技术领域
本发明属于普洱茶生产技术及产品品质改善领域，涉及一株酵母 Blastobotrys adeninivorans菌株0071-BA及其加工熟普茶的方法。
背景技术
普洱熟茶属于后发酵茶，是以晒青毛茶为原料经过一个月以上的渥堆发酵制得，普遍认为普洱茶具有降血脂、促消化的功效作用。普洱茶最重要的特征是随着储藏时间的延长，茶叶的口感香气等特征会发生变化，并呈现越来越好的口感。随着普洱茶储藏时间的延长，普洱茶的价值和价格都会显著增加。
酵母属在自然界分布较多，在酿酒发酵、面粉发酵等食品领域有众多应用，研究发现酵母菌体中富含蛋白质、氨基酸以及多种代谢酶。在酵母菌的胞外酶作用下，茶叶可发生一些茶多酚氧化、氨基酸聚合等反应。
Blastobotrys adeninivorans也被报道为Arxula adeninivorans，是子囊菌门酵母菌科的真菌，在国内外均有报道发现，国内多在普洱茶中存在，但对其相关研究很少。
发明内容
为此，本发明从微生物资源挖掘和开发利用的角度，分离得到了 Blastobotrys adeninivorans菌株，提供了将其应用于普洱茶加工工艺中进行强化发酵的方法，使普洱茶具有特殊的醇香和脂香，抑制有害霉菌，同时极大的缩短发酵时间。
本发明所述的一种Blastobotrys adeninivorans菌株0071-BA，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.15960。
上述的微生物菌株，由昆明中茶普洱茶存储仓中分离纯化得到，遗传稳定，符合普洱茶高温汽蒸等生产要求的菌株，包括如下步骤：
1、在昆明中茶普洱茶储存仓选取几个地点，利用空气沉降法和表面涂抹取样法进行取样；
2、取样后于PDA固体培养基进行培养，于28-30℃条件下培养10天进行倒置培养，同时进行空白对照组培养，记录菌落生长情况；
3、记录菌落生长情况，进行菌落识别；选取菌落形态相互区别的菌落进行下一步纯化；
4、挑取筛选菌落划线接种至PDA固体培养基上，于28-30℃条件下培养5-10天，直至得到各个菌株的单菌落；
5、将获得的菌株进行菌株鉴定，挑选能够在20-45℃生长，在20-75℃生存，可应用于普洱茶生产，抑制杂菌能力强，且遗传稳定的菌株，其保藏编号为CGMCC No.15960。
利用本专利的Blastobotrys adeninivorans菌株进行普洱茶工艺的强化发酵，所述的强化发酵是在渥堆发酵前接入含有所述保藏编号为CGMCC No. 15960的单一菌种经培养后得到的液体种子；所述液体种子通过如下方法制备：
1、取活化后的Blastobotrys adeninivorans(CGMCC No.15960)菌株接种至液体培养基。所述的液体培养基包括PDB液体培养基以及利用茶叶、茶粉制备茶汁的液体培养基。
2、将于28-30℃条件下，在无菌条件下于摇床中进行培养。所述液体种子的密度为106cfu/mL以上。
利用本专利的Blastobotrys adeninivorans菌株制备强化发酵工艺的标准化普洱茶产品，其特征在于，能够使普洱茶具有特殊的醇香和脂香，抑制有害霉菌，同时极大的缩短发酵时间。所述标准化普洱工艺包括毛茶拼配、混料、喷洒接种、渥堆发酵、翻堆、开沟干燥，按如下方法进行：
1、将不同原料按要求进行拼配、混匀后，要求混料后茶叶无花杂；
2、将制备的液体种子接种到茶叶原料中，使用小型喷雾器均匀喷洒将菌液均匀喷洒到茶叶上，接种量为25-35％，菌液喷洒均匀、茶叶不结块；
3、将接种后的茶叶堆放成高1米、长宽为(2-3)*(2-3)米的茶堆，进行渥堆发酵，堆芯温度在40-50度左右，堆表面温度为30-35度，水分含量在40％-50％左右；
4、每隔7天翻堆一次，让堆芯茶叶与对堆表茶叶混合均匀，并保持堆芯温度以及水分含量；
5、翻堆2-3次后发酵14-21天后，在大堆上开沟，进行通风干燥。
本发明菌株应用于普洱茶生产加工中，对普洱茶的品质转化起到很大的积极作用，通过对茶叶进行强化发酵，使普洱茶具有特殊的醇香和脂香，抑制有害霉菌，滋味醇厚回甘，同时极大的缩短发酵时间。
具体实施方式
本发明下述实施例中所述的PDA固体培养基、PDB液体培养基均按照现有技术中常规方法制备。
本发明中Blastobotrys adeninivorans菌株(CGMCC No.15960)的选育方法，包括如下步骤：
1、在昆明中茶普洱茶储存仓选取几个地点，利用空气沉降法和表面涂抹取样法进行取样；
2、将取样后的PDA固体培养基，于28-30℃条件下培养10天进行倒置培养，同时进行空白对照组培养，记录菌落生长情况；
3、记录菌落生长情况，进行菌落识别；选取代表性菌落，菌落形态相互区别的菌落进行下一步纯化；
4、挑取上述菌落划线接种至PDA固体培养基上，于28-30℃条件下培养5-10天，直至得到各个菌株的单菌落，将获得的所有菌株进行编号(共计50株)；
5、将获得的菌株进行菌株鉴定，并进行耐热性实验和遗传稳定性实验，筛选能够用在20-45℃生长，在20-75℃生存，应用于普洱茶生产，抑制杂菌能力强，且遗传稳定的菌株，其保藏编号为CGMCC No.15960。
将由上述步骤中分离得到的菌株0071-BA，进行菌株鉴定，结果为 Blastobotrys adeninivorans。该菌株遗传稳定性稳定，有良好的耐热性，能够在符合生产要求，送样编号为0071-BA，菌株于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.15960， Blastobotrys adeninivorans，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018年6月19日，目前状态为存活。
本发明Blastobotrys adeninivorans菌株接种于PDA培养基，于28-32℃下培养18-24小时后开始生长，菌落圆形，微隆起，乳白色，边缘整齐，表面光滑粘稠且不透明，显微镜下可见菌落细胞为椭圆形，具有酵母菌株的典型特点。该菌株生长速度快，生长速率为1.95mm-2.23mm/d(菌落直径/天)，利用氨基酸作为氮源，与其他微生物竞争生长，能够抑制黄曲霉、毛霉等微生物的生长，也可在酵母胞外酶的作用下促使茶多酚、茶红素、黄酮减少，增加茶褐素、咖啡碱含量。
将该菌株用于普洱茶发酵生产，增加制备液体种子和接种步骤，形成强化发酵工艺，包括毛茶拼配、混料、制备液体种子、喷洒接种、渥堆发酵、翻堆、开沟干燥、压制成型。该工艺特点是接种前不灭菌，不影响普洱毛茶的天然滋味特点，接种后能够在茶叶中快速生长，且快速转化茶叶中氨基酸、黄酮等物质成分，增加茶褐素，并使普洱茶中有独特的醇香，略带乳脂香。
其中所述的液体种子是利用Blastobotrys adeninivorans(CGMCC No. 15960)按照如下方法制备：
1、取活化后的Blastobotrys adeninivorans(CGMCC No.15960)菌株接种至液体培养基。所述的液体培养基包括PDB液体培养基以及利用茶叶、茶粉制备茶汁的液体培养基。
2、将上述培养液于28-30℃，在无菌条件下置于摇床中培养。所述液体种子的密度为106cfu/mL以上。
所述的标准化强化发酵工艺，按如下方法进行：
1、将不同原料按要求进行拼配、混匀后，要求混料后茶叶无花杂；
2、将茶叶原料置于洁净的生产线上，将制备的液体种子接种到茶叶中，使用小型喷雾器均匀喷洒将菌液均匀喷洒到茶叶上，同时不停搅拌、翻动，液体种子的接种量为25-35％，要求菌液喷洒均匀、茶叶不结块；
3、将接种后的茶叶堆放成高1米、长宽为(2-3)*(2-3)米的茶堆，于控温控湿的洁净环境进行发酵，温度为27-33℃，空气相对湿度为70-80％条件下，进行渥堆发酵，要求发酵过程中堆芯温度在40-50度，堆表面温度为30-35度，水分含量在40％-50％左右；
4、每隔7天翻堆一次，让堆芯茶叶与对堆表茶叶混合均匀，减少结块，并保持堆芯温度在40-50度，水分含量40％-50％；
5、翻堆2-3次后发酵14-21天后，在茶堆上进行开沟，通风干燥5-10 天，至水分达到12-15％时结束生产。
实施例1强化发酵普洱茶
按照本发明的方法，采用单菌株标准化强化发酵工艺制备普洱熟茶。按如下方法进行：
1、将3种不同产区的云南大叶种晒青毛茶原料按要求进行拼配、混匀后，要求混料后茶叶无花杂；
2、取活化后的Blastobotrys adeninivorans(CGMCC No.15960)菌株接种至PDB液体培养基。
3、将液体培养基于28℃，在无菌条件下置于摇床中培养。所述液体种子的密度为5*106cfu/mL。
4、将拼配后的茶叶原料置于洁净的生产线上，将制备的液体种子接种到茶叶中，使用小型喷雾器均匀喷洒将菌液均匀喷洒到茶叶上，同时不停搅拌、翻动，液体种子的接种量为35％，要求菌液喷洒均匀、茶叶不结块；
5、将接种后的茶叶堆放成高1米、长宽为2*3米的茶堆，于控温控湿的洁净环境进行发酵，温度为33℃，空气相对湿度为80％条件下，进行渥堆发酵，要求发酵过程中堆芯温度在45度，堆表面温度为32度，水分含量在40％左右；
6、每隔7天翻堆一次，让堆芯茶叶与对堆表茶叶混合均匀，减少结块，并保持堆芯温度在45度，水分含量40％；
7、翻堆3次后发酵21天后，在茶堆上进行开沟，通风干燥8天，至水分达到12％时结束生产。
本实施例制备的普洱熟茶，品质稳定，其滋味醇厚，香气浓厚，茶多酚快速转化，茶褐素含量答复增加。其香气具有特殊的醇香，尾香略带有乳脂香。连续制备五批次，发酵成功率提高，霉变率降低，杂菌对发酵的干扰降低。生产周期与对比例相比缩短31天。
实施例2强化发酵普洱茶
按照本发明的方法，采用单菌株标准化强化发酵工艺制备普洱熟茶。按如下方法进行：
1、将2种不同产区的云南大叶种晒青毛茶原料按要求进行拼配、混匀后，要求混料后茶叶无花杂；
2、取活化后的Blastobotrys adeninivorans(CGMCC No.15960)菌株接种至PDB液体培养基。
3、将液体培养基于28℃，在无菌条件下置于摇床中培养。所述液体种子的密度为1*106cfu/mL。
4、将拼配后的茶叶原料置于洁净的生产线上，将制备的液体种子接种到茶叶中，使用小型喷雾器均匀喷洒将菌液均匀喷洒到茶叶上，同时不停搅拌、翻动，液体种子的接种量为27％，要求菌液喷洒均匀、茶叶不结块；
5、将接种后的茶叶堆放成高1米、长宽为2*2米的茶堆，于控温控湿的洁净环境进行发酵，温度为27℃，空气相对湿度为70％条件下，进行渥堆发酵，要求发酵过程中堆芯温度在40度，堆表面温度为30度，水分含量在40％左右；
6、每隔7天翻堆一次，让堆芯茶叶与对堆表茶叶混合均匀，减少结块，并保持堆芯温度在40度，水分含量40％；
7、翻堆2次后发酵14天后，在茶堆上进行开沟，通风干燥5天，至水分达到15％时结束生产。
本实施例制备的普洱熟茶，品质稳定，其滋味醇厚，茶多酚快速转化，茶褐素含量增加。其香气具有特殊的醇香，尾香略带有乳脂香。连续制备五批次，发酵成功率提高，霉变率降低，杂菌对发酵的干扰降低。生产周期与对比例相比缩短41天。
对比例1普洱茶常规制备
按照《地理标志产品-普洱茶》(GB/T 22111)的要求，将茶叶原料制备为普洱熟茶，渥堆发酵时间为35天，完整生产周期为60天。
对上述实施例的普洱熟茶成分和品质进行检测和评审。每个实施例取三份样品，检测结果平均值分别记录于下表1。
表1普洱熟茶品质的检测结果
由表1的普洱熟茶数据可知，实施例1和2的茶褐素、咖啡碱含量高于对比例，且茶叶香气独特，具有传统工艺少有的醇香，与传统普洱茶有着显著区别，且能够有效抑制其他杂菌的生长，提高渥堆发酵成功率，同时大幅缩短发酵时间一半以上。总体而言，利用Blastobotrys adeninivorans 制备的实施例1和2整体优于对比例。
此外，对比例重复五次后，评审汤色深红，不同批次之间颜色深浅有别，品质不稳定，无法标准化生产，且有堆味，必须经过长时间的后期陈化，才能够真正压饼制备为产品。而通过本专利的方法，实施例1和2的五个批次之间无肉眼可见的汤色差别，在相同的工艺参数下，滋味、香气稳定。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。