磷脂的制造方法
技术领域
本发明涉及利用磷脂酰基转移反应(磷脂碱交换反应)制造作为 目的的磷脂的方法。
背景技术
磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)等脂质分别具有有用的 生理作用或特异的物性，在药品、食品原料、乳化剂等用途中使用。 例如，一直期望磷脂酰丝氨酸作为以预防或治疗老年性痴呆症和记忆 障碍等为目的的药剂、磷脂酰甘油作为乳化剂、磷脂酰抗坏血酸作为 乳化剂、过氧化脂质抑制剂而加以利用。
作为这些磷脂的制造方法，以往采用化学合成法或者使用磷脂酶D 的磷脂酰基转移反应，近年来，广泛采用可以比较便宜且简便地制造 磷脂的酶法。
对于利用磷脂酰基转移反应(磷脂碱交换反应)生成作为目的的 磷脂的方法，自古以来就已知(Yang，S.F.等人，J.Biol. Chem.，242，p.477，‘67)。例如国生等人(Agric.Biol.Chem.，51， p.2515，’87)论述了下述内容：通过使磷脂酶D和在蛋黄磷脂酰胆碱 (该蛋黄磷脂酰胆碱溶解在异丙基醚中)中添加了L-丝氨酸水溶液 (含氯化钙)的混合物作用的二相系反应，可以得到含磷脂酰丝氨酸 的反应物。一般认为在二相系反应中，含有原料磷脂的油相和含有受 体的水相构成二相，在两者的界面上产生磷脂酰基转移反应。
另外，日本专利第2942302号公开了下述方法，即通过在醋酸乙 酯中溶解含约85％分级大豆卵磷脂而得到的磷脂酰胆碱的磷脂标准 品，使磷脂酶D和进一步添加了含抗坏血酸的水溶液的混合物作用， 得到含磷脂酰抗坏血酸的反应物的均相反应方法。
但是，在二相系反应中，因为需要相对于磷脂添加5倍(容量/重 量)以上的溶剂(有机溶剂+水)，因而需要采用相对于磷脂量具有6 倍以上的容量的反应装置。而且，为了促进反应的进行，添加钙，该 钙和磷脂快速地形成盐。这样生成的钙盐在日本和欧洲归入化学合成 品的范畴，所以难于用到食品中。
另一方面，在均相反应中，由于在反应系统中存在大量的水，因 而继续反应时，由于磷脂酶具有的加水分解活性，生成作为副反应产 物的磷脂酸。因此，目的磷脂的分离精制变得困难是个问题。而且， 在均相反应中，由于限定了受体相对于磷脂的添加量，因而存在作为 目的反应产物(磷脂)的产量达到极限的问题。
另外，藤田等人的专利(特公平7-16426号公报)公开了通过反 胶团反应制造磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油等的方法，该反胶团反应是 在溶解了原料磷脂的有机溶剂(二异丙基醚、异辛烷、环己烷、苯、 氯仿-异辛烷、正己烷、二氯甲烷-异辛烷)中，以封入到反胶团中 的形式使含有具有羟基的受体和磷脂酶D的水相(含氯化钙)反应的 反应。
报导了在反胶团反应中，由于使用的水分量少因而抑制了作为上 述方法的问题的磷脂酸的生成，但是目的磷脂的生成量大约为20％左 右，未必能说是充分的，另外，由于需要超声波处理等烦杂的操作， 因而在操作性、成本方面也产生了问题。另外，由于相对于磷脂需要 添加10倍(容量/重量)以上的有机溶剂，因而相对于磷脂量，需要 采用大容量的反应装置。
另外，在由上述背景技术已知的磷脂酰基转移反应中，都需要在 反应系统中添加有机溶剂。但是，在食品、药品等用途中使用磷脂时， 不容许有机溶剂的残存，必须完全除去。因此，在制造工序中，需要 除去有机溶剂的设备等，在操作性、成本等方面产生不利。特别是， 在以制造食品为目的的情况下，在反应中利用有机溶剂从食品卫生法 方面来看，实质上是不可能的。
因此，希望一种不使用有机溶剂和钙盐制造各种磷脂的方法，本 领域技术人员的一般性常识是，由于作为原料磷脂的磷脂酰胆碱等是 油溶性的，所以如果不使用有机溶剂的话，反应不能够顺利地进行， 生成的磷脂的收率、操作性等理应降低。
发明公开
本发明的目的在于确立一种制造方法，该方法在制造采用磷脂酶D 的磷脂时，不使用有机溶剂和钙，可以简便且高收率地得到作为目的 的磷脂。
即，根据本发明，上述目的由一种磷脂的制造方法达到，该方法 的特征在于，在利用磷脂酰基转移反应制造磷脂的方法中，具备：在 没有有机溶剂存在的条件下，混合原料磷脂、具有羟基的受体、磷脂 酶D和水，再进行均质化处理，从而得到均质化混合物的“均质化工 序”和在15℃～65℃下使得到的均质化混合物反应的“反应工序”。
在本发明中，充分混合上述原料磷脂、具有羟基的受体、磷脂酶D 和水这4种成分，进一步对其进行均质化处理。认为得到的均质化混 合物作为其结构，具有片状感胶液晶结构。所谓片状感胶液晶是指在 磷脂中添加水形成的磷脂双分子膜液晶。在本发明中，推定为该双分 子膜(有时也解释为多分子膜结构)和水层相互连续地排列。例如通 过在正交的尼科耳棱镜下显微镜观察均质化混合物，可以确认该片状 感胶液晶结构。
顺便说一下，观察到后叙的“主要没有相分离的片状感胶液晶结 构”为连续的层状结构物，观察到“相分离的片状感胶液晶结构”为 在水相中浮游的闭环状结构物。
由于在均质化时，在原料磷脂中添加水，因而磷脂的亲水基间的 相互作用变弱，结晶结构破坏，形成片状的液晶，从而产生该片状感 胶液晶结构。于是认为，由于形成片状感胶液晶结构，水分能够在磷 脂的层状结构之间自由地移动，可以有效地进行受体和酶的供给或者 除去游离自磷脂的极性头部，由此可以进行转移反应。
因而，为了提高反应产物的收率，需要在全体均质化混合物中遍 布片状感胶液晶结构，因此不仅需要简单混合各成分，而且需要进行 均质化处理。即，通过均质化成为在全体结构中可以观察到片状感胶 液晶结构的状态(主要具有片状感胶液晶结构的状态)会得到高的反 应产物量，所以优选。
另外，均质化混合物中水分的含量对该片状感胶液晶结构的形成 有影响。水分含量在一定范围内(例如相对于大豆磷脂，10重量％～ 100重量％)时，均质化混合物成为大致上没有相分离的片状(净状， neat)液晶，但水分如果增加，则分离成由液体和液晶构成的二相(相 分离)。在本发明的方法中，如果以没有该相分离的状态或者大致上 没有引起相分离的状态(两者合并称为“主要没有相分离的片状感胶 液晶结构”)进行反应的话，因发挥特别高的转移活性，所以优选。
另一方面，在均质化混合物中的水分含量多且引起相分离的状态 (相分离的片状感胶液晶结构)下，液晶成为不连续的小胞子状态， 在溶剂中漂浮，和没有相分离的情况相比，水分和磷脂的接触效率降 低，为此转移活性也降低了。另外认为，水分含量如果过少，虽可以 维持磷脂的结晶结构，但不能整体形成片状感胶液晶结构，结果丧失 了酶反应的场合，或者流动性降低，基质和酶的接触效率恶化，酶不 能更有效地发挥作用。
另外，均质化处理时如果添加了有机溶剂，则有助于现有方法的 二相系反应样的相分离(不是在片状感胶液晶结构中的相分离，而是 油相和水相的分离)。另外，如上所述，由于有机溶剂的添加产生各 种不利的因素，因而优选均质化处理时也不使用有机溶剂。
作为用于本发明的原料磷脂，可以使用含有磷脂的天然物、来自 天然物的提取物或者该提取物的精制物，或者合成磷脂等。具体地说， 可以举出大豆卵磷脂、菜籽卵磷脂、蛋黄卵磷脂、玉米卵磷脂或者棉 籽卵磷脂以及它们的精制产物，或者磷脂酰胆碱(以下记为“PC”)、 磷脂酰乙醇胺(以下记为“PE”)等或者它们的混合物等。其中，从 确保原料的难易程度和成本方面来看，优选使用大豆卵磷脂、菜籽卵 磷脂、蛋黄卵磷脂或者它们的精制产物。
另外，作为本发明的具有羟基的受体，只要是在磷脂酶D的存在 下接受上述原料磷脂的磷脂酰基的物质即可。例如可以举出丝氨酸、 甘油、L-抗坏血酸、葡萄糖、胆碱、乙醇胺、1-氨基-2-丙醇、1 -邻甲基-苷等。从目的产物的收率等观点出发，优选丝氨酸、胆碱、 L-抗坏血酸、葡萄糖或者甘油等，特别优选使用丝氨酸和甘油。
另外，作为磷脂酶D(以下记为(“PLD”)，只要是具有磷脂酰 基转移活性的物质即可，没有特别的限定，其形态可以为游离或者化 学修饰的PLD，或者制成在离子交换树脂或二氧化硅凝胶等载体上固定 得到的固定化酶等使用。其中使用游离的PLD时，反应产物的收率特 别高，因而优选。
而且，作为PLD，具体地说，以来自甘蓝或胡萝卜等植物的PLD 为主，可以使用来自放线菌、细菌、酵母、霉菌等微生物的PLD或者 来自动物的PLD等，既可以是根据公知方法制备的，也可以是市售品， 如来自甘蓝的PLD(Sigma公司制，P7758)、来自花生的PLD(Sigma 公司制，P0515)、来自色褐链霉菌(Streptmyces chromofuscus) 的PLD等。
在本发明中，首先，混合原料磷脂、具有羟基的受体、PLD和水， 再对该混合物进行均质化处理。在此，所谓均质化处理是指最终对上 述4者的混合物施加物理力，使各成分均匀分散，作为其方法，可以 举出物理搅拌、超声波处理等手段。更具体地说，可以单独或组合采 用振动混合器、自动研钵、匀质混合器、Physcotron、食品加工器或 者超声波处理装置等进行均质化处理，另外，如果处理量少，也可以 使用微刮刀等进行混练。4成分的混合和均质化处理在时间上既可以是 分别进行，也可以是同时进行，例如，在按顺序一个一个地混合4者 的同时，对其每次进行均质化处理，也可以预先混合或溶解2-4个成 分后，最后进行均质化。
在本发明的方法中，假设不进行该均质化处理，生成的目的磷脂 的收率显著降低。认为这是因为，原料磷脂一般在室温下是硬糊状物， 只简单混合其它成分，难以整个形成片状感胶液晶结构，结果，各成 分接触的比例降低，目的产物的收率降低。因此，需要施加物理力直 至各成分可以分散的程度，需要被称为“均质化处理”的处理。
均质化处理时，具有羟基的受体既可以溶解在水中进行使用，也 可以作为粉末进行使用。另外，也可以在少量水中溶解PLD进行使用 或者制成粉末进行使用。此时，如果预先混合除了受体之外的3者(原 料磷脂、PLD和水)的话，则生成作为副产物的磷脂酸(以下记为“PA”)， 因此优选预先混合原料磷脂和受体之后，添加混合残余的成分或者4 者同时进行均质化处理。
另外，如上所述，均质化处理时的水分含量对片状感胶液晶结构 的相分离，进而对于作为反应产物的磷脂的收率有影响，因而优选对 其进行调整以抑制该相分离。作为水分含量，优选的范围因原料磷脂 的种类而异，相对于原料磷脂，使片状感胶液晶结构中的水分含量为 10重量％～100重量％的话，大致可以抑制相分离，特别优选20重量 ％～60重量％。另外，在此所谓的片状感胶液晶结构中的水分含量是 指除去均质化处理时分离的水分之后的均质化混合物中的水分含量， 其测定可以通过公知的Karl Fischer法等进行。另外，也可以通过倾 析或者离心分离(例如150×g，约1分钟)除去分离的水分。
另外，对于受体的添加量，优选的添加量的范围因使用的受体的 种类而不同，因而将其一般化是困难的，从反应产物的收率和操作性 方面来看，相对于大约1摩尔原料磷脂，优选为0.3摩尔-10摩尔， 特别优选4摩尔-8摩尔。即，如果添加大量(超过10摩尔的量)的 受体的话，回收未反应的受体的劳力增加，另一方面，添加量如果少， 则目的产物的收率降低。
更具体地说，作为具有羟基的受体使用丝氨酸时，相对于原料磷 脂，优选为5重量％～150重量％，特别优选50重量％～100重量％， 使用甘油时，优选为10重量％～200重量％，特别优选20重量％～100 重量％。
另外，PLD的添加量没有特别的限定，只要根据随后的反应工序的 反应时间等来确定就可以，一般来说，每1kg磷脂为500～100000个 单位。
另外，均质化处理时的温度条件没有特别的限定，优选把标准定 在15℃～65℃的范围内。小于15℃时，冷却需要多余的能量，均质化 变得不充分。在65℃以上时，磷脂变得不稳定。
而且，均质化处理时，除上述各成分之外，在不破坏片状感胶液 晶结构的范围内，还可以添加食用油脂。和有机溶剂一样，通过添加 食用油脂，也有助于片状感胶液晶结构向二相系移动，但如果少量添 加，反而增加了均质化混合物的流动性，提高了目的磷脂的收率。作 为食用油脂，例如可以举出红花油、大豆油、玉米油、菜籽油、棉籽 油、向日葵油、红花油、芝麻油、橄榄油、亚麻籽油、紫苏油、可可 脂、椰子油等植物油或者乳脂、鱼油、猪脂、牛脂等动物油、中链三 酰甘油(MCT)等，将这些1种或2种以上组合添加混合在原料磷脂中， 可以赋予流动性。其中，如果使用MCT、可可脂、大豆油等，因可以提 高目的产物的收率，因而优选。
食用油脂的添加量因原料磷脂和添加的食用油脂的种类而异，从 收率方面来看，相对于原料磷脂，优选为等量或以下的量，特别优选5 重量％～15重量％。
另外，从同样的宗旨出发，也可以在不破坏片状感胶液晶结构的 范围内添加己烷或者醚等有机溶剂，但如上所述，不优选添加有机溶 剂。
另外，在此指出本发明有利的方面，以往，磷脂酰基转移反应通 过二相系反应、反胶团反应、均相反应中的任意一种进行，但其中在 二相系反应和反胶团反应中，为了维持反应体系，相对于磷脂，需要 添加5倍(容量/重量)以上的溶剂。与此相对，本发明相对于磷脂只 要添加1倍以下的溶剂就可以，所以可以减小制造等量的磷脂时所需 装置的容量。
均相反应由于相对于磷脂添加2倍(容量/重量)以上的溶剂，除 了相对于磷脂需要使用具有3倍(容量/重量)以上容量的反应装置之 外，还为了维持均相，受体的添加量受到限制，因而难于得到高含量 含有目的物的反应产物。例如，制造PS时，在1kg磷脂中可以添加的 丝氨酸量是0.15kg，反应产物磷脂中的PS含量35％是极限值。与此 相对，本发明的方法也可以在1kg磷脂中添加1kg以上的丝氨酸，作 为结果，可以得到在磷脂中含有48％以上的PS的反应产物。即，和均 相反应相比，根据本发明，除了可以减少制造等量的磷脂时所需装置 的容量之外，还具有可以得到目的物的含量高的反应产物的优点。
而且，现有的磷脂酰基转移反应都需要在反应体系中使用醚、甲 苯、正己烷、醋酸乙酯等有机溶剂，而本发明不需要使用有机溶剂， 便于食品等限制有机溶剂使用的物质的制造。另外，根据本发明，即 使不添加现有方法中使用的钙离子，反应也进行。该理由不明确，但 推测为与二相系反应等反应在液体中进行相对，本发明在液晶中进 行，因而和钙的有无无关，原料磷脂采取易于受到转移反应的结构。
在本发明中，在没有有机溶剂存在的条件下，使如上所述得到的 均质化混合物反应，制造作为目的的磷脂。优选反应在15℃～65℃下 进行，特别优选在45℃～55℃下进行。这是因为小于15℃时，不能促 进反应的进行，目的磷脂的收率降低，大于65℃时，可能引起磷脂的 副反应，例如生成的磷脂酰丝氨酸分解或氧化等。
反应时间没有特别的限定，只要对照反应温度、使用成分的种类 和这些成分的量等选择适当的条件就可以，从目的磷脂的收率和作为 副产物的PA的生成量等方面来看，优选1-48小时。
反应可以在静置或者搅拌下等任意状态下进行，例如可以使用台 式万能混合器(KINMIX MAJOR，KM-230)，在搅拌的同时进行。
在根据本发明方法的磷脂的制造中，通过在原料磷脂中混合适量 的水，可以形成没有相分离的片状液晶状态，水分可以自由地在磷脂 的层状结构之间移动。因而，可以有效地进行具有羟基的受体或酶的 供给，或者有效地除去从磷脂游离的极性头部，从而达到高的转移活 性，可以便宜、简便且收率良好地得到作为目的的磷脂。
由本发明得到的磷脂除了作为副产物的PA之外，含有原料磷脂和 受体中的杂质等时，得到的磷脂在大多数情况下是以目的磷脂以外的 其它磷脂为主混入了杂质的混合物。
由此，希望对通过转移反应得到的转移型磷脂进行适当的精制处 理工序，除去杂质后使用，但只要没有给料上的问题和阻碍效果这样 的问题，可以在含有来源于原料或者制造工序中的杂质的状态下使 用。精制的方法没有特别的限定，只要根据常规方法，适当组合溶剂 的分级、色谱法等进行即可。
这样得到的本发明的磷脂也可以以药品、食品、化妆品等形式施 用。例如，如果是以诉求磷脂的生理效果的药品形式进行使用的场合， 可以作为胶囊剂、颗粒剂、片剂、散剂等固态制剂、或者糖浆剂等液 体制剂口服给药。另外，即使不是口服给药制剂，也可以以注射剂、 皮肤外用剂、直肠给药制剂等非口服形式给药。
各制剂在制造时，可以适当使用乳糖、淀粉、结晶纤维素、乳酸 钙、偏硅酸铝酸镁、硅酸酐等赋形剂，白糖、羟丙基纤维素、聚乙烯 吡咯烷酮等粘合剂，羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙等崩解剂，硬脂 酸镁、滑石等润滑剂或其它医药上允许的成分。
另外，期待同样的生理效果而以食品形式使用时，可以在油脂、 片状或粒状糖食、发酵乳、糖果、调味料、撒在饭上的粉状食品等饮 食品中直接添加由本发明的方法得到的磷脂或者添加适当精制处理由 本发明的方法得到的磷脂而成的物质，采用常规方法制造。
以这些药品、食品等形式使用时，可以适当配合由本发明的方法 得到的磷脂。另外，如果是诉求磷脂的生理效果的情况下，只要配合 可以得到该效果且不产生过量摄取等问题的程度的量即可。例如，作 为磷脂，生成磷脂酰丝氨酸时，可以适当配合估计摄取50mg～1000mg/ 日的量。
而且，本发明的磷脂也可以用作乳化剂，此时，优选以0.01～10 ％添加到药品、食品、化妆品等中。
作为由本发明的方法得到的磷脂中，特别是从含有磷脂酰丝氨酸 的磷脂混合物精制磷脂酰丝氨酸的处理方法，在醇中溶解含有磷脂酰 丝氨酸的磷脂混合物后，通过在该溶解液中添加金属盐，从而使磷脂 酰丝氨酸不溶化，分离该不溶部分，可以简便地从含有由本发明得到 的磷脂酰丝氨酸的磷脂混合物浓缩磷脂酰丝氨酸。
作为使用的金属盐，可以使用锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐等 金属盐，或者富含这些盐的天然物，例如食盐、盐卤、盐水、白云石、 食用珍珠层粉等，从浓缩效率来看，优选使用锂盐、钠盐或者钾盐， 特别优选氯化锂、氯化钠或者氯化钾。也可以1种或2种以上组合使 用这些金属盐。
这些金属盐的添加量只要是可以使磷脂酰丝氨酸沉淀的量即可， 没有特别的限定，从磷脂酰丝氨酸的回收率和沉淀中的磷脂酰丝氨酸 含量高的方面来看，优选每1g磷脂为0.15～10毫摩尔，特别优选0.5～ 5毫摩尔。
另外，作为醇类，只要是可以溶解磷脂混合物的醇类，都可以适 当使用，其中，优选甲醇、乙醇、丁醇、丙醇、异丙醇等低级醇类。 另外，也可以利用这些醇的混合物，由于乙醇易于用到食品中，且在 安全方面的问题少，所以特别优选使用乙醇。
在醇类中溶解磷脂混合物时的浓度没有特别的限定，优选该混合 物可以完全溶解以上的量，从磷脂酰丝氨酸浓缩效率和操作性方面来 看，相对于醇类的重量，优选为1-50％，特别优选为2-20％。
从磷脂混合物浓缩磷脂酰丝氨酸例如可以如下进行。首先，将通 过磷脂酰基转移反应法等调制并在成分中含有磷脂酰丝氨酸以外的磷 脂的磷脂混合物溶解在乙醇等醇类中。此时，溶解温度等溶解条件没 有特别的限定，可以按照混合物的成分种类、它们的量等选择合适的 条件进行使用。
在这样得到的溶液中，磷脂酰丝氨酸、PC、PA等磷脂被提取到溶 剂层，根据情况，产生一部分不溶性的成分。因此，采用离心分离、 过滤等方法从溶剂除去不溶性成分(沉淀物、凝集物等)后，添加金 属盐。在不溶性成分中残存少量磷脂酰丝氨酸的情况下，也可以反复 数次进行上述通过醇类的提取处理。
接着，对醇溶液添加金属盐，将被提取到溶剂层的磷脂酰丝氨酸 分级。即，溶剂层中的磷脂酰丝氨酸以外的磷脂的大部分即使添加金 属盐也不会沉淀，但磷脂酰丝氨酸大部分沉淀，从而可以通过对其进 行回收来浓缩磷脂酰丝氨酸。此时，金属盐可以以粉末形式添加，也 可以在水或醇等溶剂中溶解后添加。对此时的各种条件也没有特别的 限定，只要按照混合物的成分种类、它们的量等选择合适的条件即可。 具体地说，只要在10℃～30℃下保持30分钟以上，使PS不溶化即可。
可以通过离心分离、过滤、静置分离等方法回收添加金属盐而不 溶化的磷脂酰丝氨酸。另外，通过公知的精制方法例如柱色谱法等方 法，也可以进一步进行精制。本发明的磷脂酰丝氨酸浓缩物由于其它 磷脂等的含量显著降低，所以这样的精制方法可以比较简便地进行。
附图说明
图1是表示研究MCT最佳添加量的结果的线图，纵轴A是PS生成 率(％)，横轴B是MCT相对于磷脂的添加量(％)。
图2是表示研究MCT最佳添加量的结果的图，纵轴C是MCT相对 于磷脂的添加比例(％)，横轴D是PS生成率(％)。
图3是表示研究均质化混合物中的丝氨酸相对于磷脂的摩尔比的 结果的线图，纵轴E是PS生成率(％)，横轴F是丝氨酸相对于磷脂 的摩尔比。
图4是表示研究均质化混合物中的水相对于磷脂的重量比的结果 的线图，纵轴G是PS生成率(％)，横轴H是水/磷脂(重量％)。
图5是表示研究均质化混合物中的水相对于磷脂的重量比的结果 的线图，纵轴I是PS生成率(％)，横轴J是水/磷脂(重量％)。
图6是表示研究均质化混合物中的水相对于磷脂的重量比的结果 的线图，纵轴K是PS生成率(％)，横轴L是水/磷脂(重量％)。
图7是表示各反应温度下的PS生成率的线图，纵轴M是PS生成 率(％)，横轴N是温度(℃)。
实施发明的最佳方式
下面，列举实施例对本发明进行说明，但本发明不受这些实施例 的限定。
实施例1(基本)
使用自动研钵(ANM-150型)，将97g 6.7M的L-丝氨酸水溶液 (添加或不添加0.18M氯化钙)混练(均质化处理)到100g大豆卵磷 脂和可可脂的混合物(NATHIN 250，Central Soya Company制)中， 在55℃下保温。进一步，混合2.0mL含有800单位的来自链霉菌属放 线菌的磷脂酶D-Y1(PLD-Y1，(株)Yakult总社制)的酶液，用自 动研钵进行混练(均质化处理)，在完全不存在有机溶剂的条件下开 始反应。反应在搅拌下于55℃进行17小时，完成磷脂酰基转移反应。
采用二氧化硅凝胶薄层色谱法分析得到的反应物，在添加0.18M 氯化钙的情况下，全部磷脂中的47.9％(摩尔％)转化为磷脂酰丝氨 酸。另一方面，在没有添加氯化钙的情况下，全部磷脂中的44.5％转 化为磷脂酰丝氨酸，显然，在该反应体系中，即使不添加钙，磷脂酰 基转移反应也可以进行。另外，在正交尼科耳棱镜下显微镜观察反应 开始前的均质化混合物，观察到“主要没有相分离的片状感胶液晶结 构”。
如上所述，本发明提供了不使用有机溶剂进行磷脂酰基转移反应 的方法。即，通过将含有具有羟基的受体和磷脂酶D的水溶液以及磷 脂均质化并使之反应，从而可以有效地制造磷脂酰基转移反应物。
此时，不需要添加任何有机溶剂，但通过在磷脂中添加有机溶剂 以外的脂溶性物质，例如红花油、大豆油、玉米油、菜籽油、棉籽油、 向日葵油、红花油、芝麻油、橄榄油、亚麻仁油、苏子油、可可脂、 椰子油等植物油，或者黄油、鱼油、猪脂、牛脂等动物油，或者以中 链脂肪酸为原始材料合成得到的甘油酯衍生物等即MCT等食用油脂， 可以提高操作性。
实施例2(有无钙的添加)
如实施例1所示，可知即使不添加钙，磷脂酰基转移反应也可以 进行，但再次验证有无钙的添加。使丝氨酸对磷脂的摩尔比为1或者 5，在表1所示的添加钙和不添加钙的条件下混合各成分，用微刮刀进 行混练(均质化处理)，在55℃下进行反应18小时。另外，摩尔比为 1的使用2.5M的丝氨酸水溶液，摩尔比为5的使用4.5M的丝氨酸水 溶液。具体地说，混合NATHIN 250和丝氨酸水溶液(添加钙时溶解在 丝氨酸水溶液中)后，添加PLD-Y1水溶液开始反应。
和实施例1一样测定反应产物的量。如表2所示，在不添加钙的 情况下，PS生成率和添加钙的情况相比，虽然稍少，但得到大致上相 等的数值。另外，分别在正交的尼科耳棱镜下显微镜观察反应开始前 的均质化混合物，都观察到“主要没有相分离的片状感胶液晶结构”。 另外，在表中，PA表示磷脂酸，PE表示磷脂酰乙醇胺，PI表示磷脂酰 肌醇。
【表1】
丝氨酸/磷脂 (摩尔比) 1 5 钙的添加 无 有 无 有 NATHIN 250(g) 10 10 10 10 丝氨酸(g) 0.8 0.8 4.0 4.0 氯化钙(g) - 0.04 - 0.19 水(g) 2.6 2.6 5.7 5.7 PLD-Y1(单位) 82.2 8 2.2 82.2 8 2.2
【表2】
有无钙的添加
丝氨酸/磷脂(摩尔比) 1 5 钙的添加 无 有 无 有 PA(摩尔％) 13.0 11.8 10.9 11.0 PE(摩尔％) 4.7 3.3 3.2 2.7 PS(摩尔％) 34.5 35.5 44.2 47.4 PC(摩尔％) 31.0 32.2 25.0 21.4 其它磷脂(摩尔％) 16.9 17.1 16.7 17.5
由以上可以判断，在本发明中，和有无钙的添加无关，可以得到 良好的收率。由以上可以判明，在本发明方法中，不需要在使用有机 溶剂的磷脂酰基转移反应中大多数情况下使用的向反应体系中添加 钙。
实施例3(以不含有甘油三酯的磷脂为基质时的反应)
在50g NATHIN 250(Central Soya Company制)中添加500mL 特级丙酮，加温到60℃溶解后，冷却到15℃。在生成的沉淀中添加 300mL特级丙酮，加温到60℃溶解后，冷却到15℃，得到完全不含有 甘油三酯只由磷脂组成的沉淀物。将5.8g 4.5M的L-丝氨酸水溶液 (添加或不添加0.18M氯化钙)混练(均质化处理)到6g该沉淀物的 干燥物(称为NATHIN 250丙酮沉淀物)中，在55℃下保温。进一步， 混合0.2mL含49.3单位的磷脂酶D Y-1((株)Yakult总社制)的 酶液，使用微刮刀进行混练(均质化处理)，在开始反应后立刻在55 ℃下保持17小时，完成磷脂酰基转移反应。
【表3】
使用NATHIN 250丙酮沉淀物为基质的PS产生反应(基质组成)
丝氨酸/磷脂比(摩尔比) 5 添加钙 无 有 NATHIN 250丙酮沉淀物(g) 6.0 6.0 丝氨酸(g) 2.4 2.4 氯化钙(g) - 0.1 水(g) 3.4 3.4 PLD-Y1(单位) 49.3 49.3
用二氧化硅凝胶薄层色谱法分析得到的反应物，添加0.18M氯化 钙的情况下，全部磷脂中的41.7％转化为磷脂酰丝氨酸。另一方面， 在没有添加氯化钙的情况下，全部磷脂中的35.1％转化为磷脂酰丝氨 酸。另外，在正交尼科耳棱镜下显微镜观察反应开始前的均质化混合 物，观察到“主要没有相分离的片状感胶液晶结构”。表3表示基质 组成，表4表示使用丙酮沉淀物为基质的PS转移反应的结果。
【表4】
使用NATHIN 250丙酮沉淀物为基质的PS产生反应
(反应精制物磷脂组成)
丝氨酸/磷脂(摩尔比) 5 添加钙 无 有 PA(摩尔％) 9.0 10.2 PE(摩尔％) 2.7 1.9 PS(摩尔％) 35.1 41.7 PC(摩尔％) 35.3 28.8 其它磷脂(摩尔％) 17.9 17.4
实施例4
以重量比表示在NATHIN 250丙酮沉淀物中混练1～9％MCT (Panasate810，甘油脂肪酸酯，日本油脂(株)制)，将得到的混合 物作为原料磷脂，相对于500mg NATHIN 250丙酮沉淀物，进一步混练 200mg丙酮和200μL水(磷脂和水的重量比为0.4)，添加PLD-Y1 水溶液(4.1单位/15μL)，用微刮刀进行混练(均质化处理)，在55 ℃下反应17小时。用二氧化硅凝胶薄层色谱法测定反应结束后的磷脂 酰丝氨酸。
图1是表示研究MCT最佳添加量的结果的线图。如图1所示，通 过添加50mg(相对于磷脂9％)MCT，与没有添加的情况相比，PS生 成率从34.7％增加至40.4％，确认了MCT的添加效果。使MCT的混合 比为10％～40％，同样进行反应。图2是表示研究MCT最佳添加量的 结果的图。如图2所示，在添加了10％～40％MCT的所有情况下，PS 产生率都增加了。从图1和图2可以认为MCT的添加量在9％～40％是 优选的范围。另外，分别在正交尼科耳棱镜下显微镜观察反应开始前 的均质化混合物，均观察到“主要没有相分离的片状感胶液晶结构”。
实施例5(丝氨酸相对于磷脂的摩尔比)
在500mg NATHIN 250中添加2.5M丝氨酸水溶液(含有0.18M氯 化钙)，使丝氨酸对磷脂的摩尔比为0.1～15，在60℃的水浴中一边 加温一边用混合器搅拌混合。将水浴的温度降至55℃后，在反应基质 中添加PLD-Y1水溶液，用微刮刀或者振动混合器混合并进行均质化 处理。在55℃下反应17小时，用二氧化硅凝胶薄层色谱法分析反应物 的磷脂组成。
如图3所示，丝氨酸对磷脂的摩尔比在0.3以上时，反应产物中 的PS含量为20％以上，可知是适合于PS制造的条件。特别是摩尔比 为4以上时，PS含量为45％以上，认为是特别合适的基质组成。但是， 摩尔比在10以上时，丝氨酸量即使增加，PS生成量也不能提高，认为 摩尔比达到10是有效制造磷脂酰丝氨酸方面的上限。另外，在正交尼 科耳棱镜下显微镜观察反应开始前的均质化混合物(摩尔比为0.3～ 10)，都观察到“主要没有相分离的片状感胶液晶结构”。
另外，丝氨酸的摩尔比为6以上时，添加的水分量相对于磷脂为 100重量份以上，在添加的水分中，通过倾析除去分离的水分时，实际 的均质化混合物中的水分量为100重量份以下(用Karlfischer方法 测定)。
实施例6(水相对于磷脂的重量比)
在500mg大豆卵磷脂(NATHIN 250丙酮沉淀物或者PC80：Croklaan 社制)或者蛋黄卵磷脂(PL～100LE：Q.P.(株)制)中添加200mg L -丝氨酸粉末，用加温至约60℃的研钵充分混合后，用图4～6所示的 水分含量混练蒸馏水，在55℃下保温。进一步，混合0.015mL含4.1 单位的PLD-Y1((株)Yakult总社制)的酶液，用微刮刀进行混练 (均质化处理)，开始反应，在静置状态下保持在55℃下17小时，完 成磷脂酰基转移反应。另外，通过Karl fischer法测定均质化混合物 中的水分含量。
用二氧化硅凝胶薄层色谱法分析得到的反应物，以横轴为水/大豆 卵磷脂重量％(对数绘制)，以纵轴为反应产物的PS含量(％)，用 图表示。图4～6是表示该结果的线图。
如图4所示，使用NATHIN 250丙酮沉淀物为原料磷脂的场合，均 质化混合物中的水/磷脂重量％为3％时，PS完全没有产生，但在10 ％～100％的范围内，磷脂的10％以上转化为PS，可知是适合于PS产 生的水/磷脂重量％。另外，水/磷脂重量％在20％～70％的范围内， 磷脂的30％以上转化为PS，可知是最适合于PS产生的水/磷脂重量 比。在正交尼科耳棱镜下显微镜观察各均质化混合物，结果确认，在 作为适合于PS产生的水/磷脂重量％的10％～100％的范围内，观察 到“主要没有相分离的片状感胶液晶结构”。
如图5所示，使用PC80为原料磷脂的场合，均质化混合物中的水 /磷脂重量％为8％时，PS几乎没有产生，但在10％～60％的范围内， 磷脂的10％以上转化为PS，可知是适合于PS产生的水/磷脂重量％。 另外，水/磷脂重量％在20％～40％的范围内，磷脂的20％以上转化 为PS，可知是最适合于PS产生的水/磷脂重量比。在正交尼科耳棱镜 下显微镜观察各均质化混合物，结果确认，在作为适合于PS产生的水 /磷脂重量％的10％～60％的范围内，观察到“主要没有相分离的片状 感胶液晶结构”。
如图6所示，使用蛋黄卵磷脂为原料磷脂的场合，均质化混合物 中的水/磷脂重量％为8％时，PS几乎没有产生，但在15％～40％的 范围内，磷脂的10％以上转化为PS，可知是适合于PS产生的水/磷脂 重量％。另外，水/磷脂重量％在20％～35％的范围内，磷脂的20％ 以上转化为PS，可知是最适合于PS产生的水/磷脂重量比。在正交尼 科耳棱镜下显微镜观察各均质化混合物，结果确认，在作为适合于PS 产生的水/磷脂重量％的15％～40％的范围内，观察到“主要没有相分 离的片状感胶液晶结构”。
实施例7(PS以外)
在60℃的水浴下，在500mg的PC80中混合490mg表5所述的各 受体水溶液，添加50μL13.7单位的PLD(PLD-Y1)水溶液，用微刮 刀进行混练(均质化处理)，接着在55℃下反应18小时，通过二氧化 硅凝胶薄层色谱法分析磷脂酰基转移反应物的生成。
【表5】
用丝氨酸以外的受体进行的转移反应
使用的受体 水溶液浓度 ％(w/w) pH 受体转移的卵磷脂 生成率(％) 甘油 50 5.9 42.7 L-抗坏血酸 41 5.0 9.4 抗坏血酸磷酸酯镁盐 17 6.7 0.0 抗坏血酸磷酸酯钠盐 50 7.0 0.0 肌醇 17 6.5 0.0 葡萄糖 50 5.0 13.3 海藻糖 50 5.3 0.0
表5表示用各受体进行转移反应后的转移反应物的生成率。如表5 所示，作为受体使用甘油、L-抗坏血酸、葡萄糖时，产生了相对于各 个受体的磷脂酰基转移反应物(磷脂酰甘油4 2.7％，磷脂酰抗坏血酸 9.4％，磷脂酰葡萄糖13.3％)。另一方面，使用肌醇、抗坏血酸磷 酸酯、海藻糖时，没有生成磷脂酰基转移反应物。
实施例8(反应温度)
在500mg NATHIN 250丙酮沉淀物(PL)或450mg NATHIN 250丙 酮沉淀物中添加50mg MCT，在调制而成的磷脂基质(PL+TG)中添加 490mg 4.5M丝氨酸水溶液，在60℃下混练，进一步添加15μL4.1单 位的PLD-YI水溶液后，用微刮刀进行混练(均质化处理)，接着在 15℃～65℃之间于每10℃的各种温度下分别反应18小时。通过二氧 化硅凝胶薄层色谱法解析磷脂酰基转移反应物的生成。
图7是表示各反应温度下的PS生成率的线图。如图7所示，将在 NATHIN 250丙酮沉淀物中添加MCT而成的混合物用作基质时，在45 ℃下的PS生成率为43％，即使将温度升高至该温度以上，生成率也没 有变化。
另一方面，将NATHIN 250丙酮沉淀物用作基质时，相对于在45 ℃下的PS生成率为30.1％，65℃下的生成率为38.7％，反应温度越 高，越能得到好的结果。另外，反应温度如果超过65℃，则PS产生量 不仅降低，而且磷脂可能变性·分解，所以认为65℃是上限。
实施例9(甘蓝芽(Brussels Sprout)PLD)
在500mg NATHIN 250中添加490mg 4.5M丝氨酸水溶液(在添加 钙的系统中添加9.3mg氯化钙)，在55℃下混合。将反应液的温度冷 却到45℃后，添加200μL用公知的步骤另外得到的甘蓝芽PLD的酶液 (0.6单位/mL)，在45℃下反应18小时。
结果，不添加钙时反应几乎不进行，与此相对，添加钙时反应进 行，得到PS含量为6.2％的反应产物。
实施例10(磷脂酰丝氨酸的浓缩1)
在200g PC含量为40％的大豆卵磷脂中混练190g丝氨酸水溶液 (70g丝氨酸+120g水)和10mL磷脂酶D(PLD-Y1，(株)Yakult 总社制)的水溶液(24mg/mL)，在55℃下反应5小时，结果得到磷 脂中的PS含量为46.7％的反应产物。
在5.0g反应产物中添加20mL乙醇，在45℃下提取后，进一步用 5mL乙醇提取残渣(沉淀)2次。混合3次的提取液，在其中的5mL中 添加0.20mL 25％的食盐水，加温至45℃后，放置至室温，形成沉淀。 结果，上清液中的PS含量在干燥固形物中为3.3％，与此相对，沉淀 物中为62.1％，可知PS有效地被浓缩在沉淀部分。
实施例11(磷脂酰丝氨酸的浓缩2)
在5mL实施例10调制的提取液的混合物中添加50mg醋酸钠粉 末，加温到45℃后，放置至室温，形成沉淀。结果，上清液中的PS 含量在干燥固形物中为3.5％，与此相对，沉淀物中为61.8％，和使 用食盐水的情况相同，可知PS有效地被浓缩在沉淀部分。
实施例12(磷脂酰丝氨酸的浓缩3)
对实施例10调制的提取液的混合物添加25％食盐水，形成PS的 不溶物，测定沉淀磷脂中的PS含量和在沉淀部分回收的PS量。作为 其结果，食盐添加量和进入沉淀的PS回收率以及磷脂中的PS含量的 关系如表6所示。
如表6所示，无论在哪种条件下，PS都在沉淀级分中浓缩，特别 是在每1g提取液混合物中的磷脂中添加的食盐的量在10毫摩尔以下 的范围，沉淀磷脂中的PS含量为55％以上，PS被有效地浓缩在沉淀 部分。另一方面，食盐添加量在0.05毫摩尔以下时，进入沉淀的PS 的回收率为60％以下，40％以上存在于上清液部分。从以上结果可以 认为，无论哪种添加量都可以将PS浓缩在沉淀中，食盐相对于1g溶 解于醇中的磷脂而言的添加量在0.15～10毫摩尔的范围是特别适于 实用的添加量。
【表6】
食盐添加量和进入沉淀的PS回收率以及磷脂中的PS含量的关系
食盐添加量 (mmol/g磷脂) 进入沉淀级分的 PS回收率(％) 沉淀磷脂中 PS含量(％) 上清液磷脂中 PS含量(％) 没有添加 0.05 0.15 0.25 0.50 1.25 2.5 5 10 25 50 - 53.7 73.8 80.4 96.2 97.4 96.6 97.1 95.7 97.8 97.7 - 64.7 66.7 69.3 63.8 63.5 62.7 59.8 55.0 47.2 46.6 43.2 33.4 28.2 18.0 62 4.3 6.1 6.4 10.5 12.0 13.5