一种同步检测水稻条纹花叶病毒和水稻瘤矮病毒的双重RT-PCR方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810819713.9 (22)申请日 2018.07.24 (71)申请人 华南农业大学 地址 510642 广东省广州市天河区五山路 483号 (72)发明人 周国辉陈彪张彤许杏萍 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 单香杰 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12R 1/94(2006.01) (54)发明名称 一种同步检测水稻条纹花叶病毒和水稻瘤 矮病毒的双重R。

2、T-PCR方法 (57)摘要 本发明公开了一种同步检测RSMV和RGDV的 双重RT-PCR检测方法。 本发明以RSMV的复制酶基 因 （L） 和RGDV的外壳蛋白基因 （S8） 为靶标基因设 计得到两组引物， 包括引物组RSMV-F/RSMV-R和 引物组RGDV-F/RGDV-R， 引物序列依次如SEQID NO.14所示， 并进一步建立了双重RT-PCR检测 体系， 利用该体系同步检测RSMV和RGDV具有操作 简单、 灵敏度高、 易于推广等优点， 实现了对RSMV 和RGDV的共同传毒媒介昆虫电光叶蝉带毒率的 快速检测和水稻复合感染病株的快速诊断， 在病 害测报和农业生产中具有广泛应用。

3、前景。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 109022615 A 2018.12.18 CN 109022615 A 1.一种同步检测RSMV和RGDV的双重RT-PCR引物组合， 其特征在于， 包括引物组RSMV-F/ RSMV-R和引物组RGDV-F/RGDV-R， 引物序列依次如SEQ ID NO.14所示。 2.权利要求1所述双重RT-PCR引物在同步检测RSMV和RGDV方面的应用。 3.权利要求1所述双重RT-PCR引物在制备同步检测RSMV和RGDV的试剂或试剂盒方面的 应用。 4.一种同步检测RSMV和RGDV的双重RT-PCR方法， 其特征在于， 该方法是以待测样品。

4、RNA 为模板， 利用权利要求1所述双重RT-PCR引物进行双重RT-PCR反应， 根据反应结果判定待测 样品中是否含有RSMV和/或RGDV。 5. 根据权利要求4所述同步检测RSMV和RGDV的双重RT-PCR方法， 其特征在于， 所述双 重RT-PCR反应的反应体系为： 2One Step mix 10 L， One Step Enzyme Mix 0.5 L， 10 mol/L RSMV的上下游引物用量相同， 二者之和为0.7 L1.2 L， 10 mol/L RGDV的上下游引 物用量相同， 二者之和为0.8 L1.3 L， 所有引物的总和为2 L， RNA模板 1 L， ddH2O。

5、补足 20 L。 6. 根据权利要求4所述同步检测RSMV和RGDV的双重RT-PCR方法， 其特征在于， 所述双 重RT-PCR反应的反应条件为： 50反转录30 min， 94预变性2min； 94变性30s， 5056 退火30s， 72延伸60s， 共35个循环； 72延伸10 min， 降温至10结束反应。 7. 根据权利要求4所述同步检测RSMV和RGDV的双重RT-PCR方法， 其特征在于， 所述RNA 模板的浓度1.010-1 ng/ L。 8.一种同步检测RSMV和RGDV的试剂盒， 其特征在于， 含有权利要求1中所述双重RT-PCR 引物。 9.根据权利要求8所述试剂盒， 。

6、其特征在于， 所述试剂盒的使用方法为： 以待测样品RNA 为模板， 利用权利要求1所述双重RT-PCR引物进行双重RT-PCR反应， 根据反应结果判定待测 样品中是否含有RSMV和/或RGDV。 10.权利要求4所述双重RT-PCR方法或权利要求8所述试剂盒在同步检测RSMV和RGDV方 面的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109022615 A 2 一种同步检测水稻条纹花叶病毒和水稻瘤矮病毒的双重RT- PCR方法 技术领域 0001 本发明属于植物病毒检测技术领域。 更具体地， 涉及一种同步检测RSMV和RGDV的 双重RT-PCR方法。 背景技术 0002 水稻是我国重要的粮食。

7、作物之一， 在我国的南方地区广泛种植。 近年来， 随着栽作 制度及气候的变化， 水稻病毒病的危害不断加重。 水稻条纹花叶病毒 （Rice Stripe Mosaic Virus， RSMV） 是弹状病毒科 （Rhabdoviridae） 细胞质弹状病毒属 （Cytorhabdovirus） 的暂定 新种， 该病毒感染水稻时， 病株表现为轻度矮缩， 叶片呈浅黄色条纹， 部分叶尖卷曲， 发病严 重时整个叶片扭转畸形， 分蘖增多， 抽穗不完全并形成半包穗或穗不实。 在自然条件下， RSMV通过电光叶蝉 （Recilia dorsalis） 以持久增殖型方式传播， 不能经电光叶蝉的卵传至 子代叶蝉。 。

8、2015年， 由该病毒感染引起的水稻条纹花叶病首次发现于我国广东省罗定地区， 之后一直处于高发流行的态势， 目前已经蔓延至广东、 广西、 海南等省 （区） ， 对水稻生产造 成严重威胁。 0003 水稻瘤矮病毒 （Rice gall dwarf virus， RGDV） 于1979年首次发现于泰国中部地 区， 随后扩散至我国及东亚各国， 该病毒感染水稻时， 病株表现为严重矮缩， 叶片短窄、 僵 直， 茎节变短， 叶色深绿， 分蘖减少， 在叶背和叶鞘上长出大小不等的淡黄色圆形瘤状突起， 病株不孕穗， 或形成半包穗或穗而不实。 在自然条件下， RGDV通过电光叶蝉和黑尾叶蝉 （Nephotetti。

9、x cincticeps） 以持久增殖型方式传播， 可经电光叶蝉的卵传至子代叶蝉。 上 世纪80年代， 水稻瘤矮病曾在我国广东省粤西地区大面积发生， 发病面积高达33000 hm2， 造成了严重的产量损失。 至今该病害已经在我国广东、 广西、 福建、 海南和江西等南方省 （区） 水稻种植区持续流行危害。 0004 目前， 国内外尚未有针对这两种病毒的快速检测方法的报道， 但是， 在田间RSMV和 RGDV均可由电光叶蝉传播， 两病害极易呈现出复合感染的特点， 且RSMV和RGDV同步感染水 稻后所引起的早期症状较为相似， 难以通过观察其症状来区分病害， 因此， 亟需一种能够同 步检测RSMV和。

10、RGDV的方法。 发明内容 0005 本发明要解决的技术问题是克服现有RSMV和RGDV检测方法的不足， 提供一种可同 步检测RSMV和RGDV的双重RT-PCR检测方法。 本发明以RSMV具有高度保守性的复制酶基因 （L） 和RGDV具有高度保守性的外壳蛋白基因 （S8） 作为靶标基因设计特异引物， 利用上述引 物建立双重RT-PCR方法以实现对RSMV和RGDV的同步检测。 0006 本发明的目的是提供一种同步检测RSMV和RGDV的双重RT-PCR引物组合。 0007 本发明的又一目的是提供一种用于同步检测RSMV和RGDV的双重RT-PCR检测试剂 盒。 说明书 1/5 页 3 CN 。

11、109022615 A 3 0008 为了实现上述目的， 本发明是通过以下方案予以实现的： 一种同步检测RSMV和RGDV的双重RT-PCR引物组合， 包括引物组RSMV-F/RSMV-R和引物 组RGDV-F/RGDV-R， 引物RSMV-F的序列如SEQ ID NO.1所示， 引物RSMV-R的序列如SEQ ID NO.2所示， 引物RGDV-F的序列如SEQ ID NO.3所示， 引物RGDV-R的序列如SEQ ID NO.4所示。 0009 该双重RT-PCR引物特异性强、 灵敏度高， 在同步检测RSMV和RGDV方面具有很好的 应用前景， 因此， 上述双重RT-PCR引物在同步检测R。

12、SMV和RGDV方面的应用， 以及在制备同步 检测RSMV和RGDV的试剂或试剂盒方面的应用， 也都应在本发明的保护范围之内。 0010 基于上述双重RT-PCR引物， 本发明还构建了一种同步检测RSMV和RGDV的双重RT- PCR方法， 以待测样品RNA为模板， 利用所述引物组RSMV-F/ RSMV-R和引物组RGDV-F/R进行 双重RT-PCR反应， 根据反应结果判定待测样品中是否含有RSMV和/或RGDV。 0011 作为优选实施方案， 所述双重RT-PCR反应的反应体系为： 2One Step mix 10 L， One Step Enzyme Mix 0.5 L， 10 mol。

13、/L RSMV的上下游引物用量相同， 二者之和为0.7 L1.2 L， 10 mol/L RGDV的上下游引物用量相同， 二者之和为0.8 L1.3 L， 所有引物的 总和为2 L， RNA模板 1 L， ddH2O补足20 L。 0012 另外， 优选地， 所述双重RT-PCR反应的反应条件为： 50反转录30 min， 94预变 性2min； 94变性30s， 5056退火30s， 72延伸60s， 共35个循环； 72延伸10 min， 降温 至10结束反应。 0013 优选地， 所述RNA模板的浓度1.010-1 ng/ L。 0014 更优选地， 所述双重RT-PCR反应的反应体系为。

14、： 2One Step mix 10 L， One Step Enzyme Mix 0.5 L， 10 mol/L RSMV的上下游引物用量相同， 二者之和为0.7 L， 10 mol/L RGDV的上下游引物用量相同， 二者之和为1.3 L， RNA模板1 L， ddH2O补足20 L。 0015 更优选地， 所述双重RT-PCR反应的反应条件为： 50反转录30 min， 94预变性 2min； 94变性30s， 56退火30s， 72延伸60s， 共35个循环； 72延伸10 min， 降温至10 结束反应。 0016 另外， 一种含有所述引物组RSMV-F/RSMV-R和引物组RGDV。

15、-F/RGDV-R的同步检测 RSMV和RGDV的试剂盒， 也应在本发明的保护范围之内。 0017 所述试剂盒的使用方法为： 以待测样品RNA为模板， 利用所述双重RT-PCR引物进行 双重RT-PCR反应， 根据反应结果判定待测样品中是否含有RSMV和/或RGDV。 0018 另外， 上述双重RT-PCR方法或上述试剂盒在同步检测RSMV和RGDV方面的应用， 也 应在本发明的保护范围之内。 0019 与现有技术相比， 本发明具有以下有益效果： 本发明通过大量的研究与探索， 得到了同步检测RSMV和RGDV的双重RT-PCR引物， 利用 该引物建立了双重RT-PCR方法， 可成功检测到水稻和。

16、电光叶蝉中的RSMV和RGDV， 具有操作 简单、 灵敏度高、 易于推广等优点， 可实现对RSMV和RGDV的共同媒介昆虫电光叶蝉带毒率的 快速检测和水稻复合感染病株的快速诊断， 在病害测报和农业生产中具有广泛应用前景。 附图说明 0020 图1为双重RT-PCR同步检测RSMV和RGDV， M： DL2000 DNA Maker； 1： 仅加入RSMV的 引物； 2： 仅加入RGDV的引物； 3： 同步加入RSMV和RGDV的引物； 4： 健康水稻阴性对照。 说明书 2/5 页 4 CN 109022615 A 4 0021 图2为双重RT-PCR同步检测RSMV和RGDV的引物组合， M：。

17、 DL2000 DNA Maker； 18分 别为： RSMV的上下游引物各0.7 L、 RGDV的上下游引物各0.3 L， RSMV的上下游引物各0.65 L、 RGDV的上下游引物各0.35 L， RSMV的上下游引物各0.6 L、 RGDV的上下游引物各0.4 L， RSMV的上下游引物各0.55 L、 RGDV的上下游引物各0.45 L， RSMV的上下游引物各0.5 L、 RGDV的上下游引物各0.5 L， RSMV的上下游引物各0.45 L、 RGDV的上下游引物各0.55 L， RSMV的上下游引物各0.4 L、 RGDV的上下游引物各0.6 L， RSMV的上下游引物各0.35。

18、 L、 RGDV 的上下游引物各0.65 L； 9： 健康水稻阴性对照。 0022 图3为双重RT-PCR同步检测RSMV和RGDV的退火温度， M： DL 2000 DNA Maker； 15： 48、 50、 52、 54、 56。 0023 图4为双重RT-PCR同步检测RSMV和RGDV的灵敏度， M： DL2000 DNA Maker； 19： 稀 释100、 10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、 10-6、 10-7、 10-8倍的阳性模板； 10： 健康水稻阴性对照； 11： ddH2O空白对照。 0024 图5为以优化后的双重RT-PCR体系对田间采集的感。

19、病水稻叶组织和叶蝉的RSMV和 RGDV进行检测， M： DL2000 DNA Maker； 15： 叶蝉； 610： 复合感染RSMV和RGDV的水稻； 11： 阳性对照； 12： 健康水稻阴性对照。 具体实施方式 0025 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明， 但实施例并不对本发明 做任何形式的限定。 除非特别说明， 本发明采用的试剂、 方法和设备为本技术领域常规试 剂、 方法和设备。 0026 除非特别说明， 以下实施例所用试剂和材料均为市购。 0027 实施例1 一种同步检测RSMV和RGDV的双重RT-PCR引物组合， 包括引物组RSMV-F/RSMV-R和引物 组RG。

20、DV-F/RGDV-R， 引物的设计方法和序列如下： 根据NCBI中RSMV和RGDV的基因组序列， 选 取RSMV具有高度保守性的复制酶基因 （L） 和RGDV具有高度保守性的外壳蛋白基因 （S8） 作为 靶标基因， 通过Invitrogen软件设计引物。 0028 引物RSMV-F （如SEQ ID NO.1所示） ： 5 -CTCCAACTATCATCCGCTATGC-3 引物RSMV-R （如SEQ ID NO.2所示） ： 5 -CCATCCGAGATAAGGTCACTGT-3 引物RGDV-F （如SEQ ID NO.3所示） ： 5 -CGGAGTATGGGACCAAATGTTC。

21、C-3 引物RGDV-R （如SEQ ID NO.4所示） ： 5 -CCGCCTGGTTAGCTGGCATATAT-3 。 0029 实施例2 一、 水稻叶组织或叶蝉总RNA的抽提 （1） 取感病水稻叶组织100 mg或单头叶蝉于2 mL RNase-free离心管中， 加入800 L的 Trizol裂解液 （南京诺唯赞生物科技有限公司） 后使用样品研磨仪快速研磨2 min， 研磨破 碎后向裂解液中加入200 L氯仿， 盖紧离心管盖， 用手剧烈震荡30s， 形成乳浊液， 4静置5 说明书 3/5 页 5 CN 109022615 A 5 min； （2） 4下12000 rpm离心15 mi。

22、n， 取上清液于新的1.5 mL离心管， 加入等体积预冷的异 丙醇， 上下颠倒混匀， 4静置10 min； （3） 4下 12000 rpm离心10 min， 弃上清； （4） 加入1 mL用DEPC处理过的双蒸水配置的75%乙醇， 充分洗涤管盖和管壁， 并轻弹管 底， 让沉淀悬浮起来， 室温静置5 min， 4下12000 rpm离心3 min， 弃上清； 再次加入1 mL用 DEPC处理过的双蒸水配置的75%乙醇， 充分洗涤管盖和管壁， 并轻弹管底， 让沉淀悬浮起来， 室温静置5 min， 4下12000 rpm离心3 min， 弃上清， 开盖置于通风橱中， 静置通风干燥； （5） 沉淀干。

23、燥后用50 L RNase-free水溶解， -20保存备用或用于继续下游试验。 0030 二、 双重RT-PCR反应条件优化 （1） 引物比例优化 PCR反应体系为： 2One Step mix 10 L， One Step Enzyme Mix 0.5 L， 10 mol/L RSMV的上下游引物用量相同， 二者之和为0.7 L1.2 L， 10 mol/L RGDV的上下游引物用量 相同， 二者之和为0.8 L1.3 L， 所有引物的总和为2 L， RNA模板1 L， 最后补足ddH2O至20 L； PCR反应条件为： 50反转录30 min， 94预变性2 min； 94变性30s， 。

24、55退火30s， 72 延伸60s， 35个循环； 最后72延伸10 min， 降温至10结束反应； PCR产物电泳： 分别取10 L PCR扩增产物与1 L 10loading Buffer相混合， 使用 1.2%琼脂糖凝胶进行电泳； 结果如附图2所示， RSMV的上下游引物各0.7 L、 RGDV的上下游引物各0.3 L， RSMV的上 下游引物各0.65 L、 RGDV的上下游引物各0.35 L时， RSMV和RGDV均未扩增出条带； RSMV的上 下游引物各0.6 L、 RGDV的上下游引物各0.4 L， RSMV的上下游引物各0.55 L、 RGDV的上下游 引物各0.45 L， R。

25、SMV的上下游引物各0.5 L、 RGDV的上下游引物各0.5 L， RSMV的上下游引物 各0.45 L、 RGDV的上下游引物各0.55 L， RSMV的上下游引物各0.4 L、 RGDV的上下游引物各 0.6 L， RSMV的上下游引物各0.35 L、 RGDV的上下游引物各0.65 L时， 可扩增出条带； 再综合 考虑其他因素， 最终选择RSMV的上下游引物各0.35 L、 RGDV的上下游引物各0.65 L， 即RSMV 的上下游引物用量相同， 二者之和为0.7 L， RGDV的上下游引物用量相同， 二者之和为1.3 L， 为双重RT-PCR反应的引物比例。 0031 （2） 退火温。

26、度优化 PCR反应体系为： 2One Step mix 10 L， One Step Enzyme Mix 0.5 L， RSMV的上下 游引物各0.35 L和RGDV的上下游引物各0.65 L， RNA模板1 L， 最后补足ddH2O至20 L； PCR反应条件为： 50反转录30 min， 94预变性2 min； 94变性30s， 48、 50、 52 、 54、 56退火30s， 72延伸60s， 35个循环； 最后72延伸10 min， 降温至10结束反 应； PCR产物电泳： 分别取10 L PCR扩增产物与1 L 10loading Buffer相混合， 使用 1.2%琼脂糖凝胶进。

27、行电泳； 结果如附图3所示， 可知退火温度为52-56时均可扩增出明 亮的条带， 再综合考虑其他因素， 最终选择56为双重RT-PCR反应的退火温度。 0032 实施例 3 双重RT-PCR反应灵敏性检测 以上优化后的双重RT-PCR反应体系为： 2One Step mix 10 L， One Step Enzyme 说明书 4/5 页 6 CN 109022615 A 6 Mix 0.5 L， RSMV的上下游引物各0.35 L和RGDV的上下游引物各0.65 L， RNA模板1 L， 最 后补足ddH2O至20 L； PCR反应条件为： 50反转录30 min， 94预变性2 min； 9。

28、4变性30s， 56退火30s， 72延伸60s， 35个循环； 最后72延伸10 min， 降温至10结束反应； 以感病水稻叶组织总RNA为模板 （100 ng/ L） 梯度稀释100、 10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、 10-6、 10-7、 10-8倍， 共设置100 ng/ L 、 10 ng/ L 、 1 ng/ L、 110-1 ng/ L、 110-2 ng/ L、 1 10-3 ng/ L 、 110-4 ng/ L、 110-5 ng/ L、 110-6 ng/ L 9个浓度梯度， 以健康水稻总 RNA为阴性对照， 以上述优化后的反应体系和反应条件进。

29、行双重RT-PCR反应的灵敏性检测； 结果如附图4所示， 当RNA模板稀释至10-4倍时， 即模板浓度为110-1 ng/ L时仍可扩 增出明亮的条带， 表明本发明建立的双重RT-PCR方法可从浓度至少为110-1 ng/ L的单头 叶蝉或感病水稻叶组织RNA模板中检测出RSMV和RGDV。 0033 实施例4 水稻样品或叶蝉的检测 为验证本发明建立的双重RT-PCR检测体系的有效性， 从广东省罗定市的水稻重病田间 采集感病水稻叶组织和电光叶蝉， 进行样品总RNA抽提， 以上述优化后的双重RT-PCR反应体 系和反应条件对RSMV和RGDV进行同步检测； 结果如附图5所示， 可知田间采集的感病。

30、水稻叶组织和叶蝉均可扩增出两条明亮的条 带， 大小分别为635 bp和1062 bp， 说明田间采集的感病水稻叶组织和电光叶蝉均携带有 RSMV和RGDV。 0034 同时也说明了本发明建立的双重RT-PCR方法可有效地同步检测RSMV和RGDV， 且操 作简单、 灵敏度高、 易于推广， 能够满足水稻田间实际检测工作的需要。 0035 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。 说明书 5/5 页 7 CN 109022615 A 7 图1 图2 图3 说明书附图 1/2 页 8 CN 109022615 A 8 图4 图5 说明书附图 2/2 页 9 CN 109022615 A 9 。