和水产养殖传染病检测的需要。
环介导等温扩增（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）是日本学 者NOTOMI等于2000年开发的一种新的恒温核酸扩增技术，其特点是针对靶 基因的6（或8）个区域设计4（或6）种特异引物，利用链置换DNA聚合酶（Bst DNApolymerase）在65℃左右的恒温条件下，保温几十分钟，即可完成核酸扩 增反应。不需要模板的热变性、长时间温度循环、电泳等过程，基因的扩增及产 物检测可一步完成，扩增效率高，能在60min内扩增109-1010倍，该技术具有高 特异性、高效性、快速、简便、易检测、不需要特殊仪器等特点，LAMP反应 中可形成明显的白色焦磷酸镁沉淀，可通过对浊度的观察或加入荧光染料，直接 通过颜色变化来判定反应结果。该技术具有高特异性、高效性、快速、简便、易 检测等特点，已广泛应用于细菌、细菌、寄生虫、转基因作物领域的检测，并取 得了较理想的效果。但是迄今为止，市场上还未见用于检测维氏气单胞菌的 LAMP检测引物及试剂盒问世。
发明内容
本发明的目的在于提供一种维氏气单胞菌的LAMP检测引物组，该引物组 特异性强，灵敏度高。
本发明的目的还在于提供一种维氏气单胞菌的LAMP检测试剂盒，该试剂 盒灵敏度高，快速，简便，成本低。
本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种维氏气单胞菌的 LAMP检测引物组，包括一对外引物AV-F3和AV-B3，一对内引物AV-FIP和 AV-BIP，以及一对环引物AV-LF和AV-LB，其中AV-F3的核苷酸序列如SEQID NO.1中所示，AV-B3的核苷酸序列如SEQIDNO.2中所示，AV-FIP的核苷酸序 列如SEQIDNO.3中所示，AV-BIP的核苷酸序列如SEQIDNO.4中所示，AV-LF 的核苷酸序列如SEQIDNO.5中所示，AV-LB的核苷酸序列如SEQIDNO.6中 所示。
各引物具体的核苷酸序列分别如下所示：
AV-F3：GGGTTGTGGAGCAACAAA（SEQIDNO:1）；
AV-B3：AGATCGTCCTCGTCATCTT（SEQIDNO:2）；
AV-FIP：GCTGTCGAAGGCATCACGACCGATCAAAGAGAAACCGAT （SEQIDNO:3）；
AV-BIP：GATGGCATCGGCCAGGTACGAGTTCCGGCTCTTCACT（SEQID NO:4）；
AV-LF：CGACTTGGAGTCCATCCG（SEQIDNO:5）；
AV-LB：GTGTGGTCAGTGGTCGTC（SEQIDNO:6）。
本发明根据维氏气单胞菌（AV）的细胞分裂蛋白基因（zipA基因，Genbank 登录号为JN830283.1）设计了上述六条特异性引物，应用上述六条引物，能特 异性识别靶序列8个位点，保证了核酸扩增高度特异性，即LANMP能从相差仅 一个核苷酸的基因标本中找出相应的靶序列进行扩增，因此其特异性极高。
本发明还提供一种维氏气单胞菌的LAMP检测试剂盒，包括上述三对检测 引物组。
本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的：一种维氏气单胞菌的 LAMP检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的检测引物组、BstDNA聚合酶、LAMP 反应液、封闭液矿物油、阳性对照和阴性对照。
作为本发明的一种较佳的实施方式，本发明所述的检测引物组中内引物、环 引物和外引物的摩尔比为8:4:1。
本发明所述的LAMP反应液优选含10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲 液和150mMMgSO4水溶液，作为本发明一种较佳的实施方案，其中10mMdNTP、 10×ThermoPol反应缓冲液和150mMMgSO4水溶液的体积比为8:5:2。
本发明所述的阳性对照优选为含有维氏气单胞菌zipA序列（Genbank登录 号为JN830283.1）的重组质粒，所述的阴性对照为无菌去离子水。
作为本发明的一种改进：本发明所述试剂盒还包括显色剂SYBRGreenⅠ。
利用上述维氏气单胞菌的LAMP检测试剂盒检测维氏气单胞菌的方法，通 常含以下步骤：
（1）提取待检样品DNA，用DNA提取试剂盒提取待检样品细菌的DNA， 获得待检样品的DNA提取液；
（2）恒温基因扩增LAMP反应：选取LAMP检测引物组、BstDNA聚合酶、 LAMP反应液和封闭液矿物油，置于反应容器中，并设置阳性对照和阴性对照， 调节浊度仪反应温度为63～65℃，反应时间65min，反应结束后80℃保持5min；
（3）结果判断：通过观察反应容器内白色沉淀的变化来判断扩增结果，如 有沉淀，则表示待检样品中存在维氏气单胞菌，如无沉淀，则表示待检样品中不 存在维氏气单胞菌。
在该检测维氏气单胞菌的方法中：
本发明步骤（2）中所述LAMP检测引物组中内引物、环引物和外引物的摩 尔比优选为8:4:1。
本发明步骤（2）中所述LAMP反应液含10mMdNTP、10×ThermoPol反应 缓冲液和150mMMgSO4水溶液，其中10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲 液和150mMMgSO4水溶液的体积比优选为8:5:2。
作为该检测方法的一种优选的实施方案，其中步骤（2）的恒温基因扩增 LAMP反应中，LAMP反应体系可以为25μL，25μL的LAMP反应体系具体包 括：8UBstDNA聚合酶，AS-FIP1.6μM，AS-BIP1.6μM，AS-LF0.8μM，AS-LB 0.8μM，AS-F30.2μM，AS-B30.2μM，2μL待检样品的DNA提取液，无菌去离 子水补足至25μL，并加入两滴矿物油，振荡离心，以及阳性对照和阴性对照。
本发明利用上述维氏气单胞菌的LAMP检测试剂盒检测维氏气单胞菌的方 法，还可以含以下步骤：
（1）提取待检样品DNA，用DNA提取试剂盒提取待检样品细菌的DNA， 获得待检样品的DNA提取液；
（2）恒温基因扩增LAMP反应：取LAMP检测引物组、BstDNA聚合酶、 LAMP反应液和封闭液矿物油，置于反应容器中，并设置阳性对照和阴性对照， 调节反应温度为63～65℃，反应时间65min，反应结束后80℃保持5min，其中 显色剂SYBRGreenⅠ在LAMP反应前加入反应容器中或待LAMP反应结束后 加入反应容器中；
（3）结果判断：通过观察反应容器内颜色的变化来判断扩增结果，如显色 橙色，则表示待检样品中不存在维氏气单胞菌，如显示绿色，则表示待检样品中 存在维氏气单胞菌。
在该检测维氏气单胞菌的方法中：
步骤（2）中所述LAMP检测引物组中内引物、环引物和外引物的摩尔比优 选为8:4:1。
步骤（2）中所述LAMP反应液含10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液 和150mMMgSO4水溶液，其中10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液和 150mMMgSO4水溶液的体积比优选为8:5:2。
作为该检测方法的一种优选的实施方案，其中步骤（2）的恒温基因扩增 LAMP反应中，LAMP反应体系可以为25μL，25μL的LAMP反应体系具体包 括：8UBstDNA聚合酶，AS-FIP1.6μM，AS-BIP1.6μM，AS-LF0.8μM，AS-LB 0.8μM，AS-F30.2μM，AS-B30.2μM，2μL待检样品的DNA提取液，无菌去离 子水补足至25μL，并加入两滴矿物油，振荡离心，显色剂10×SYBRGreenⅠ， 以及阳性对照和阴性对照。
本发明利用上述维氏气单胞菌的LAMP检测试剂盒检测维氏气单胞菌的方 法，还可以含以下步骤：
（1）提取待检样品DNA，用DNA提取试剂盒提取待检样品细菌的DNA， 获得待检样品的DNA提取液；
（2）恒温基因扩增LAMP反应：选取LAMP检测引物组、BstDNA聚合酶、 LAMP反应液、封闭液矿物油和荧光核酸染料SYTO-9，置于反应容器中，并设 置阳性对照和阴性对照，调节实时荧光定量仪反应温度为63～65℃，反应时间 65min，反应结束后80℃保持5min；
（3）结果判断：采用实时荧光定量仪检测，如检测线条为直线，则表示没 有扩增，待检样品中不含有维氏气单胞菌，如线条为“S”型曲线则表示有扩增， 则表示有扩增，待检样品中含有维氏气单胞菌。
实际上，本发明中对于恒温基因扩增LAMP反应的反应产物，结果判断可 采用如下四种方法之一：
①通过肉眼观察反应管内沉淀的产生来判断扩增结果，有沉淀为存在维氏气 单胞菌，无沉淀为不存在维氏气单胞菌，亦可采用实时浊度仪（LA-320C）检测 浊度进行判断。
②在试剂盒中含有显色剂的情况下，于反应管内盖加10×SYBR GreenⅠ1μL，小心盖上盖子，于温度为63～65℃，反应时间65min，反应结束 后80℃保持5min，在1000转/分钟下离心8秒，观察反应结果，或在反应结束 后将反应管冷却，打开盖加入加10×SYBRGreenⅠ1μL，盖好盖子，在1000/分 钟下离心8秒后观察反应结果。通过观察反应管内颜色的变化来判断扩增结果， 橙色不存在维氏气单胞菌，绿色存在维氏气单胞菌。
③电泳检测：取5μLLAMP产物与1μL6×Buffer混合，加入2%的琼脂凝胶 进行电泳，凝胶置于EB中染色后在凝胶成像系统下观察，观察梯形条带，以判 断是否有扩增。
④实时荧光定量仪检测：实时荧光定量仪（AppliedBiosystems7500）自动 扫描反应管内产物的荧光，利用荧光积累实时检测整个反应进程，随着产物的增 加，荧光也会相应增加，把检测信号以线条形式反映到电脑显示屏上。如果线条 为直线则表示没有扩增，表明待测DNA样品中没有含有维氏气单胞菌（AV）的 zipA基因，判断为阴性。如果线条呈上升型曲线则表示有扩增，并且可以实时 监控扩增反应的初始时间和产物量，表明待测DNA样品中含有维氏气单胞菌 （AV）的zipA基因，判断为阳性。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1）快速高效：整个扩增只用60～90min即可完成，扩增产量可达109～1010个拷贝；
2）操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链 DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部恒温仪就能反应和检测；
3）高特异性：本发明根据维氏气单胞菌（AV）的细胞分裂蛋白基因（zipA 基因，Genbank登录号为JN830283.1）设计了六条特异性引物，应用上述六条 引物，能特异性识别靶序列8个位点，保证了核酸扩增高度特异性，即LANMP 能从相差仅一个核苷酸的基因标本中找出相应的靶序列进行扩增，因此其特异性 极高；
4）高灵敏度：本发明的最低检出限达630fg/mL，是普通PCR的1000倍；
5）鉴定简便：本发明可肉眼观察白色沉淀或者通过加入SYBRGreenⅠ观察 颜色变化来判断是否有特异性扩增与否，无需电泳等其它方法判断是否扩增，省 时简便，适合现场检测。
附图说明
图1为实施例3中LAMP检测方法对维氏气单胞菌的特异性试验图，其中 A图为LAMP特异性实时荧光定量仪图，B图为LAMP特异性的核酸染料法，1： 阴性对照，2：维氏气单胞菌，3：嗜水气单胞菌，4：维氏气单胞菌，5：豚鼠 气单胞菌，6：大肠杆菌，7：迟钝爱德华氏菌，8：无乳链球菌，9：海豚链球 菌，10：金黄色葡萄球菌，11：霍乱弧菌，12：蜡样芽胞杆菌，13：志贺氏菌， 14：肺炎克雷伯杆菌，15：绿脓杆菌，16：弗氏柠檬酸杆菌，17：摩氏摩根菌， 18：副溶血杆菌，19：鳗弧菌，20：溶藻弧菌，21：灿烂弧菌，22：哈维弧菌， 其中管2为绿色；
图2为实施例3中LAMP检测方法对维氏气单胞菌的灵敏度试验图，其中 A:LAMP灵敏度实时荧光定量图；B:LAMP灵敏度的凝胶电泳图；C:PCR灵敏 度的凝胶电泳图；
图3为实施例4中LAMP检测方法对维氏气单胞菌的临床样品检测试验图， 其中A图为实时荧光定量仪检测床样品；B图为核酸染料法检测临床样品，1： 阴性对照2：维氏气单胞菌S2201207163：维氏气单胞菌BP201208164：维氏 气单胞菌WP201211215：维氏气单胞菌WC20121121，B图中管2、3、4和5 显色绿色。
具体实施方式
实施例1维氏气单胞菌LAMP检测引物及试剂盒的建立
维氏气单胞菌的LAMP检测试剂盒，包括LAMP引物组、LAMP反应液、 矿物油、BstDNA聚合酶、阳性对照和阴性对照，产品使用说明书，还可以根据 显示结果的不同含有显色剂SYBRGreenⅠ等。
1）LAMP引物设计：根据从美国基因数据库检索获得维氏气单胞菌（AV） zipA基因序列（Genbank登录号为JN830283.1）为靶基因，选取保守序列，利 用在线设计软件PrimerExplorerversion4(http://primerexplorer.jp/e)设计维氏气 单胞菌LAMP的特异性引物，其序列见下表1：
表1引物序列表
2）LAMP反应液：将10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mMMgSO4水溶液三者按体积比8：5：2混合。
3）阳性对照为含有维氏气单胞菌靶序列的重组质粒，其制备方法为：以维 氏气单胞菌标准株的核酸为模板，利用表1中的外引物（SEQIDNO:1和SEQID NO:2）对其进行扩增，所得基因片段长度为221bp，序列如SEQIDNO:7所示， 回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，即为阳性对照。
4）阴性对照为无菌去离子水。
实施例2维氏气单胞菌的LAMP检测方法
利用本发明试剂盒检测维氏气单胞菌，包括如下步骤：
1）细菌DNA提取：细菌样品按照细菌DNA组提取试剂盒(TIANGEN)进行 提取；
2）LAMP反应体系的建立：25μL反应体系含有：12.5μL的LAMP反应液， 8UBstDNA聚合酶，AV-FIP1.6μM，AV-BIP1.6μM，AV-LF0.8μM，AV-LB0.8μM， AV-F30.2μM，AV-B30.2μM，2μL待检DNA提取液，0.1μmol/LSYTO-9（这里 仅针对3）中采用实时荧光定量仪检测的情况时添加），无菌去离子水补足至 25μL，设置阳性对照和阴性对照；加入两滴矿物油，振荡离心。实时荧光定量 仪设置反应温度为63℃，反应时间60～70min，反应结束后80℃保持活5min。
3）结果判断：结果判断可以采用以下四种方法之一：
①浊度仪检测：通过检测反应容器内白色沉淀的产生来判断扩增结果，如有 沉淀，则表示待检样品中存在维氏气单胞菌，如无沉淀，则表示待检样品中不存 在维氏气单胞菌；
②显色剂检测：往LAMP产物中加入10×SYBRGreenI染料1μL，混匀后， 通过肉眼来观察其颜色，或者在步骤（2）的LAMP反应液中加入显色剂10×SYBR GreenI染料1μL，于温度为63～65℃，反应时间65min，反应结束后80℃保持 5min，在1000转/分钟下离心8秒，观察反应结果，如果显示核酸染料原来的橙 色，则表示没有扩增，即表明待测DNA样品中没有含有维氏气单胞菌（AV）的 zipA基因，判断为阴性，如果颜色变绿则表示有扩增，即表明待测DNA样品中 含有维氏气单胞菌（AV）的zipA基因，判断为阳性。
③电泳检测：取5μLLAMP产物与1μL6×Buffer混合，加至2%的琼脂凝胶 进行电泳，凝胶置于EB中染色后在凝胶成像系统下观察，观察是否有梯形条带， 如有，则表示有扩增，即表明待测DNA样品中含有维氏气单胞菌（AV）的zipA 基因，判断为阳性，如没有，则表示没有扩增，即表明待测DNA样品中没有含 有维氏气单胞菌（AV）的zipA基因，判断为阴性。
④实时荧光定量仪检测：实时荧光定量仪（AppliedBiosystems7500）自动 扫描反应管内产物的荧光，利用荧光积累实时检测整个反应进程，随着产物的增 加，荧光也会相应增加，把检测信号以线条形式反映到电脑显示屏上，如果线条 为直线则表示没有扩增，表明待测DNA样品中没有含有维氏气单胞菌（AV）的 zipA基因，判断为阴性；如果线条呈上升型曲线则表示有扩增，并且可以实时 监控扩增反应的初始时间和产物量，表明待测DNA样品中含有维氏气单胞菌 （AV）的zipA基因，判断为阳性。
实施例3本发明维氏气单胞菌的LAMP检测方法的特异性、灵敏性试验
1）特异性实验
为了检测本发明试剂盒的特异性，采用上述实施例2中的LAMP检测方法， 分别以维氏气单胞菌（ATCC35624）、嗜水气单胞菌（ATCC7966）、维氏气单 胞菌（ATCC43979）、豚鼠气单胞菌（ATCC15468）、大肠杆菌、迟钝爱德华氏 菌、无乳链球菌、海豚链球菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、蜡样芽胞杆菌、志 贺氏菌、肺炎克雷伯杆菌、绿脓杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根菌、副溶血杆 菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、灿烂弧菌、哈维弧菌的DNA为模板，并设置以无菌去 离子水为模板的阴性对照，进行特异性试验。
检测结果如图1所示：维氏气单胞菌特异性扩增，嗜水气单胞菌、维氏气单 胞菌、豚鼠气单胞菌、大肠杆菌、迟钝爱德华氏菌、无乳链球菌、海豚链球菌、 金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、蜡样芽胞杆菌、志贺氏菌、肺炎克雷伯杆菌、绿脓 杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根菌、副溶血杆菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、灿烂弧 菌、哈维弧菌以及阴性对照均未出现扩增。上述结果说明，本发明LAMP检测 试剂盒能特异性扩增出维氏气单胞菌的靶序列，而不与其它细菌核酸发生交叉反 应。说明本发明方法及试剂盒特异性好，未出现假阳性。
2）灵敏性实验
提取重组质粒（这个提取过程同实施例1中的3）），重组质粒浓度用超微量 分光光度仪测定。对重组质粒进行10倍倍比稀释，充分振荡混匀稀释成10-1、 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10共10个梯度，采用上述2 中的LAMP检测方法，分别以上述梯度稀释的质粒为模板，并设置无菌去离子 水为模板的阴性对照，进行扩增。
检测结果如图2所示，从左到右的曲线依次为100、10-1、10-2、10-3、10-4、 10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10重组质粒的扩增结果，从中可以看出本发明的 LAMP试剂盒检测的灵敏度可达630fg/mL，是普通PCR方法的103倍，表明本 发明的LAMP试剂盒和检测方法对维氏气单胞菌的诊断具有高度的灵敏性。
实施例4本发明对临床样品检测实验
采用本发明试剂盒进行临床样品检测试验，对分别从锦鲤、鳖、蛙中分离到 的维氏气单胞菌（S2201207163、BP201208164、WP201211215、WC20121121， 这四种菌的分离过程采用本领域的常规方法分离获得)4株临床分离株进行检 测，采用上述实施例2中的LAMP检测方法，同时应用PCR检测方法对4份样 品的检测作为对比。
检测结果如图3所示，实时荧光定量仪在1h之内有效扩增4株临床分离株， 阴性对照没有出现非特异性扩增。加显色剂染色的结果为阴性对照的反应管显示 橙色，表明没有核酸扩增，4株临床分离株的反应管颜色变绿，表明反应管内有 核酸扩增，即表明待测DNA样品中含有维氏气单胞菌（AV）的zipA基因，判 断为阳性。
本发明的LAMP检测试剂盒经过多次不同的重复试验证实，具有特异性好， 灵敏度高以及良好的重复性和稳定性。
以上列举具体实施例对本发明进行说明。需要指出的是，以上实施例只用于 对本发明作进一步说明，不代表本发明的保护范围，其他人根据本发明的提示做 出的非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。