技术领域
本发明涉及可稳定表达作为造血癌标志物的CD19(分化簇19)的Hela-CD19细胞系。
背景技术
Hela细胞系源自1951年2月8日从海瑞塔·拉克斯(Henrietta Lacks)取得的宫颈癌细胞，她在1951年10月4日死于癌症[Ghorashian等，英国血液学杂志2015，169，463-478]。该细胞系被发现非常耐用，并广泛用于科学研究。
CD19是造血癌的标志物。B淋巴细胞抗原CD19，也称为CD19(分化簇19)，是人类由CD19基因编码的蛋白质。它在B细胞表面被发现，在白血病和淋巴瘤中过表达，并且CD19-CAR-T细胞有效靶向它[Kochenderfer等，血液2013，122，4129-4139，Scherer等，实验医学杂志1953，97，695-710]。还有许多其他血癌肿瘤抗原，如CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD20、CD22、CD23、CD24、CD33、CD38、CD47、CD56、CD57、CD123、CD138、BCMA等，它们可以在癌细胞表面上过表达并且可以被靶特异性CAR-T细胞靶向。
发明内容
本发明的第一方面，提供了一种稳定表达白血病肿瘤抗原的转导癌细胞系，所述癌细胞系为宫颈癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞或成胶质细胞瘤细胞。
在另一优选例中，所述癌细胞系是Hela、MCF-7、A1747、PANC-1、A549或U87。
在另一优选例中，所述癌细胞系是Hela。
在另一优选例中，所述白血病肿瘤抗原是CD(分化簇)19、CD20、CD22、CD23或CD24。
在另一优选例中，所述白血病肿瘤抗原是CD19。
在另一优选例中，所述转导癌细胞系是稳定表达CD19的Hela。
在另一优选例中，所述转导癌细胞系以ATCC保藏号PTA-124207保藏于ATCC。
在另一优选例中，所述保藏号为PTA-124207的转导癌细胞系的CD19阳性表达率大于90％，优选地大于95％，大于98％或大于99％。
本发明的第二方面，提供了一种体外检测靶向特异性肿瘤抗原的CAR-T细胞的细胞毒性的方法，所述方法包括步骤：利用本发明第一方面所述的转导癌细胞系进行检测所述CAR-T细胞的细胞毒性。
在另一优选例中，所述方法包括步骤：
(1)提供本发明所述的转导癌细胞系和待检测的靶向特异性肿瘤抗原的CAR-T细胞；和
(2)将所述的转导癌细胞系与所述的CAR-T细胞接触或混合。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：(3)检测所述转导癌细胞系的死亡率。
在另一优选例中，所述特异性肿瘤抗原为CD19。
在另一优选例中，所述靶向特异性肿瘤抗原的CAR-T细胞为特异性靶向CD19靶向的CAR-T细胞。
在另一优选例中，所述方法是非治疗非诊断的。
本发明的第三方面，提供了一种本发明第一方面所述的转导癌细胞系的用途，所述转导癌细胞系用于(a)检测靶向特异性肿瘤抗原的CAR-T细胞的细胞毒性；(b)筛选靶向特异性肿瘤抗原的CAR-T细胞；或(c)构建实体肿瘤或移植瘤模型。
在另一优选例中，所述转导癌细胞系用于研究体内肿瘤微环境和实体瘤信号传导的实体瘤细胞系。
在另一优选例中，所述转导癌细胞系用于研究白血病标志物和肿瘤抗原的靶向。
在另一优选例中，所述检测或筛选为非治疗非诊断的。
在另一优选例中，所述检测或筛选为体外检测。
在另一优选例中，所述转导癌细胞系用于制备一试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒用于(a)检测靶向特异性肿瘤抗原的CAR-T细胞的细胞毒性；或(b)筛选靶向特异性肿瘤抗原的CAR-T细胞。
本发明的第四方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括(a)容器，以及(b)位于容器内如本发明所述的转导癌细胞系。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于(a)检测靶向特异性肿瘤抗原的CAR-T细胞的细胞毒性；或(b)筛选靶向特异性肿瘤抗原的CAR-T细胞。
本发明的第五方面，提供了一种试剂，所述试剂含有本发明第一方面所述的转导癌细胞系，以及载体。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示Hela细胞和Hela-CD19细胞表达CD19的流式细胞结果。
图2A显示CD19-CAR-T细胞和CD19-FLAG-CAR-T细胞有效靶向Hela-CD19系。RTCA试验中效靶比为5：1。Hela-CD19细胞被CD19-CAR-T细胞和CD19-FLAG-CAR-T细胞杀死。
图2B显示CD19-CAR-NK细胞有效靶向Hela-CD19系。NK，自然杀伤细胞。
图3显示通过肿瘤内注射CD19-CAR-T细胞阻断Hela-CD19宫颈癌移植瘤生长。CD19-CAR T细胞和CD19-FLAG CAR-T细胞的肿瘤内注射显著抑制Hela-CD19肿瘤生长。显示了用未转导T细胞治疗的肿瘤和用CD19(第19天)和CD19-FLAG(第33天)CAR-T细胞治疗的肿瘤的生长曲线。*：与未转导T细胞相比，CAR-T细胞p<0.0.5，由假设方差不齐Student’s t检验测定。
图4显示通过静脉内注射CD19-FLAG CAR-T细胞阻断Hela-CD19宫颈癌移植瘤生长。Hela-CD19移植瘤生长曲线，平均每组，*：与未转导T细胞相比，CD19-FLAG CAR-T细胞p<0.0.05。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种稳定表达白血病肿瘤抗原的转导癌细胞系。具体地，本发明涉及一种转导癌细胞系，能稳定表达白血病肿瘤抗原CD19。例如，所述保藏号为PTA-124207的转导癌细胞系，CD19阳性表达率≥98％。本发明所述细胞可特异性靶向各个特异性肿瘤抗原的CAR-T细胞(如CD19-CAR-T细胞)，测试CAR-T细胞的杀伤效果。本发明的转导癌细胞系可用作实体肿瘤或移植瘤模型，用于研究实体瘤微环境中的血液学靶点，也可用于研究白血病标志物和肿瘤抗原的靶向。在此基础上完成本发明。
术语
如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是指包含能够结合抗原的胞外结构域、衍生自不同于衍生胞外结构域的多肽的多肽的跨膜结构域和至少一个胞内结构域的融合蛋白。“嵌合抗原受体(CAR)”有时被称为“嵌合受体”，“T-body”或“嵌合免疫受体(CIR)”。所述“能够结合抗原的胞外结构域”是指可以结合特定抗原的任何寡肽或多肽。所述“胞内结构域”是指已知在细胞中作为传递信号以引起生物过程活化或抑制的结构域起作用的任何寡肽或多肽。
如本文所用，FLAG标签或FLAG八肽或FLAG表位，是可以使用重组DNA技术加入到蛋白质中的多肽蛋白质标签，其具有序列基序DYKDDDDK(SEQ ID NO：1)。它可以融合到蛋白质的C末端或N末端，或插入蛋白质内。
如本文所用，“结构域”是指多肽中的一个区，其独立于其它区而折叠成为特定结构。
如本文所用，“单链可变片段(ScFv)”是指衍生自抗体的单链多肽，所述抗体保留结合抗原的能力。ScFv的实例包括经重组DNA技术形成的抗体多肽并且其中免疫球蛋白重链(H链)和轻链(L链)片段的Fv区经由间隔序列连接。制备ScFv的各种方法是本领域技术人员已知的。
如本文所用，"肿瘤抗原"指具有抗原性的生物分子，其表达导致癌症。
本发明涉及一种稳定表达白血病肿瘤抗原的转导贴壁细胞系；它是表达造血癌标志物的实体瘤细胞系。适用于本发明的贴壁细胞包括对血液标记物是阴性并且耐用的那些；例如，宫颈癌细胞(如Hela)、乳腺癌细胞(如MCF-7)、卵巢癌细胞(如A1747)、胰腺癌细胞(如PANC-1)、肺癌细胞(如A549)，和成胶质细胞瘤细胞(如U87)或其它类型的实体癌(前列腺、结肠、肺)。优选的细胞系是Hela。
可以在本发明的转导贴壁细胞系中表达的血液肿瘤抗原包括CD(分化簇)19、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD20、CD22、CD23、CD24、CD33、CD38、CD47、CD56、CD57、CD123、CD138、BCMA等。
在一个具体实例中，本发明涉及一种稳定表达CD19的转导Hela细胞系(Hela-CD19)。对于表达CD19，Hela-CD19细胞系阳性大于90％，优选地大于95％，大于98％或大于99％。
本发明的转导贴壁细胞系可用于许多临床前期应用。在一个具体实例中，所述转导贴壁细胞系可用于靶向各个特异性肿瘤抗原的CAR-T细胞(如CD19-CAR-T细胞、CD20-CAR-T细胞、CD22-CAR-T细胞、CD23-CAR-T细胞或CD24-CAR-T细胞或CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD33、CD38、CD47、CD56、CD57、CD123、CD138、BCMA等)的实时细胞毒性试验。
Hela-CD19细胞系可用于移植瘤小鼠研究，以测试CD19-CAR-T细胞的效果。
本发明的转导细胞系是能够研究体内肿瘤微环境和实体瘤信号传导的实体瘤细胞系。因为它是贴壁细胞系，所以能够进行不同的试验，例如用细胞的贴壁特性进行定量的RTCA(实时细胞毒性试验)。转导细胞系表达白血病肿瘤标志物，可用于研究白血病标志物和肿瘤抗原的靶向。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
以下实施例进一步说明本发明。这些实施例仅旨在说明本发明，而不应被解释为限制本发明。
实施例
实施例1.含人CD19的慢病毒载体
人CD19的NCI登录号是NM_001770，以起始密码子ATG开始，以终止密码子TGA结束。将所述人CD19插入到慢病毒载体的Xba I和EcoR I位点(Lenti CMV-MCS-EF1a-puro，来自Systems Bioscience)。
实施例2.CD19编码慢病毒的构建和慢病毒制备
合成编码CD19 cDNA的DNA，并亚克隆入第三代慢病毒载体Lenti CMV-MCS-EF1a-puro(Syno Biological，北京，中国)。所有慢病毒构建体在两个方向上测序以验证构建体序列，并用于慢病毒制备。将1000万个生长抑制的HEK293FT细胞(Thermo Fisher)接种到T75烧瓶中并培养过夜，然后利用CalPhos转染试剂盒(Takara，山景城，加利福尼亚)，用pPACKH1慢病毒载体包装混合物(System Biosciences，帕洛阿尔托，加利福尼亚)和10μg各个慢病毒载体转染。第二天用新鲜培养基替换培养基，48小时后收集含慢病毒的培养基。通过在2100g离心30分钟除去培养基中的细胞碎片。通过在112,000g离心100分钟收集病毒质粒，并悬浮于DMEM或AIM V培养基中，等分装并在-80℃冷冻。根据制造商的方案使用Lenti-X qRT-PCR试剂盒(Takara)和7900HT热循环仪(Thermo Fisher)，通过定量RT-PCR测定病毒制剂的滴度。慢病毒滴度>1×108pfu/ml。
实施例3.用慢病毒转导Hela细胞，产生Hela-CD19细胞
在冰上冻融实施例2中的CD19-慢病毒。向每个加入1×106Hela细胞的孔中，加入5×106CD19-慢病毒和2μL/mL的Transplus培养基(Alstem，里士满，加利福尼亚)(最终稀释度为1:500)。将细胞再次培养24小时，然后重复添加慢病毒。
用含有CD19 DNA的慢病毒构建物转导Hela细胞，并向培养基中加入嘌呤霉素以选择稳定的Hela-CD19细胞。向含10％FBS的DMEM培养基中加入1μg/ml嘌呤霉素，每3天更换含1μg/ml嘌呤霉素的新鲜培养基。
然后在连续含嘌呤霉素的新鲜培养基中培养Hela细胞12-14天。分离Hela-CD19细胞的稳定克隆并生长直到汇合。用CD19抗体通过FACS分析验证CD19的表达。
根据布达佩斯条约规定，Hela-CD19细胞株于2017年6月1日以ATCC保藏号PTA-124207存放于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。
实施例4.制备CAR-T细胞(CD19-ScFv-CD28-CD3ζ)
CD19-CD28-CD3ζ的序列记载于[Kochenderfer，等免疫治疗杂志2009,32,689-702]。将CD19scFv、CD28跨膜域和激活结构域和CD3ζ亚克隆入第三代慢病毒载体Lenti CMV-MCS-EF1a-puro(Syno Biological，北京，中国)。所有CAR慢病毒构建体在两个方向上测序以验证CAR序列，并用于慢病毒制备。
慢病毒在293T细胞中制备，通过RT-PCR建立滴度，并根据Berahovich等人Front Biosci(Landmark Ed).22:1644-1654(2017)的实施例2中所述的方案用于T细胞的转导。
与实施例3中的Hela细胞相似地制备CAR-T细胞(CD19ScFv-CD28-CD3ζ)，但不选择稳定的细胞克隆。不进行嘌呤霉素处理以保持更高的细胞数。将CAR-T用于靶向Hela-CD19细胞的细胞毒性试验(实施例5)。
实施例5.细胞毒性试验(实时ACEA)
根据下述制造商的方案使用ACEA仪器进行细胞毒性。
将贴壁靶细胞(HeLa或HeLa-CD19)以每孔1×104个细胞接种到96孔E板(Acea Biosciences，圣地亚哥，加利福尼亚)中，并用基于阻抗的实时细胞分析(RTCA)iCELLigence系统(Acea Biosciences)监测培养过夜。第二天，去除培养基，用含有10％FBS±1×105个效应细胞(CAR-T细胞或未转导的T细胞)的AIM V-AlbuMAX培养基替换，一式三份。利用RTCA系统将E板中的细胞再监测2-3天，并且随时间绘制阻抗。细胞裂解计算为：(没有效应细胞的靶细胞的阻抗-具有效应细胞的靶细胞的阻抗)×100/没有效应细胞的靶细胞的阻抗。
实施例6.CD19表达的流式细胞检测结果
为了测量CAR表达，将50万个细胞悬浮于100μl缓冲液(含有0.5％BSA的PBS)中，并在冰上与1μl人血清(Jackson Immunoresearch，西格罗夫，宾夕法尼亚)一起孵育10分钟。加入抗CD19-PE或其同种型对照PE标记的抗体，将细胞在冰上孵育30分钟。用3ml缓冲液冲洗细胞，然后悬浮在缓冲液中并通过FACSCalibur(BD Biosciences)获得。
Hela细胞为CD19阴性。在实施例3中，Hela细胞用CD19稳定转导，所得到的Hela-CD19细胞表达CD19，通过流式细胞仪用CD19-PE抗体验证(图1)。细胞几乎99％为CD19阳性。
实施例7.CD19-CAR-T和CD19/NK细胞在体外靶向Hela-CD19细胞
在本实施例中，使用Hela-CD19细胞(实施例3)、T细胞和CD19-CD28-CD3ζCAR-T(CD19scFv CAR-T，实施例4)细胞。
图2A显示Hela-CD19靶细胞和CD19-CAR-T效应细胞的实时细胞毒性试验。图2B显示Hela-CD19靶细胞和CD19-CAR效应NK细胞的实时细胞毒性试验。
图2A说明CD19-CAR-T细胞有效靶向Hela-CD19系。所述CD19-CAR-T细胞是CD19-CD28-CD3ζ，第二代CAR-T细胞。因此，Hela-CD19可用于靶向CD19抗原的CD19-CAR-T细胞的细胞毒性试验。
用CD19-NK(自然杀伤)细胞获得相同的结果(图2B)。
实施例8.CD19-CAR-T细胞在体内靶向Hela-CD19细胞
为了检测Hela-CD19细胞可用于血液癌症靶点，我们利用HeLa-CD19细胞系开发了一种新型移植瘤模型。免疫缺陷NSG小鼠每个侧翼皮下注射2×106HeLa-CD19细胞，并监测肿瘤大小36天。肿瘤内注射CD19和CD19-FLAG CAR-T细胞的肿瘤(平均285mm3)显著小于注射未转导性T细胞的对照肿瘤(平均935mm3)。图3显示用未转导T细胞治疗的肿瘤和在第19天用CD19CAR-T细胞和第33天用CD19-FLAG CAR-T细胞治疗的肿瘤的平均生长曲线。结果表明，肿瘤内注射CD19和CD19-FLAG CAR-T细胞显著抑制HeLa-CD19肿瘤生长。*：与未转导的T细胞相比，CAR-T细胞p<0.05，由Student t检验假设方差不齐测定。
为了表征CD19-FLAG CAR-T细胞在HeLa-CD19实体瘤模型中的作用，先行静脉内应用CD19-FLAG CAR-T细胞，进行了第二项研究。在这项研究中，CD19-FLAG CAR-T细胞几乎完全阻断肿瘤生长(参见图4)。
结果表明，稳定过表达白血病抗原的实体癌Hela细胞系可用作实体肿瘤模型，用于研究实体瘤微环境中的血液学靶点，从而可以研究实体肿瘤生物学、血液市场(hematological market)靶向的信号传导和作用。
实施例9.CD20核苷酸序列
实施例9-12显示了CD20，CD22，CD23和CD24的核苷酸序列。
使用与上述相同的方法产生实体瘤细胞系，例如稳定表达这些白血病肿瘤抗原的稳定Hela或其他稳定的癌细胞系。
CD20(跨膜4域亚家族A成员1)，NCBI登录号，NM_021950.3。
实施例10.CD22核苷酸序列
CD22，核苷酸序列，Gen Bank登录号，X52785.1。
实施例11.CD23核苷酸序列
CD23(其他名字：IgE的Fc片段，低亲和力II，CD23受体)，登录号：AC008763。
实施例12.CD24核苷酸序列
CD24，(登录NCBI号：NM_001291737.1
NM_001291738.1,NM_001291739.1,NM_013230.3)
实施例13.其他血液癌症抗原核苷酸和氨基酸序列
CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD33、CD38、CD47、CD56、CD57、CD123、CD138、BCMA等核苷酸序列分别可从NCBI或Uniprot数据库(www.uniprot.org)获得。
使用与上述相同的方法产生实体瘤细胞系，例如稳定表达这些白血病肿瘤抗原的稳定Hela或其他稳定的癌细胞系。
应当理解，前述内容描述了本发明的优选实施方式，并且在不脱离如权利要求中阐述的本发明的范围的情况下，可以对其进行修改。
序列表
<110> 曹卫
<120> 一种表达血液肿瘤抗原的贴壁细胞系
<130> P2017-1503
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
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