技术领域
本发明属于微生物及环保技术领域，特别涉及一种可降解重质原油的石油降解菌及其分离方法与应用。
背景技术
石油是现代社会的最主要能源之一。在石油的勘探、开采、储运和使用过程中的发生的泄漏事故，会造成严重的环境危害。石油进入土壤，会破坏土壤结构和性质，降低土壤活性，破坏土壤生态系统；石油烃的部分挥发性有机物会影响人体健康，有些成分有致癌、致突变、致畸的作用。传统的物理、化学等方法来解决石油污染问题不仅费用昂贵，而且易造成二次污染，其应用受到了一定的限制，而微生物降解技术因其经济高效、操作简单、无二次污染等特点倍受关注。
微生物降解技术是指在适宜环境下通过微生物各种代谢途径将污染物降解的技术。大量研究表明,在石油烃类污染的自然降解中,微生物降解起着重要的作用。向石油污染的水体或土壤中投加环境适应性强、降解效能高的菌种或菌群是提高石油降解效率的重要技术手段。微生物好氧代谢过程中能够降解大部分饱和脂肪烃和芳香烃，脂肪烃在单氧化酶和脱氢酶的作用下生成脂肪酸，而芳香烃则在氧化酶和水解酶的作用下转化成二氢二醇。
已有的石油降解微生物的筛选主要关注汽油和柴油等成品油，对于成分更复杂、降解更困难的原油关注较少。然而，已有研究表明，单一的降解菌对石油烃的底物利用能力有限，在自然界中，没有一种有代谢能力的单一菌种能够降解原油中的所有组分，且原油中含有胶质和沥青质等结构复杂的重质成分，不易被生物所降解。因此，筛选底物利用范围多样的石油降解菌，尤其是可降解重质组分的石油降解菌，为复合菌剂的开发提供新的菌株，是提高石油综合降解效率的关键所在。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种石油降解菌，该菌株可对石油污染物进行降解去除；
本发明的第二个目的是提供一种石油降解菌菌剂；
本发明的第三个目的是提供了石油降解菌的分离方法；
本发明的第四个目的是提供了石油降解菌或石油降解菌菌剂在降解石油中的应用。
本发明的技术方案如下：
一种石油降解菌，在分类学上属于苍白杆菌属(Ochrobactrum sp.)，已于2018年5月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种保藏号为CGMCCNo.15739，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
一种石油降解菌菌剂，包含石油降解菌CGMCCNo.15739。
一种可降解重质原油的石油降解菌的分离方法，包括以下步骤：
步骤1，取石油污染土壤样品，加入超纯水，震荡使土壤充分打散，静置沉淀；
步骤2，取步骤1的上清液加入石油液体培养基中，在摇床培养；
步骤3，按5％接种，重新转接入新鲜的石油液体培养基中，连续转接富集培养；
步骤4，将步骤3得到的富集培养菌液分离纯化，得到所述石油降解菌。
优选地，所述石油液体培养基的组分为：Na2HPO4·3H2O 1.97g·L-1，KH2PO40.22g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5g·L-1，KNO3 1.90g·L-1，CaCl2 0.02g·L-1，FeSO4·7H2O 0.01g·L-1，NaCl 20g·L-1；重质原油5g·L-1。
优选地，步骤4所述分离纯化方法为：
将所述富集培养菌液稀释至10-3或10-4后，取100μL菌液稀释液涂布于新鲜的固体分离培养基中培养48h，选择不同颜色及形态的单菌落，划线培养并重新接种回石油液体培养基，纯化三次，涂布于LB固体培养基中，收集菌体，得到所述石油降解菌株。
优选地，所述固体分离培养基的成分为：Na2HPO4·3H2O 1.97g·L-1，KH2PO40.22g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5g·L-1，KNO3 1.90g·L-1，CaCl2 0.02g·L-1，FeSO4·7H2O 0.01g·L-1，NaCl 20g·L-1；并添加琼脂20g·L-1，重质原油5g·L-1。
优选地，所述重质原油中的胶质和沥青质含量超过50％。
石油降解菌CGMCCNo.15739或包含石油降解菌CGMCCNo.15739的石油降解菌菌剂在生物修复去除环境中的石油污染物中的应用。
石油降解菌CGMCCNo.15739或包含石油降解菌CGMCCNo.15739的石油降解菌菌剂在生物修复石油污染地下水或土壤中的应用。
优选地，所述应用中，石油降解菌CGMCCNo.15739的最适降解条件为：温度25-35℃、pH＝7-8、NaCl质量浓度0-5％。
相对于现有技术，本发明的优点如下，
本发明的石油降解菌CGMCCNo.15739，可以在常规条件下以重质原油为唯一碳源进行生长，并对石油污染物进行降解去除，无须人为添加能源、碳源、热源等，工艺要求低，应用成本低，且不产生二次污染；本发明提供的石油降解菌在7d内对重质原油的降解率即可达到20％以上，降解效率高，可迅速降解环境中的石油污染物；本发明提供的石油降解菌可用于石油污染土壤或水体的生物修复，亦可用于与其他菌株共同制备复合菌剂，以用于高效彻底去除环境中的石油污染物。
附图说明
图1为石油降解菌CGMCCNo.15739的菌落形态照片；
图2为石油降解菌CGMCCNo.15739菌株系统发育树；
图3为石油降解菌CGMCCNo.15739菌株在不同pH条件下的石油降解率示意图；
图4为石油降解菌CGMCCNo.15739菌株在不同温度条件下的石油降解率示意图；
图5为石油降解菌CGMCCNo.15739菌株在不同NaCl质量浓度条件下的石油降解率示意图。
具体实施方式
本发明所采用的培养基的成分：
1)无机盐培养基：Na2HPO4·3H2O 1.97g·L-1，KH2PO4 0.22g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5g·L-1，
KNO3 1.90g·L-1，CaCl2 0.02g·L-1，FeSO4·7H2O 0.01g·L-1，NaCl 20g·L-1；
2)石油液体培养基：在无机盐培养基的基础上添加重质原油5g·L-1；
3)固体分离培养基：在无机盐培养基的基础上添加琼脂20g·L-1，重质原油5g·L-1；
4)LB固体培养基：酵母粉5g·L-1，胰蛋白胨10g·L-1，琼脂18g·L-1。
所用重质原油的组成成分包括饱和烃33.0％、芳香烃12.4％、胶质38.1％以及沥青质15.5％。
实施例1：
石油降解菌的驯化、分离与纯化方法：
1)将5g石油污染土壤样品放入50mL离心管中，加入25mL超纯水，涡旋震荡器上震荡5-10min，使土壤充分打散，静置沉淀。其中，石油污染土壤样品来源于某石油污染场地。
2)取10mL上清液加入100mL石油液体培养基中，在30℃、150r/min摇床培养7天。
3)7天后，按5％接种，重新转接入新鲜的石油液体培养基中，与上述培养条件相同，连续转接富集培养3次。
4)采用稀释涂布平板法进行分离，将培养液稀释至10-3或10-4后，取100μL菌液稀释液涂布于新鲜的固体分离培养基中。
5)培养48h，待平板长出菌落后选择不同颜色及形态的单菌落，分别回接于固体分离培养基和石油液体培养基中，在两种含油培养基中均能生长的即为石油降解微生物。
6)将筛选出来的菌株划线培养并重新接种回石油液体培养基，纯化三次，涂布于LB固体培养基中，收集菌体，加入30％甘油，于-80℃保存。
通过石油降解菌的富集、分离与纯化得到一株石油降解菌，其菌落特征及生理生化特征为：菌落呈圆形，白色，表面光滑，中部凸起，边缘整齐；革兰氏阴性，好氧细菌，菌体杆状(如图1所示)。
实施例2：
菌株的分子生物学鉴定
1)将保存的菌株在LB固体培养基中划线培养，培养后利用DNA试剂盒对其进行全基因组提取，并采用引物27-F和1492-R进行PCR扩增。PCR反应体系为25μL：上下游引物(10μmol/L)各1μL，DNA模板(10ng/μL)1μL，2×Taq Master Mix 12.5μL，超纯水补足至25μL。PCR反应条件为：94℃5min；94℃1min，52℃1min，72℃2min，30个循环；72℃10min。
2)PCR扩增产物委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，所得基因序列通过GenBank进行同源性比对，确定其分类地位。
菌株16S rRNA基因测序结果如SEQ ID NO:1所示，结果表明其基因序列长度约为1348(序列)，序列比对结果表明其与苍白杆菌属Ochrobactrum的多个种的16S rRNA基因序列相似率达到97％，对其进行系统发育树分析(如图2所示)，结果表明该菌株属于苍白杆菌属Ochrobactrum。
SEQ ID NO:1
CGCCTGCCTCCTTGCGGTTAGCACAGCGCCTTCGGGTAAAACCAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGCACTCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGAACTGAGATGGCTTTTGGAGATTAGCTCACACTCGCGTGCTCGCTGCCCACTGTCACCACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGCCCGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCTCGGCTTATCACCGGCAGTCCCCTTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAAGGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTATCCGGTCCAGCCGAACTGAAAGACACATCTCTGTGTCCGCGACCGGTATGTCAAGGGCTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAATGTTTAATGCGTTAGCTGCGCCACCGAAGAGTAAACTCCCCAACGGCTAACATTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGCGTCAGTAATGGTCCAGTGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCGAATATCTACGAATTTCACCTCTACACTCGGAATTCCACTCACCTCTACCATACTCAAGACTTCCAGTATCAAAGGCAGTTCCGGGGTTGAGCCCCGGGATTTCACCCCTGACTTAAAAGTCCGCCTACGTGCGCTTTACGCCCAGTAAATCCGAACAACGCTAGCCCCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGAAGTTAGCCGGGGCTTCTTCTCCGGTTACCGTCATTATCTTCACCGGTGAAAGAGCTTTACAACCCTAGGGCCTTCATCACTCACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTGCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTATGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCTTTACCTCACCAACTAGCTAATCCAACGCGGGCCGATCCTTTGCCGATAAATCTTTCCCCCGAAGGGCACATACGGTATTAGCACAAGTTTCCCTGAGTTATTCCGTAGCAAAAGGTACGTTCCCACGCGTTACTCACCCGTCTGCCGCTCCCCTTGCGGGGCGCTCGACTGC
实施例3：
石油降解率的测定方法
1)向5个容量瓶中分别加入0、0.5、1、2、3、4mL标准油溶液，用石油醚稀释至标线。
将制得的标准液倒入石英比色皿中，以石油醚为参比，使用紫外分光光度计在226nm波长下测定吸光度，以吸光度为纵坐标，原油浓度为横坐标，经空白校正后绘制标准曲线。
2)将保存的菌株接种回100mL石油液体培养基，在30℃、150r/min摇床培养7天(同时设置无菌对照组)，用石油醚萃取培养基中未降解的石油，使用紫外分光光度计在226nm波长下测定其吸光度，并参照标准曲线计算剩余石油浓度，并按以下公式计算石油降解率：
降解率＝(C0-C1)/C0×100％
其中：C0为对照组剩余石油浓度，C1为实验组剩余石油浓度。
该菌株能以石油作为唯一碳源进行生长繁殖，7天内对0.5％的石油液体培养基内的重质原油降解率达到20％以上。
实施例4：
pH对菌株的石油降解能力的影响
配置石油液体培养基，用H2SO4和NaOH将其pH值分别调至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，于120℃灭菌30min，按5％的接种量接种活化后的菌液，置于30℃、150r/min的摇床培养箱中培养7d后，测定石油降解率，结果如图3所示。pH＝7-8时，该菌株在7d内可对石油进行降解，pH＝7.5时，降解率达到20％以上。
实施例5：
培养温度对菌株的石油降解能力的影响
配制石油液体培养基，于120℃灭菌30min，按5％的接种量接种活化后的菌液，置于温度分别为25℃、30℃、35℃、40℃的恒温摇床中，以150r/min转速培养7d后，测定石油降解率，结果如图4所示。结果如图4所示。温度为25-35℃时，该菌株在7d内可对石油进行降解，温度为30℃时，降解率达到20％以上。
实施例6：
盐含量对菌株的石油降解能力的影响
配制液体石油培养基，分别投加质量浓度为0％、2.5％、5.0％、10.0％、15.0％的NaCl，于120℃灭菌30min，按5％的接种量接种活化后的菌液，置于30℃、150r/min的摇床培养箱中培养7d后，测定石油降解率，结果如图5所示。NaCl质量浓度为0-5％时，该菌株在7d内可对石油进行降解，NaCl质量浓度为2.5％时，降解率达到20％以上。
需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例，并没有用来限定本发明的保护范围，在上述基础上做出的等同替换或者替代均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 东南大学
环境保护部南京环境科学研究所
<120> 一种可降解重质原油的石油降解菌及其分离方法与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1348
<212> DNA
<213> 石油降解菌(Ochrobactrum sp.)
<400> 1
cgcctgcctc cttgcggtta gcacagcgcc ttcgggtaaa accaactccc atggtgtgac 60
gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc atgctgatcc gcgattacta 120
gcgattccaa cttcatgcac tcgagttgca gagtgcaatc cgaactgaga tggcttttgg 180
agattagctc acactcgcgt gctcgctgcc cactgtcacc accattgtag cacgtgtgta 240
gcccagcccg taagggccat gaggacttga cgtcatcccc accttcctct cggcttatca 300
ccggcagtcc ccttagagtg cccaactaaa tgctggcaac taagggcgag ggttgcgctc 360
gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacagccatg cagcacctgt 420
atccggtcca gccgaactga aagacacatc tctgtgtccg cgaccggtat gtcaagggct 480
ggtaaggttc tgcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg tgcgggcccc 540
cgtcaattcc tttgagtttt aatcttgcga ccgtactccc caggcggaat gtttaatgcg 600
ttagctgcgc caccgaagag taaactcccc aacggctaac attcatcgtt tacggcgtgg 660
actaccaggg tatctaatcc tgtttgctcc ccacgctttc gcacctcagc gtcagtaatg 720
gtccagtgag ccgccttcgc cactggtgtt cctccgaata tctacgaatt tcacctctac 780
actcggaatt ccactcacct ctaccatact caagacttcc agtatcaaag gcagttccgg 840
ggttgagccc cgggatttca cccctgactt aaaagtccgc ctacgtgcgc tttacgccca 900
gtaaatccga acaacgctag cccccttcgt attaccgcgg ctgctggcac gaagttagcc 960
ggggcttctt ctccggttac cgtcattatc ttcaccggtg aaagagcttt acaaccctag 1020
ggccttcatc actcacgcgg catggctgga tcaggcttgc gcccattgtc caatattccc 1080
cactgctgcc tcccgtagga gtctgggccg tgtctcagtc ccagtgtggc tgatcatcct 1140
ctcagaccag ctatggatcg tcgccttggt gagcctttac ctcaccaact agctaatcca 1200
acgcgggccg atcctttgcc gataaatctt tcccccgaag ggcacatacg gtattagcac 1260
aagtttccct gagttattcc gtagcaaaag gtacgttccc acgcgttact cacccgtctg 1320
ccgctcccct tgcggggcgc tcgactgc 1348