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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710427557.7 (22)申请日 2017.06.08 (71)申请人 浙江省淡水水产研究所 地址 313001 浙江省湖州市杭长桥南路999 号 (72)发明人 潘晓艺沈锦玉蔺凌云袁雪梅 徐洋姚嘉赟尹文林郝贵杰 (74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务 所(普通合伙) 11350 代理人 汤东凤 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种鲤鱼。
2、浮肿病毒可视化快速检测试剂盒 及其检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种鲤鱼浮肿病毒可视化快 速检测试剂盒及其检测方法， 其中， 鲤鱼浮肿病 毒可视化快速检测试剂盒包括病毒DNA提取试剂 和反应试剂， 所述的反应试剂中含有用于检测鲤 鱼浮肿病毒扩增用核酸引物组， 该引物组包含引 物CEV-F3、 引物CEV-B3、 引物CEV-FIP、 引物CEV- BIP、 引物CEV-LpF和引物CEV-LpB； 本发明的快速 诊断试剂盒建立了一套经过优化的等温扩增反 应体系， 不但使得鲤鱼浮肿病毒定性检测更加简 便快速、 特异性高、 灵敏度高， 而且该试剂盒是检 测鲤鱼浮肿病毒的第一个试剂盒， 填补了。
3、鲤鱼浮 肿病毒无检测方法的缺口， 具有很高的科研和经 济价值。 权利要求书2页 说明书6页 序列表2页 附图1页 CN 107058633 A 2017.08.18 CN 107058633 A 1.一种用于检测鲤鱼浮肿病毒扩增用核酸引物组， 其特征在于， 该引物组包含引物 CEV-F3、 引物CEV-B3、 引物CEV-FIP、 引物CEV-BIP、 引物CEV-LpF和引物CEV-LpB； 所述的引物CEV-F3的核苷酸序列如SEQ ID NO： 1所示； 所述的引物CEV-B3的核苷酸序列如SEQ ID NO： 2所示； 所述的引物CEV-FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO： 3所示。
4、； 所述的引物CEV-BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO： 4所示； 所述的引物CEV-LpF的核苷酸序列如SEQ ID NO： 5所示； 所述的引物CEV-LpB的核苷酸序列如SEQ ID NO： 6所示。 2.一种鲤鱼浮肿病毒可视化快速检测试剂盒， 其特征在于， 包括病毒DNA提取试剂和反 应试剂， 所述的反应试剂中含有权利要求1所述的用于检测鲤鱼浮肿病毒扩增用核酸引物 组。 3.根据权利要求2所述的鲤鱼浮肿病毒可视化快速检测试剂盒， 其特征在于， 所述反应 试剂具体包括以下组分： a)预反应液： 20mM pH为8.8的Tris-HC1、 8mM硫酸镁、 15mM氯化钾、 10mM硫。
5、酸按、 0.l2 Tween-20、 1.4mM dNTP、 0.6M甜菜碱、 0.2 M引物CEV-F3、 0.2 M引物CEV-B3、 1.6 M引物CEV- FIP、 1.6 M引物CEV-BIP、 0.8 M引物CEV-LpF和0.8 M引物CEV-LpB； b)反应酶： 每微升含8个活性单位的Bst 3.0DNA聚合酶； c)反应封闭液： 由矿物油或液体石蜡油组成； d)反应显色液： 含有10SYBR Green I的荧光染料。 4.根据权利要求2所述的鲤鱼浮肿病毒可视化快速检测试剂盒， 其特征在于， 所述病毒 DNA提取试剂包含以下组分： 成分为80mM Tris、 50mM ED。
6、TA、 500mM NaCl、 1.5SDS、 0.01 -巯基乙醇的pH 8.0的裂解液A； Tris饱和酚， pH8.0； 乙酸钠水溶液， 浓度3mol/L； 无水乙 醇； DEPC水配置的含75无水乙醇的洗液A； DEPC水。 5.一种利用权利要求2所述的鲤鱼浮肿病毒的可视化快速检测试剂盒进行检测的方 法， 其特征在于， 包括以下步骤： 1)DNA抽提： 取鱼鳃丝或肾脏组织30-80mg于2mL离心管中， 采用权利要求4所述的病毒 DNA提取试剂进行DNA提取； 2)对鲤鱼浮肿病毒基因进行扩增； 3)对步骤2)中得到的扩增产物进行显色检测。 6.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于， 。
7、所述步骤1)中取鱼鳃丝或肾脏组织30- 80mg于2mL离心管中， 采用权利要求4所述的病毒DNA提取试剂进行DNA提取具体为： 取鲤鱼 脾脏或心脏组织30-80mg于2mL离心管中， 于冰上用研磨棒研磨， 加600 L裂解液A后， 继续研 磨充分后加600 LpH值8.0的Tris饱和酚， 强烈振荡， 11000g离心10min， 取上清液， 重复酚抽 提； 取上清液， 加入0.1倍体积的浓度为3mo1/L的乙酸钠， 混匀， 再加两倍体积的冰冷无水乙 醇， 混匀后低温静置10min， 15000g离心5min， 弃上清， 沉淀用75乙醇洗涤2次， 室温干燥5 10min后以30 L DEPC。
8、水重悬， -80保存备用。 7.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于， 步骤2)中对鲤鱼浮肿病毒基因进行扩增具 体为： 2.1)根据待检测样品的数目， 设置所需反应管数N， N样品数+2， 其中l管为阳性对照， 权利要求书 1/2 页 2 CN 107058633 A 2 l管为阴性对照； 2.2)吸取所述的预反应液的体积为N22 L， 加入一洁净的1.5mL离心管中， 然后加入N L反应酶， 混合均匀， 15002000rpm离心10秒， 取上清之混合液； 2.3)向设定的N个反应管中分别加入23 L步骤2.2)得到的混合液， 得到N个PCR反应管， 向上述N个PCR反应管内按顺序依次分别。
9、加入阴性对照、 待检DNA模板和阳性对照各2 L； 2.4)在上述步骤2.3)得到的反应管中再分别加入30 L反应封闭液， 盖紧管盖并做好标 记， 2000rpm离心5秒； 2.5)在65下恒温反应50min。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述阳性对照为含有鲤鱼浮肿病毒基因的 质粒； 所述阴性对照为无核酸去离子水。 9.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于， 步骤3)中对步骤2)中得到的扩增产物进行 显色检测具体为： 取出经步骤2)的反应管， 冷却至室温， 2000rpm离心5秒， 按照阴性对照、 待 检样品和阳性对照的顺序依次分别加入l L反应显色液， 轻轻混匀， 直接用。
10、肉眼观察颜色变 化， 绿色判断为阳性， 浅黄色为阴性， 观察结束后将反应管装入密封袋， 丢弃至特定区域。 权利要求书 2/2 页 3 CN 107058633 A 3 一种鲤鱼浮肿病毒可视化快速检测试剂盒及其检测方法 技术领域 0001 本发明属于靶基因片断的快速检测领域， 具体地说， 涉及一种鲤鱼浮肿病毒可视 化快速检测试剂盒及其检测方法。 背景技术 0002 鲤鱼浮肿病毒(Carp edema virus， CEV)是引起鲤鱼浮肿病和锦鲤昏睡病(Koi sleepy disease， KSD)的病原， 严重危害鲤鱼和锦鲤的健康养殖， 疾病导致的死亡率高达 80-100。 鲤鱼浮肿病是由属于。
11、痘病毒科的鲤鱼浮肿病毒引起的， 该病已在全球迅速蔓延， 于2016年被首次发现传入中国。 该病发生期间， 病鱼在水面下昏迷， 或者躺在池底， 症状主 要表现为眼球内陷、 鳃增生和肛门溃疡性炎症， 在发病后的2周内死亡。 0003 鲤鱼浮肿病毒作为我国新发传染病的病原， 国际上缺乏针对鲤鱼浮肿病毒的高灵 敏检测试剂盒， 已不能满足该病毒引起疾病的检疫和预防工作。 因此该病毒检测试剂盒的 开发和检测技术的研究显得尤为重要。 发明内容 0004 有鉴于此， 本发明针对上述的问题， 提供了一种鲤鱼浮肿病毒可视化快速检测试 剂盒及其检测方法， 本发明的试剂盒特异性强， 敏感性高； 本发明鲤鱼浮肿病毒快速。
12、检测方 法利用所述试剂盒检测， 该方法方便、 灵敏、 准确、 快速。 0005 为了解决上述技术问题， 本发明公开了一种用于检测鲤鱼浮肿病毒扩增用核酸引 物组， 该引物组包含引物CEV-F3、 引物CEV-B3、 引物CEV-FIP、 引物CEV-BIP、 引物CEV-LpF和 引物CEV-LpB； 0006 所述的引物CEV-F3的核苷酸序列如SEQ ID NO： 1所示； 0007 所述的引物CEV-B3的核苷酸序列如SEQ ID NO： 2所示； 0008 所述的引物CEV-FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO： 3所示； 0009 所述的引物CEV-BIP的核苷酸序列如SEQ ID 。
13、NO： 4所示； 0010 所述的引物CEV-LpF的核苷酸序列如SEQ ID NO： 5所示； 0011 所述的引物CEV-LpB的核苷酸序列如SEQ ID NO： 6所示。 0012 本发明还公开了一种鲤鱼浮肿病毒可视化快速检测试剂盒， 包括病毒DNA提取试 剂和反应试剂， 所述的反应试剂中含有上述的用于检测鲤鱼浮肿病毒扩增用核酸引物组。 0013 进一步地， 反应试剂具体包括以下组分： 0014 a)预反应液： 20mM pH为8.8的Tris-HC1、 8mM硫酸镁、 15mM氯化钾、 10mM硫酸按、 0.l2Tween-20、 1.4mM dNTP、 0.6M甜菜碱、 0.2 M引。
14、物CEV-F3、 0.2 M引物CEV-B3、 1.6 M引 物CEV-FIP、 1.6 M引物CEV-BIP、 0.8 M引物CEV-LpF和0.8 M引物CEV-LpB； 0015 b)反应酶： 每微升含8个活性单位的Bst 3.0DNA聚合酶； 0016 c)反应封闭液： 由矿物油或液体石蜡油组成； 0017 d)反应显色液： 含有10SYBR Green I的荧光染料。 说明书 1/6 页 4 CN 107058633 A 4 0018 进一步地， 病毒DNA提取试剂包含以下组分： 成分为80mM Tris、 50mMEDTA、 500mM NaCl、 1.5SDS、 0.01 -巯基。
15、乙醇的pH 8.0的裂解液A； Tris饱和酚， pH8.0； 乙酸钠水溶 液， 浓度3mol/L； 无水乙醇； DEPC水配置的含75无水乙醇的洗液A； DEPC水。 0019 本发明还公开了一种利用上述的鲤鱼浮肿病毒的可视化快速检测试剂盒进行检 测的方法， 包括以下步骤： 0020 1)DNA抽提： 取鱼鳃丝或肾脏组织30-80mg于2mL离心管中， 采用权利要求4所述的 病毒DNA提取试剂进行DNA提取； 0021 2)对鲤鱼浮肿病毒基因进行扩增； 0022 3)对步骤2)中得到的扩增产物进行显色检测。 0023 进一步地， 步骤1)中取鱼鳃丝或肾脏组织30-80mg于2mL离心管中， 。
16、采用上述的病 毒DNA提取试剂进行DNA提取具体为： 取鲤鱼脾脏或心脏组织30-80mg于2mL离心管中， 于冰 上用研磨棒研磨， 加600 L裂解液A后， 继续研磨充分后加600 LpH值8.0的Tris饱和酚， 强烈 振荡， 11000g离心10min， 取上清液， 重复酚抽提； 取上清液， 加入0.1倍体积的浓度为3mo1/L 的乙酸钠， 混匀， 再加两倍体积的冰冷无水乙醇， 混匀后低温静置10min， 15000g离心5min， 弃上清， 沉淀用75乙醇洗涤2次， 室温干燥510min后以30 L DEPC水重悬， -80保存备 用。 0024 进一步地， 步骤2)中对鲤鱼浮肿病毒基因。
17、进行扩增具体为： 0025 2.1)根据待检测样品的数目， 设置所需反应管数N， N样品数+2， 其中l管为阳性 对照， l管为阴性对照； 0026 2.2)吸取所述的预反应液的体积为N22 L， 加入一洁净的1.5mL离心管中， 然后 加入N L反应酶， 混合均匀， 15002000rpm离心10秒， 取上清之混合液； 0027 2.3)向设定的N个反应管中分别加入23 L步骤2.2)得到的混合液， 得到N个PCR反 应管， 向上述N个PCR反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、 待检DNA模板和阳性对照各2 L； 0028 2.4)在上述步骤2.3)得到的反应管中再分别加入30 L反应封闭液。
18、， 盖紧管盖并做 好标记， 2000rpm离心5秒； 0029 2.5)在65下恒温反应50min。 0030 进一步地， 所述阳性对照为含有鲤鱼浮肿病毒基因的质粒； 所述阴性对照为无核 酸去离子水。 0031 进一步地， 步骤3)中对步骤2)中得到的扩增产物进行显色检测具体为： 取出经步 骤2)的反应管， 冷却至室温， 2000rpm离心5秒， 按照阴性对照、 待检样品和阳性对照的顺序 依次分别加入l L反应显色液， 轻轻混匀， 直接用肉眼观察颜色变化， 绿色判断为阳性， 浅黄 色为阴性， 观察结束后将反应管装入密封袋， 丢弃至特定区域。 0032 与现有技术相比， 本发明可以获得包括以下技。
19、术效果： 0033 1)本发明根据靶基因序列设计了鲤鱼浮肿病毒检测用引物组， 能特异性识别靶序 列上的六个独立区域， 在Bst 3.0 DNA聚合酶的作用下启动循环链置换反应， 并且只有在4 条引物完全识别靶序列六个结合区的情况下才能顺利进行， 所以本发明的引物组在很大程 度上减少了扩增反应的背景影响， 大大增强了鲤鱼浮肿病毒检测的特异性； 0034 2)采用本发明的引物组对鲤鱼浮肿病毒进行检测， 因为特异性高， 所以可以根据 说明书 2/6 页 5 CN 107058633 A 5 是否扩增就能判断目标基因的存在与否； 0035 3)本发明的快速诊断试剂盒是利用等温扩增技术快速检测鲤鱼浮肿病。
20、毒， 检测灵 敏度高， 扩增模板仅需14拷贝； 0036 4)本发明的快速诊断试剂盒不但反应条件温和， 且所需仪器简单， 也不需要特殊 试剂， 克服了传统PCR固有的检测时间长、 容易污染及检测成本高等缺点； 0037 5)本发明的快速诊断试剂盒扩增快速且高效， 在不到1h即可完成扩增， 且产率高； 0038 6)本发明的快速诊断试剂盒鉴定简便， 从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中 的Mg2+结合， 产生副产物焦磷酸镁沉淀， 可通过肉眼观察鉴定， 并且加入显色液后， 阴阳 性结果显色差异显著， 验证率高， 更加明显可靠； 0039 7)本发明的快速诊断试剂盒操作简单， 对检测人员的技术素。
21、质要求较低， 可建立 成本低廉的快速筛选体系， 实现现场高通量快速检测； 0040 8)本发明的快速诊断试剂盒建立了一套经过优化的等温扩增反应体系， 不但使得 鲤鱼浮肿病毒定性检测更加简便快速、 特异性高、 灵敏度高， 而且该试剂盒是检测鲤鱼浮肿 病毒的第一个试剂盒， 填补了鲤鱼浮肿病毒无检测方法的缺口， 具有很高的科研和经济价 值。 0041 当然， 实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。 附图说明 0042 此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解， 构成本发明的一部分， 本发 明的示意性实施例及其说明用于解释本发明， 并不构成对本发明的不当限定。 在附图中：。
22、 0043 图1是本发明引物特异性测试图； 其中， 1： 鲤鱼浮肿病毒核酸； 2： 鲤疱疹II型病毒 核酸； 3： 鲤疱疹III型病毒核酸； 4： 鲤春病毒核酸； 5： 罗氏沼虾双顺反子病毒核酸； 6： 草鱼出 血病病毒核酸； 7： 嗜水气单胞菌核酸； 8： 健康鲤鱼DNA阴性对照； 9： 鲤鱼浮肿病毒基因阳性 质粒对照； 0044 图2是本发明灵敏性检测图； 其中， 1.1.4105copies； 2.1.4104copies； 3.1.4 103copies； 4.1.4102copies； 5.1.410copies； 6.1.4copies； 7.健康鲤鱼DNA阴性对照。 具体实施方式。
23、 0045 以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式， 藉此对本发明如何应用技术手 段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。 0046 本发明的思路为： 本发明采用链置换酶和等温扩增技术， 通过检测鲤鱼浮肿病毒 特定基因， 来检测鲤鱼浮肿病毒， 这是目前国内外首次建立的快速CEV检测方法。 该方法的 建立为鲤鱼浮肿病和锦鲤昏睡病的监测和预防奠定基础。 0047 实施例1 鲤鱼浮肿病毒可视化快速检测试剂盒 0048 鲤鱼浮肿病毒可视化快速检测试剂盒包括病毒DNA提取试剂和反应试剂， 该试剂 盒仅需常规离心机和水浴锅就可以完成核酸提取和检测， 并且整个检测过程仅需2小时， 。
24、检 测产物封闭观察， 不会污染环境， 此外， 检测结果可以通过肉眼观察颜色变化， 就可以判断 结果， 实用强。 0049 其中， 病毒DNA提取试剂包括以下组分： 80mM Tris、 50mM EDTA、 500mM NaCl、 1.5 说明书 3/6 页 6 CN 107058633 A 6 质量百分比的SDS、 0.01体积百分比 -巯基乙醇的pH 8.0的裂解液A； Tris饱和酚， pH8.0； 乙酸钠水溶液， 浓度3mol/L； 无水乙醇； DEPC水配置的含75无水乙醇的洗液A； DEPC水。 0050 反应试剂含有用于检测鲤鱼浮肿病毒扩增用核酸引物组， 该引物组包含引物CEV-。
25、 F3、 引物CEV-B3、 引物CEV-FIP、 引物CEV-BIP、 引物CEV-LpF和引物CEV-LpB； 0051 所述的引物CEV-F3的核苷酸序列如SEQ ID NO： 1所示； 0052 所述的引物CEV-B3的核苷酸序列如SEQ ID NO： 2所示； 0053 所述的引物CEV-FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO： 3所示； 0054 所述的引物CEV-BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO： 4所示； 0055 所述的引物CEV-LpF的核苷酸序列如SEQ ID NO： 5所示； 0056 所述的引物CEV-LpB的核苷酸序列如SEQ ID NO： 6所示。 0057。
26、 实施例2 利用实施例1所述的鲤鱼浮肿病毒可视化快速检测试剂盒进行检测的方 法 0058 (1)DNA抽提： 0059 取鲤鱼脾脏或心脏组织30-80mg于2mL离心管中， 于冰上用研磨棒研磨， 加600 L裂 解液A后， 继续研磨充分后加600 LpH值8.0的Tris饱和酚， 强烈振荡， 11000g离心10min， 取 上清液， 重复酚抽提； 取上清液， 加入0.1倍体积的浓度为3mo1/L的乙酸钠水溶液， 混匀， 再 加两倍体积的冰冷无水乙醇， 混匀后低温静置10min， 15000g离心5min， 弃上清， 沉淀用DEPC 水配置的含75无水乙醇的洗液A洗涤2次， 室温干燥510mi。
27、n后以30 L DEPC水重悬， -80 保存备用， 其中， 裂解液A含有80mM Tris、 50mM EDTA、 500mM NaCl、 1.5SDS、 0.01 -巯 基乙醇， pH 8.0。 0060 (2)鲤鱼浮肿病毒基因的快速扩增： 0061 根据待检测样品的数目， 设置所需快速反应管数N， N样品数+2， 其中l管为阳性 对照(含有鲤鱼浮肿病毒基因的质粒)， l管为阴性对照(无核酸去离子水)； 吸取预反应液的 体积为N23 L， 加入一洁净的1.5mL离心管中， 然后加入N L反应酶， 混合均匀， 1500 2000rpm离心10秒， 向设定的N个反应管中分别加入24 L混合液，。
28、 并向N个PCR反应管内按顺 序依次分别加入阴性对照、 待检DNA模板和阳性对照各l L； 然后在每个反应管中再分别加 入30 L封闭液， 盖紧管盖并做好标记， 2000rpm离心5秒； 在65下恒温反应50min。 0062 (3)显色观察： 0063 取出经步骤(2)的反应管， 冷却至室温， 2000rpm离心5秒， 按照阴性对照、 待检样品 和阳性对照的顺序依次分别加入l L显色液， 轻轻混匀， 直接用肉眼观察颜色变化， 若显示 绿色， 说明样品中含有鲤鱼浮肿病毒核酸， 显示为浅黄色则无鲤鱼浮肿病毒核酸。 0064 上述预反应液含有： 20mM pH为8.8的Tris-HC1、 8mM硫。
29、酸镁、 15mM氯化钾、 10mM硫酸 按、 0.l2Tween-20、 1.4mM dNTP、 0.6M甜菜碱、 0.2 M引物CEV-F3、 0.2 M引物CEV-B3、 1.6 M 引物CEV-FIP、 1.6 M引物CEV-BIP、 0.8 M引物CEV-LpF和0.8 M引物CEV-LpB， 其中所述的引 物CEV-F3序列如SEQ ID NO： 1所示； 所述的引物CEV-B3序列如SEQ ID NO： 2所示； 所述的引 物CEV-FIP序列如SEQ ID NO： 3所示； 所述的引物CEV-BIP序列如SEQ ID NO： 4所示； 所述的 引物CEV-LpF的核苷酸序列如SE。
30、Q ID NO： 5所示； 所述的引物CEV-LpB的核苷酸序列如SEQ ID NO： 6所示。 0065 实施例3 试剂盒特异性检测 说明书 4/6 页 7 CN 107058633 A 7 0066 (1)DNA抽提： 0067 取鲤鱼浮肿病毒阳性鲤鱼组织样品30-80mg于2mL离心管中， 于冰上用研磨棒研 磨， 加600 L裂解液A后， 继续研磨充分后加600 LpH值8.0的Tris饱和酚， 强烈振荡， 11000g 离心10min， 取上清液， 重复酚抽提； 取上清液， 加入0.1倍体积的浓度为3mo1/L的乙酸钠水 溶液， 混匀， 再加两倍体积的冰冷无水乙醇， 混匀后低温静置10。
31、min， 15000g离心5min， 弃上 清， 沉淀用DEPC水配置的含75无水乙醇的洗液A洗涤2次， 室温干燥510min后以30 L DEPC水重悬， -80保存备用。 0068 (2)鲤鱼浮肿病毒基因的快速扩增： 0069 设置9个快速反应管数， 吸取预反应液的体积为922 L， 加入一洁净的1.5mL离心 管中， 然后加入9 L反应酶， 混合均匀， 15002000rpm离心10秒， 向设定的9个反应管中分别 加入23 L混合液， 并向9个PCR反应管内按顺序依次分别加入健康鲤鱼DNA阴性对照、 鲤鱼浮 肿病毒核酸、 鲤疱疹II型病毒核酸、 鲤疱疹III型病毒核酸、 鲤春病毒核酸、 。
32、罗氏沼虾双顺反 子病毒核酸、 草鱼出血病病毒核酸、 嗜水气单胞菌核酸和鲤鱼浮肿病毒基因阳性质粒对照 各2 L； 然后在每个反应管中再分别加入30 L封闭液， 盖紧管盖并做好标记， 2000rpm离心5 秒； 在65下恒温反应50min。 0070 (3)显色观察： 0071 取出经步骤(2)的反应管， 冷却至室温， 2000rpm离心5秒， 按照阴性对照、 待检样品 和阳性对照的顺序依次分别加入l L显色液， 轻轻混匀， 直接用肉眼观察颜色变化， 若显示 绿色， 说明样品中含有鲤鱼浮肿病毒核酸， 显示为浅黄色则无鲤鱼浮肿病毒核酸。 检测结果 如附图1所示,仅鲤鱼浮肿病毒和鲤鱼浮肿病毒基因模版扩。
33、增后显色为阳性绿色， 其它病毒 或细菌显色都为阴性浅黄色， 表明对其它病毒和细菌无交叉扩增性。 0072 实施例4试剂盒灵敏度检测 0073 (1)DNA模板设置： 0074 取已被定量的鲤鱼浮肿病毒DNA样品进行梯度稀释， 设置鲤鱼浮肿病毒核酸拷贝 数浓度分别为： 1.4105copies、 1.4104copies、 1.4103copies、 1.4102copies、 1.4 10copies、 1.4copies和健康鲤鱼DNA阴性对照； -80保存备用。 0075 (2)鲤鱼浮肿病毒基因的快速扩增： 0076 设置7个快速反应管数， 吸取预反应液的体积为722 L， 加入一洁净的1。
34、.5mL离心 管中， 然后加入7 L反应酶， 混合均匀， 15002000rpm离心10秒， 向设定的7个反应管中分别 加入23 L混合液， 并向7个PCR反应管内按顺序依次分别加入健康鲤鱼DNA阴性对照和待检6 个稀释度的鲤鱼浮肿病毒DNA样品各2 L； 然后在每个反应管中再分别加入30 L封闭液， 盖 紧管盖并做好标记， 2000rpm离心5秒； 在65下恒温反应50min。 0077 (3)显色观察： 0078 取出经步骤(2)的反应管， 冷却至室温， 2000rpm离心5秒， 按照阴性对照、 待检样品 和阳性对照的顺序依次分别加入l L显色液， 轻轻混匀， 直接用肉眼观察颜色变化， 若。
35、显示 绿色， 说明样品中含有鲤鱼浮肿病毒核酸， 显示为浅黄色则无鲤鱼浮肿病毒核酸。 检测结果 如附图2所示,经Real-timePCR定量后的鲤鱼浮肿病毒DNA系列稀释的扩增显色图， 当反应 体系中加入14个病毒拷贝的DNA， 扩增显色结果就为阳性。 说明该试剂盒检测灵敏度可达14 个拷贝的病毒核酸。 说明书 5/6 页 8 CN 107058633 A 8 0079 上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例， 但如前所述， 应当理解发明并非 局限于本文所披露的形式， 不应看作是对其他实施例的排除， 而可用于各种其他组合、 修改 和环境， 并能够在本文所述发明构想范围内， 通过上述教导或相关领。
36、域的技术或知识进行 改动。 而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围， 则都应在发明所附权 利要求的保护范围内。 说明书 6/6 页 9 CN 107058633 A 9 SEQUENCE LISTING 浙江省淡水水产研究所 一种鲤鱼浮肿病毒可视化快速检测试剂盒及其检测方法 2017 6 PatentIn version 3.3 1 18 DNA 人工序列 1 agcaacaact tgacgagg 18 2 22 DNA 人工序列 2 aactagagag actagaagtt gc 22 3 47 DNA 人工序列 3 ggcatacact tattctccag atcattttgt atatcttgag aagcagc 47 4 45 DNA 人工序列 4 ttaggattga agcaagagct gctttttgtt ggagatggtg gtaac 45 5 20 DNA 人工序列 5 tggaattgta gcaggtggag 20 6 22 序列表 1/2 页 10 CN 107058633 A 10 DNA 人工序列 6 gcactcttag gaggacaagt aa 22 序列表 2/2 页 11 CN 107058633 A 11 图1 图2 说明书附图 1/1 页 12 CN 107058633 A 12 。