技术领域
本发明涉及一种寄生虫——弓形虫的复合多表位基因及其在制 备诊断和预防弓形虫病的药物中的应用。
背景技术
弓形虫是一种细胞内寄生原虫，可引起人兽共患的弓形虫病。 此虫呈世界性分布，估计全世界成年人中至少有1/3的人感染，但多 为隐性感染。弓形虫作为一种条件致病因素，在许多条件下，特别在 免疫系统受损或抑制的情况下，可引起广泛的临床症状，如弓形虫性 脑炎、弓形虫性视网膜脉络膜炎、弓形虫性腹膜炎等，严重者可导致 死亡。如AIDS病患者中有6～10％患有弓形虫病，AIDS病人所患脑 炎中有70％由弓形虫引起。孕妇也容易感染弓形虫，并可通过胎盘屏 障传给婴儿，导致流产、畸胎、死胎，幸存者也常遗留智能低下等严 重后遗症。因而开展弓形虫病研究，特别是弓形虫疫苗及新型诊断方 法的研制，对许多疾病的防治及优生优育是迫切需要的。
弓形虫生活史中有速殖子、缓殖子、裂殖子、配子体、卵囊等 形态阶段，其中与致病有关的主要是速殖子和缓殖子期。弓形虫条件 性致病的中心环节是速殖子和缓殖子的互相转换。速殖子代谢旺盛、 增殖迅速，引起的急性期感染如受到免疫系统或药物的抑制，可转换 为慢性期；否则，便可导致多器官、多脏器的感染，引发各种临床症 状，以至死亡。缓殖子代谢、增殖缓慢，所引起的慢性期感染主要是 以包囊的形式潜伏在脑、视网膜、肌肉等细胞中，待宿主机体免疫力 下降时，就转换为速殖子，形成急性期感染。
弓形虫在人、羊等中间宿主体内，可以急性期的速殖子和慢性 期的缓殖子两种形式存在，二者的表型截然不同，前者临床症状明显， 后者则呈现正常带虫者状态。二者的基因型也有许多不同，都含有一 些期特异性抗原，如弓形虫主要表面抗原(Major Surface Antigen， SAG1)就只存在于速殖子期；而P22抗原则只存在于缓殖子；也有一 些抗原两期都存在，如棒状体蛋白2(ROP2)。目前对弓形虫疫苗的研 究，多针对速殖子的主要表面抗原，其对急性感染效果尚可，但对慢 性感染则几乎没什么作用。实验表明弓形虫主要表面抗原(速殖子期 特异性抗原)基因免疫小鼠，结果对速殖子的攻击感染具有良好的保 护作用，但对缓殖子期虫体(包囊)却没有明显作用。同样道理，用期 特异性抗原构建的诊断方法，也只能检知某些期的弓形虫感染。
多表位抗原基因(Multi-epitope Gene，MG)是将多个抗原表位的 编码基因拼接在一起，其免疫效果常相当于多个单一抗原的累加。多 表位抗原基因是疫苗研制的一个发展方向。对于寄生虫来说，更是如 此。由于寄生虫多变的抗原构成、复杂的生活史，使得针对单一抗原 的疫苗的保护作用都不太理想，MG疫苗的引入，则可望在一定程度 上解决这个问题。MG已在疟原虫的疫苗研究中已得到了初步应用。 目前，关于弓形虫多表位抗原基因的研究，国内外尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是为了合成具有多个弓形虫期特异抗原表位及破 伤风抗毒素T细胞表位的复合基因片段，其表达产物和复合基因本身 可用作诊断弓形虫病及研制弓形虫疫苗。
弓形虫主要表面抗原(SAG1)是弓形虫速殖子期特异性抗原，弓形 虫棒状体蛋白(Rhoptry)2是一种速殖子和缓殖子都存在的共同抗原， 弓形虫致密颗粒抗原(Granule antigen，GRA)是速殖子和缓殖子共有 的分泌排泄抗原。根据弓形虫SAG1、ROP2、GRA等的氨基酸序列， 确定抗原表位序列及对人和鼠都有很强免疫增强作用的破伤风抗毒 素T表位序列，并根据计算机蛋白质模型构建，插入适宜及适量的软 性氨基酸脯氨酸和/或甘氨酸，以维持各片段相对独立的空间构像， 构成的氨基酸序列如下例：
NNVARCSYGADSTLGPVPGGGPPQQRAAHVPVPDFSQPGGGP CNEKSFKDILPKLTENPWQPGGGPTDPGDVVIEELFNRIPETSVPG GGPFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
其中，该序列含T和(或)B细胞表位的四个弓形虫抗原片段和一 个破伤风毒素片段：
SAG1(138-154)：NNVARCSYGADSTLGPV
SAG1(238-256)：CNEKSFKDILPKLTENPWQ
ROP2(197-216)：TDPGDVVIEELFNRIPETSV
GRA2C15片段：PQQRAAHVPVPDFSQ
TTP30(破伤风毒素片段)：FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
其中，在不同的片段之间插入不同数量的软性氨基酸脯氨酸和/ 或甘氨酸，以维持各片段的独立空间构象，如PGGGP氨基酸序列。
本发明的多肽中的氨基酸序列中可插入其它氨基酸序列，也可以 在该序列的头、尾部加入其它氨基酸序列。
根据哺乳动物偏爱的密码子，确定核苷酸序列，对应于上述氨基 酸多肽序列，核苷酸序列分别是：
SAG1(138-154) aacaacgtggccaggtgctcctacggcgccgaca
gcaccctgggcccagtg
SAG1(238-256) tgcaacgagaagtccttcaaggacatcctgcccaag
ctgaccgagaacccatggcag
ROP2(197-216) accgaccctggtgacgtggtcatcgaagagctgtt
caaccgcatccccgagaccagcgtc
GRA2C15 cctcagcagcgcgccgcccacgtgcctgtgccc
gacttcagccag
TTP30 ttcaacaacttcaccgtgtccttctggctgcgcgtg
cctaaggtgtccgcctcccacctggag
整体的核苷酸序列含有以上的以任意顺序排列的核苷酸序列，其 中在不同的片段之间插入软性氨基酸的编码序列以维持各片段相对 独立的空间构象。也可以是上述所述核苷酸序列的90％以上的同源序 列。
本发明的整体的核苷酸序列可以在复合基因的头尾分别加上密 码子atg起始和终止密码子包括tga或tgg或tag以及适当的限制性内 切酶酶切位点，如ggatcc、ctcgag，进一步确定核苷酸序列。
本发明的弓形虫多表位基因采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法， 使用全自动DNA合成仪进行一次性合成。该合成方法为本技术领域 技术人员所熟知。将该基因克隆到真核表达载体如质粒pCR II -TOPO，进行序列测定。
本发明的弓形虫复合多表位基因的载体可以是以下原核细胞载 体：pET28，pET30，pET32，pRSETA，pRSETB，pRSETC等，也可 以是以下真核细胞载体：pGFP，pEGFP，pGFP-N1，pGFP-C1，pCDNA3， pCR II-TOPO等，也可以是本领域技术人员所熟知的其它载体，载体 中含有本发明所述的基因序列。
本发明的载体的宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌，也可以是 真核细胞。
将本发明的复合基因克隆入真核表达载体(如pCDNA3)(包括 90％以上的同源基因)，作为基因疫苗，对小鼠起到了很好的保护效果， 可用来作为基因疫苗在动物的弓形虫病预防上加以推广。
将本发明的复合基因克隆入原核表达载体(如pRSETB)(包括 90％以上的同源基因)，导入大肠杆菌表达系统，获取了具有抗原活性 的目的蛋白。该蛋白用于诊断试剂盒的包被抗原，能够特异性地检测 出弓形虫感染阳性血清。
本发明因含有编码弓形虫多个虫期、多个抗原的表位以及对人 和鼠都有很强免疫增强作用的破伤风毒素的T细胞表位，因而其本身 及其表达产物都可用来制备诊断和预防保护弓形虫的急慢性感染的 药物，而以往的单一抗原是达不到这样效果的。
具体实施方式
下面的具体实施例将更全面地描述本发明，这些实施例是说明 性的而非限制性的。
实施例一含抗原表位多肽的确定
本复合基因所编码的五个多肽片段的确定是基于：(1)这些片段 分别属于弓形虫不同的期特异性抗原；(2)这些片段已经实验证明或经 计算机软件分析，具有B和/或T细胞表位。本复合基因分别编码弓 形虫速殖子期特异性抗原(SAG1)的两个表位片段 (NNVARCSYGADSTLGPV和CNEKSFKDILPKLTENPWQ)、速殖子 和缓殖子期共有抗原ROP2和GRA2的各一个表位片段 (DPGDVVIEELFNRIPETSV和PQQRAAHVPVPDFSQ)以及破伤风毒 素的一个表位片段(FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE)，后者对人和鼠 都有很强的免疫增强作用。
实施例二 氨基酸序列的确定
根据计算机蛋白质模型构建，确定上述片段的排列顺序并在不 同表位间插入适宜及适量的软性氨基酸PGGGP以维持各表位独立的 空间构像，从而确定氨基酸序列如下：
NNVARCSYGADSTLGPVPGGGPPQQRAAHVPVPDFSQPGGG PCNEKSFKDILPKLTENPWQPGGGPTDPGDVVIEELFNRIPETSVPG GGPFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
实施例三 核苷酸序列的确定
依据以上氨基酸序列，选择哺乳动物偏爱的密码子，并在头尾 分别加上起始和终止密码子以及适当的限制性内切酶酶切位点，从而 确定核苷酸序列如下：
ctcgaggcaatgggaaacaacgtggccaggtgctcctacggcgccgacagcaccctgggcc cagtgcctggtggtggaccacctcagcagcgcgccgcccacgtgcctgtgcccgacttcagccagcct ggtggtggtccatgcaacgagaagtccttcaaggacatcctgcccaagctgaccgagaacccatggca gccaggtggaggtccaaccgaccctggtgacgtggtcatcgaagagctgttcaaccgcatccccgaga ccagcgtcccaggaggaggtcctttcaacaacttcaccgtgtccttctggctgcgcgtgcctaaggtgtc cgcctcccacctggagtgaggatcc
实施例四 复合基因的合成、克隆与测序鉴定
将以上弓形虫多表位复合基因的核苷酸序列，采用β-乙腈亚磷 酸化学合成法，使用全自动DNA合成仪，可交由美国Invitrogen公 司一次性合成，可自行合成，并克隆到质粒pCRII-TOPO，经酶切和 序列测定证实合成的复合基因片段与原始设计序列完全一致。
实施例五 含复合基因之原核重组表达载体的构建及鉴定
将合成并鉴定后的弓形虫多表位基因亚克隆入原核表达载体。 考虑到表达产物的应用，选取了含有能够表达polyHis、从而便于将 表达产物过柱纯化的载体pRSETB。该质粒载体在含有强启动子T7 的宿主菌BL21(DE3)中，能高效表达目的蛋白。简述如下：以碱裂解 法提取转化有原核表达载体质粒pRSETB，以Nco I将其酶切至完全 线性化后，对其进行酚氯仿抽提纯化，补平，再以足量EcoR I酶切， 电洗脱法回收载体片段；碱裂解法提取含有目的基因片段的T载体质 粒pCR II-TOPO-MG，以Sac I将其完全酶切，补平，酚氯仿抽提纯 化，再以不足量的EcoR I对完全线性化的质粒进行酶切，通过电洗 脱法收集目的基因小片段并对其进行纯化。在T4DNA Ligase和T4 DNA Ligase 10x Buffer连接体系中，于16℃连接24小时。
参照分子克隆实验指南(第二版，Sambrook J，et al，金冬雁等译， 55)，以CaCl2法制备中间宿主菌JM109感受态细胞，具体如下：挑 取一JM109单菌落接种于2ml的LB液体培养基中，37℃振摇(200rpm) 培养过夜。次日将此过夜培养物以1∶100的比例加入到8ml的LB 液体培养基中，于37℃继续振摇(200rpm)2-3h，至对数生长期(肉眼 可观察到细菌呈雾状物)。冰浴10min后，4℃离心3000rpm，5min， 弃上清，将管于灭菌纱布上倒置1min，使痕量培养液流尽，以原体 积1/2的冰预冷的0.1MCaCl2(即4ml)重悬沉淀，冰浴15min。4℃离 心3000rpm，5min，弃上清，倒置1min，以原体积1/20的冰预冷的 0.1MCaCl2(即400ul)轻轻重悬细胞沉淀，置于4℃，30min后即可用 于转化。
于上述50ul感受态细胞中加入连接产物2ul(同时作两组对照： 加空载体质粒作阳性对照，不加任何质粒的感受态细胞作阴性对照)， 轻轻旋转以混匀内容物，冰浴30min。置42℃水浴90sec，不要摇动。 快速转移到冰水中放置1-2min，使细胞冷却，加200ul不含任何抗生 素的LB液体培养基，用水浴将培养基加温到37℃后，将管转移到 37℃摇床，温和振摇(100rpm)45min使细菌复苏。各组分别取50ul菌 液涂于含有氨苄青霉素(100ug/ml)的LB固体培养基平板上，于37℃ 孵箱放置30min后，倒置培养过夜(8-12h)。
从含平板上随机挑取转化有连接体系的单菌落，接种于2ml含 有氨苄青霉素(100ug/ml)的LB液体培养基中，37℃、250rpm振摇过 夜。同前，以碱裂解法提取质粒，溶于30ul TE中，取3ul进行1％ 琼脂糖电泳，较空载体质粒pRSETB泳动慢者，疑为重组质粒，遂以 EcoRI对其进行酶切，切出目的基因片段者(约400bp)，即为重组质 粒(pRSETB-MG)。
实施例六 含复合基因之原核重组表达载体之工程菌的诱导表 达
同上以氯化钙法制备工程菌BL21(DE3)的感受态细胞，将鉴定 好的重组质粒pRSETB-MG转化该大肠杆菌细胞。接种转化有重组质 粒的单菌落(pRSETB-MG/BL21)及相应的载体对照质粒 (pRSETB/BL21)于2ml含有氨苄青霉素(100u/ml)的LB液体培养基中， 37℃、250rpm振摇过夜，次曰以1∶100的比例转种于100ml同上的 LB液体培养基中，同样条件培养2h后，加入IPTG至终浓度为1mM， 继续培养3h。8000rpm离心30sec收集菌体，弃上清，-20℃保存。 结果复合基因在原核表达系统中得到了分子量约为14.4KD的表达产 物，只含空载质粒对照菌未显示此带。该表达产物以包涵体形式存在。
实施例七复合基因表达产物的纯化
将40ml细菌培养物重悬于10ml包涵体分离液(50mmol/L Tris.ClpH8.0；1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)；0.2mg/ml溶菌酶，悬液于液 氮和37℃水浴中反复冻融5次，样品以12,000r/min离心15min，小 心倾去上清，保留沉淀，以包涵体洗涤液(1mol/lUrea，0.5％Triton X-100，50mmol/L Tris.Cl pH8.0，1mmol/L EDTA)洗包涵体沉淀2-3 次，最后以12,000r/min离心15min收集包涵体，以1ml 8M尿素将其 于37℃水浴1小时，变性处理后进行SDS-PAGE鉴定，结果表明纯 化效果好。
实施例八 复合基因表达产物的活性鉴定
将诱导表达后的菌体连同对照菌变性处理后进行SDS-PAGE、转 印，转印后的PVDF膜于含0.3％Tween 20的TBS中室温封闭1小时， 与一抗(以TTBS按1∶50稀释后的S13)4℃孵育过夜，用10ml TTBS 于室温洗涤3次，每次10min；与含1％milk、经1∶20000稀释的二 抗(Goat-Anti-mouse IgG-Ap)于37℃轻轻摇动1小时，如上洗三遍， 将膜浸入Developing Buffer(0.1M NaCl，0.05M MgCl2，0.1M Tris.Cl， pH9.5)中平衡15分钟放入现配的BCIP/NBT显色液中，避光显色， 待有特异性条带出现时，加入dH2O终止反应。将膜置于滤纸上，待 干后，扫描结果。结果表明多表位基因所表达的产物能被抗弓形虫的 单克隆抗体S13所特异识别。
实施例九 弓形虫复合多表位基因的表达产物对弓形虫感染的 检测(ELISA、DIPSTICK)
将纯化的多表位基因表达产物作为包被抗原，以ELISA法对124 份已通过免疫印迹检测的血清进行检测，具体如下：
用重组抗原包被96孔板(1μg/孔)，4℃过夜，然后以封闭液(含 1％无脂奶粉、0.05％Tween 20的PBS)于室温封闭1h后，洗3次(洗 液为含0.05％Tween 20的PBS)。每孔加100μl待检血清(原血清用 含1％无脂奶粉的PBS按1∶100稀释)，室温孵育1h后，洗涤 (20mmol/L Tris.C1，500mmol/L NaCl，0.05％Tween-20，pH7.4)，每 孔加入100μl羊抗人HRP标记的二抗，室温孵育1h，同上洗3次， 每孔加入100μl邻苯二铵显色20min，加入1M NaOH终止显色，于 酶标仪上测定OD(492)值。同免疫印迹检测的结构比较，结果如表1 所示：
表1 124份血清Immunblot和ELISA测试结果
Immunoblot ELISA
Samples Number
Positive Negative Positive Negative
Pregnancy 40 4 36 5 35
CNS Patients 9 2 7 3 6
Organ Transplants 5 2 3 2 3
Serum from Denmark 20 9 11 9 11
Normal Serum 50 4 46 5 45
Total 124 21 103 24 100
免疫印迹结果被视为检测的黄金标准。本实验中，ELISA和免疫 印迹检测的阳性符合率为87.5％(21/24)，不符合率为12.5％(3/24)；阴 性符合率为100％(100/100)，表明基于弓形虫多表位复合基因的 ELISA特异性检测与免疫印迹检测结果趋于一致。
随后以多表位基因表达产物用于胶体金标记Dipstick测试实验， 依据孔健、胡旭初等的技术路线(孔健，蒋先敏，蔡庆，等主编.免疫 诊断新技术及其在临床诊断试剂开发中的应用.卫生部北京生物制 品研究所，2000；胡旭初，李明，王萍，等.一种新型免疫快速检测技 术—dipstick免疫胶体金技术.中华流行病学杂志，1998；19：204-207)
操作步骤，具体如下：
a.直径20～30nm胶体金的制备
取10％氯金酸0.1ml，加100ml双蒸水加热煮沸，一次快速加入 37℃预温的1％柠檬酸三钠2ml，待溶液由蓝逐步变为紫红色，继续 煮沸3～5分钟，冷却后，0.2M碳酸钾调节pH至8.0～8.2，0.45μm滤 膜过滤，分光光度计测OD530在0.8～1.2之间。
b.最适蛋白质标记浓度测定
取9支试管，各加入1.0ml上述制备的胶体金溶液。将鼠抗人IgG 用0.01M PB(pH7.0)分别稀释成500μg/ml、400μg/ml、300μg/ml、 250μg/ml、200μg/ml、150μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、0μg/ml，各取 0.1ml按顺序加入上述胶体金溶液中。5分钟后于每试管中再加入10％ 氯化钠水溶液0.1ml，混匀室温静置。于2小时后观察试管颜色的变 化，未加入蛋白(对照管)及加入蛋白量不足以稳定胶体金的试管呈现 由红变蓝的聚沉现象。而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的试管则 保持红色不变。取含蛋白量最低的红色胶体金试管，其蛋白浓度即为 稳定1ml胶体金的最适浓度，实际用量为其量的110％。
c.取鼠抗人IgG 72μl，用双蒸水稀释至1ml，在磁力搅拌条件下 缓慢加到上述制备的80ml胶体金溶液中，室温搅拌30分钟，加 10％BSA 3.2ml，室温搅拌5分钟，再加10％PEG 1.6ml，室温搅拌5 分钟。取1ml胶体金-抗体结合物按上述方法进行稳定性试验。胶体 金-抗体结合物于4℃ 15000rpm离心60分钟，沉淀溶于8ml保存液 中，用0.45μm滤膜过滤备用。
d.胶体金标记Dipstick试纸条的制作
长为6cm的双面胶带的一面贴于塑料薄片上，沿双面胶带的边将 塑料薄片剪下，滤膜的反面(不均匀面)平贴于双面胶带的另一面上， 长度约3cm，其上贴厚滤纸；剪切成约5mm宽的试剂条。纯化的弓 形虫多表位抗原和羊抗鼠IgG溶于碳酸盐包被缓冲液(pH9.6)，浓度 分别为200μg/ml和3mg/ml，取0.5μl在膜上用加样枪点样，羊抗 鼠IgG线距吸水纸层0.3～0.5cm，为对照线，多表位抗原线在抗体线 下约0.5cm。点样后用1％牛血清白蛋白碳酸盐包被缓冲液20μl/条封 闭，自然晾干。用塑料袋密封置于4℃保存。
e.胶体金标记二抗最佳稀释倍数的确立
对保存的胶体金标记二抗原液用稀释液分别稀释4、6、8、10、 12倍作为使用液，以弓形虫病人混合血清和正常人混合血清为检测 对象，摸索其最佳的稀释倍数。
f.弓形虫多表位抗原分子建立的Dipstick快速诊断法的初步测试
取弓形虫病人混合血清和正常混合血清各10μl用 0.02MPB(pH7.0)稀释至50μl，加入反应盘，将已包被抗原抗体的 Dipstick条垂直放于反应盘上，待血清全部吸入条上时加100μl胶体 金标记鼠抗人IgG使用液，吸干后再加0.02M PB100μl洗涤，即可清 晰看到反应结果。阳性反应为出现上下两个红色斑点，阴性反应只有 上面一个红色的对照斑点。结果能特异地检测出弓形虫阳性感染血 清。
实施例十 复合基因真核表达载体的构建及鉴定
以Apa I切pCDNA3，补平，再以Xho I切，纯化收集大片段； 以EcoR I切PCRII-TOPO-MG，补平，再以Xho I切，纯化收集小 片段。于16℃连接24小时，转化大肠杆菌JM109，挑选克隆提取质 粒，以BamH I切，有小片段者为阳性克隆。将含有阳性质粒的菌株 保种。
实施例十一 弓形虫复合多表位基因对小鼠的免疫保护作用
大量提取复合基因真核表达质粒pCDNA3-MG，具体方法如下： 将过夜培养的含目的质粒的JM109100ml，以5000rpm室温离心10 分钟，彻底去上清；加入2ml Solution I，用枪头或振荡器充分悬浮 细菌；3加入2ml SolutionII，立即上下颠倒5～10次，冰上放置2分 钟；3加入8.6ml SolutionIII，立即上下颠倒5～10次，使之充分中和， 冰上放置2分钟；10,000rpm高速离心10分钟；将UNIQ-200柱放入 50ml收集管，将上述的上清转移到柱中，室温放置5分钟，8000rpm 离心2～5分钟；取下UNIQ-200柱，弃去收集管中的废液，重复上述 步骤，将剩余上清全部转移带到NIQ-200，离心；以5ml Wash Solution 洗UNIQ-200柱两次，离心后，将柱放入干净的50ml离心管中，向 柱中央加500μl Elution Buffer，室温放置2分钟，8000rpm离心2分 钟，收集DNA溶液，保存备用。
同时制备载体质粒pCDNA3，以作为对照。同时设脂质体 (Lipofectin)对照和生理盐水对照。
将DNA与Lipofectin以5∶1的比例混合，以5μg DNA/只的剂 量对小鼠进行股四头肌肌肉注射，每两周尾静脉采血一次，血量不少 于300μl，以免疫印迹法测得免疫组小鼠具有特异性抗体水平，于第 六周对小鼠进行虫体(速殖子)攻击感染实验，结果证明弓形虫多表位 基因疫苗对小鼠的弓形虫感染具有良好的免疫保护效果。
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ctcgaggcaa tgggaaacaa cgtggccagg tgctcctacg gcgccgacag caccctgggc 60
ccagtgcctg gtggtggacc acctcagcag cgcgccgccc acgtgcctgt gcccgacttc 120
agccagcctg gtggtggtcc atgcaacgag aagtccttca aggacatcct gcccaagctg 180
accgagaacc catggcagcc aggtggaggt ccaaccgacc ctggtgacgt ggtcatcgaa 240
gagctgttca accgcatccc cgagaccagc gtcccaggag gaggtccttt caacaacttc 300
accgtgtcct tctggctgcg cgtgcctaag gtgtccgcct cccacctgga gtgaggatcc 360