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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710498577.3 (22)申请日 2017.06.27 (71)申请人 南京工业大学 地址 211816 江苏省南京市浦口区浦珠南 路30号 (72)发明人 陈可泉李欢欢曹逊王昕 欧阳平凯 (74)专利代理机构 南京汇恒知识产权代理事务 所(普通合伙) 32282 代理人 王月霞 (51)Int.Cl. C12P 13/06(2006.01) C12N 11/02(2006.01) C12N 9/16(2006.01) (54)发明名称 一种利用固定化磷脂酶D生产磷脂。
2、酰丝氨酸 的方法 (57)摘要 本发明公开了一种利用固定化磷脂酶D生产 磷脂酰丝氨酸的方法， 配制表面活性剂水溶液， 室温下， 边搅拌边滴加游离酶水溶液至澄清， 得 混合液； 将混合液滴加至金属离子盐溶液中， 室 温下搅拌反应0.5h-2h后得固定化的酶溶液； 离 心， 干燥得到固定化的磷脂酶催化剂； 将溶于有 机相中的卵磷脂、 丝氨酸溶液与固定化酶进行转 化反应， 温度0-40， 时间1-24小时。 本发明利 用固定化的磷脂酶D生产的磷脂酰丝氨酸浓度是 游离酶的5-10倍， 大大降低了两相界面的传质阻 力， 增大了酶与底物的接触面积， 缩短了反应时 间， 而且固定化后的磷脂酶可重复利用， 适。
3、应于 规模化生产。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 107099562 A 2017.08.29 CN 107099562 A 1.一种利用固定化磷脂酶D生产磷脂酰丝氨酸的方法， 其特征在于， 包括如下步骤 ： 1） 固定化酶的制备 配制0.02-5 mmol/mL表面活性剂水溶液， 室温下， 边搅拌边滴加磷脂酶D水溶液至澄 清， 得混合液； 将混合液边搅拌边滴加至0.02-5 mmol/L金属离子盐溶液， 搅拌反应0.5-2 h后得固 定化的磷脂酶D溶液； 将固定化的磷脂酶D溶液离心， 并用去离子水冲洗1-3次， 洗去未吸附的游离酶， 真空 冷冻干燥至恒重即可得到固定化的磷脂酶D。
4、； 2） 磷脂酰丝氨酸的制备 将卵磷脂溶于有机相中， 加入丝氨酸水溶液和步骤1)中制备的固定化磷脂酶D进行反 应， 温度0-40， 时间 1-24 小时,将有机相用洗脱剂进行洗脱， 得含有磷脂酰丝氨酸的转 化液。 2.根据权利要求 1 所述的利用固定化磷脂酶D生产磷脂酰丝氨酸的方法， 其特征在 于， 所述金属离子盐为氯化钴、 氯化钙、 氯化锰、 氯化镁中任意一种。 3.根据权利要求 1 所述的利用固定化磷脂酶D生产磷脂酰丝氨酸的方法， 其特征在 于， 所述步骤中搅拌反应的温度 0-37， 反应时间 1-6h。 4.根据权利要求 1 所述的利用固定化磷脂酶D生产磷脂酰丝氨酸的方法， 其特征在 于。
5、， 所述有机相为氯仿、 乙酸乙酯、 二氯甲烷、 乙醚、 正己烷中任一种。 5.根据权利要求 1 所述的利用固定化磷脂酶D生产磷脂酰丝氨酸的方法， 其特征在 于： 卵磷脂、 丝氨酸的摩尔比为1:580。 6.根据权利要求 1 所述的利用固定化磷脂酶D生产磷脂酰丝氨酸的方法， 其特征在于 ： 所述表面活性剂为脱氧胆酸钠、 AOT、 CTAB、 Tween80及鹅脱氧胆酸钠中任意一种。 7.根据权利要求 1 所述的利用固定化磷脂酶D生产磷脂酰丝氨酸的方法， 其特征在于 ： 所述磷脂酶D水溶液的浓度为1mg/mL10mg/ mL。 8.根据权利要求 1 所述的利用固定化磷脂酶D生产磷脂酰丝氨酸的方法，。
6、 其特征在于 ： 卵磷脂溶于有机相中的卵磷脂浓度为550g/l。 9.根据权利要求 1 所述的利用固定化磷脂酶D生产磷脂酰丝氨酸的方法， 其特征在于 ： 步骤2） 中所述洗脱剂为氯仿与甲醇以体积比2:1混合而成。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107099562 A 2 一种利用固定化磷脂酶D生产磷脂酰丝氨酸的方法 技术领域 0001 本发明属于生物化工技术领域， 具体涉及一种用固定化磷脂酶生产磷脂酰丝氨酸 的方法。 背景技术 0002 磷脂酰丝氨酸( phosphatidylserine , PS) 主要用于治疗脑衰老 ,近几年更以 “脑专一性营养物质” 引起广泛的关注 。 从大豆或牛脑。
7、中提取的高纯度磷脂酰丝氨酸( 纯 度 95 %以上) , 是一种以有效补充细胞内代谢消耗的磷脂酰丝氨酸为目的的一种高效营 养补剂 。 磷脂酰丝氨酸在动物 、 高等植物和微生物中分布广泛但是数量少 , 是细胞膜磷 脂的重要组分之一。 它占哺乳类动物脑中全部磷脂的 10 % 20 %,对许多细胞代谢过程 有重要的调节作用。 如磷脂酰丝氨酸通过甲基化可生成磷脂酰胆碱， 后者又可作为合成乙 酰胆碱的前体 , 参与调节细胞膜的流动性， 并在细胞膜受体与第二信使间起中介作用。 另 外， 磷脂酰丝氨酸还可激活细胞膜上的 Na +/K + - ATP酶 、 蛋白激酶 C 和酪氨酸羟化 酶。 0003 研究表明。
8、， 磷脂酰丝氨酸的合成大都采用的是两相反应， 但是由于两相反应之间 的传质阻力较大， 大大降低了酶与底物的接触面积， 因此效率低， 周期长， 不利于工业化生 产。 固定化酶将为工业化生产磷脂酰丝氨酸提供了新的思路。 固定化酶是指固定在适合载 体上并在一定空间范围内能连续进行催化反应的酶。 固定化酶不仅保持了酶的催化特性， 而且克服了游离酶的不足， 增加了酶的稳定性。 磷脂酰丝氨酸的研究成为了国内外的研究 热点， 但至今， 利用脱氧胆酸盐复合物固定化磷脂酶D在生产磷脂酰丝氨酸方面尚未见相关 专利和报道。 Juneja等将一定量的卵磷脂和 L-丝氨酸分别溶于乙酸乙酯和醋酸盐缓冲液 ( pH 5.6。
9、) 中， 然后把这两种溶液按一定比例混合， 并用 PLD 催化合成磷脂酰丝氨酸， 优 化条件后， 磷脂酰丝氨酸的产率可达 98%。 Zhang等在氯仿-磷酸盐缓冲液( pH 7.0) 的液 液双相体系中 PLD 催化大豆卵磷脂合成磷脂酰丝氨酸， 65 下反应 6 h 后， 磷脂酰丝 氨酸产率达 86%。 Sakai 等使用均质化设备将大豆卵磷脂分散于水中， 使整个反应体系呈 均质胶状， 其中水的用量是大豆卵磷脂质量的10% 100% ， 在最优条件下， 5 h 后， 产 物中磷脂酰丝氨酸的含量为 46.7%。 由于两相体系中存在界面阻力较大， 传质效率较低等 缺点。 就目前而言水-有机两相催化。
10、的核心问题是如何提高催化剂的重复使用性和催化活 性。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种利用固定化磷脂酶生产磷脂酰丝氨酸的方法， 固定化 后磷脂酶催化效率高， 可以回收并重复利用。 为实现上述目的， 本发明采用的技术方案为 ： 利用固定化磷脂酶D生产磷脂酰丝氨酸的方法， 包括如下步骤 ： 1） 固定化酶的制备 说明书 1/4 页 3 CN 107099562 A 3 配制0.02-5 mmol/mL表明活性剂水溶液， 室温下， 边搅拌边滴加磷脂酶D水溶液至澄 清， 得混合液； 将混合液边搅拌边滴加至0.02-5 mmol/L金属离子盐溶液中搅拌得固定化酶溶液； 将 固定化酶溶液溶液离。
11、心， 并用去离子水冲洗1-3次， 洗去未吸附的游离酶， 真空冷冻干燥至 恒重即可得到固定化酶。 0005 所述固定化酶的制备条件为反应温度 0-37， 反应时间 1-6h 。 0006 金属盐离子与表面活性剂形成络合物沉淀， 得到的沉淀是固定化载体,把酶包埋 进去， 得到固定化酶， 每g的载体质量可以固定20mg磷脂酶D， 酶的量为 20mg 磷脂酶/g 固 定化载体。 0007 所述酶活力测定方法如下 ： 游离酶活力测定： 将1ml游离酶加入到含有2ml的10g/l的卵磷脂的有机相及2ml的丝氨 酸水溶液中， 于 37、 200rpm 下反应 1h， HPLC 分析测定酶活。 0008 固定。
12、化酶活力测定： 将与1ml游离酶同等酶量的固定化酶中加入含有2ml的10g/l 的卵磷脂的有机相及2ml的丝氨酸水溶液中， 37、 200rpm 下反应 1h， HPLC 分析测定磷 脂酰丝氨酸的产量。 0009 酶活力定义： 每分钟催化产生 1umol 磷脂酰丝氨酸所需酶量定义为一个酶活力 单位 (1U)。 0010固载率=。 0011 2） 磷脂酰丝氨酸的制备 将溶于有机相中的卵磷脂、 丝氨酸溶液与步骤1制备的固定化酶进行转化反应， 所述 转化反应体系的条件为温度 0-40， 时间1-24 小时， 即得含有磷脂酰丝氨酸的转化液。 0012 所述卵磷脂浓度为550g/l， 卵磷脂与丝氨酸的摩。
13、尔比为1:580。 0013 取100ul有机相， 然后用900ul的氯仿： 甲醇=2:1进行洗脱， 即得含有磷脂酰丝氨酸 的转化液， 进行高效液相检测。 0014 所述高效液相色谱蒸发光检测， 色谱柱为安捷伦 ZORBAX Rx-SIL 正向硅胶色谱 柱(250 mm 4.6 mm5um） 。 具体条件为： 流动相A:85%甲醇， 14.5%水， 0.45%乙酸， 0.05% 三乙胺， 流动相B:20%正己烷， 48%异丙醇， 32%流动相A。 采用梯度洗脱， 条件如下： 初始2% A, 5min： 10%A,9min： 30%A， 11min： 10%A， 14min： 10%A， 17m。
14、in:2%A。 流速1ml/min， 柱温： 38； 进 样量： 10ul。 检测使用蒸发光散射检测器， 检测温度72， 漂移管温度72， 氮气流速 2.0SLM。 0015 所述表面活性剂为脱氧胆酸钠、 AOT、 CTAB、 Tween80及鹅脱氧胆酸钠中任一种。 0016 所述有机相为氯仿、 乙酸乙酯、 二氯甲烷、 乙醚、 正己烷中任一种。 0017 本发明中所述磷脂酶D水溶液可以由磷脂酶D配置而成， 所述磷脂酶D水溶液浓度 为1mg/mL10mg/ mL， 也可以通过链霉菌发酵得到。 0018 所述链霉菌包括但不限于色褐链霉菌、 穗色链霉菌、 灰色链霉菌等。 0019 将保存于甘油管中的。
15、链霉菌 （中国工业微生物菌种保藏中心购买） 经诱导培养3- 30h,离心收集发酵液， 然用旋蒸仪旋蒸浓缩。 测定粗酶液蛋白浓度。 0020 所述菌种培养过程为 ： 将保存于甘油管中的链霉菌(中国工业微生物菌种保藏 说明书 2/4 页 4 CN 107099562 A 4 中心购买)菌株， 划线于GYP 斜面， 30培养至出现单菌落， 用牙签挑取单菌落于种子培养 基 （ 50mL GYP/100mL 锥形瓶） ， 30、 200rpm 振荡培养 0-24h， 以 1% 的接种量接入扩大 培养基 （100ml GYP/500ml 锥形瓶） ， 30、 200rpm 培养 3-30h ； 所述菌液离。
16、心条件为 8000rpm， 4 ， 离心 10min。 旋蒸仪浓缩2-10倍。 0021 所述蛋白浓度测定方法为 bradford 法。 0022 本发明同菌体静息细胞转化或游离酶转化生产磷脂酰丝氨酸相比较， 具有如下优 点 ： 采用本发明的固定化技术， 制取的固定化酶的催化效率， 稳定性好， 固定化酶反应过程 操作简便， 有利于实现工业化生产。 磷脂酰丝氨酸的摩尔收率最高可达94.2%， 由于本发明 的固定化酶本身具有表面活性剂的性质， 可以降低界面阻力、 增加酶与底物的接触面积， 缩 短了反应时间， 制备的固定化酶又可以重复使用， 降低了成本。 附图说明 0023 图1不同表面活性剂对磷脂。
17、酶D固定化的影响。 具体实施方式 0024 下面通过实例对本发明作进一步说明。 0025 实施例 1 磷脂酶D粗酶液的制备 将保存在甘油管中的链霉菌LMG20273 （中国工业微生物菌种保藏中心购买） 菌种划线 于GYP斜面， 30培养至出现单菌落 ； 用牙签挑取单菌落于种子培养基 （ 50mL GYP/100mL 锥形 瓶） ， 30、 200rpm 振荡培养 0-24h ； 以 1% 的接种量接入扩大培养基 （ 100mL GYP/ 100mL 锥形瓶） ， 30、 200rpm 培养 3-30h。 离心收集发酵液， 离心条件为 8000rpm， 4， 离心 10min ； 旋蒸仪浓缩2-。
18、10倍， bradford法测定粗酶液蛋白浓度， 蛋白浓度为2mg/ml。 0026 GYP斜面培养基： 葡萄糖： 5g/L， 酵母粉： 5g/L， 蛋白胨： 5g/L， K2HPO4:2g/L， MgSO4 7H2O:0.5g/L。 0027 种子培养基及扩大培养基配方为： 葡萄糖： 5g/L， 酵母粉： 5g/L， 蛋白胨： 5g/L， K2HPO4:2g/L， MgSO47H2O:0.5g/L。 0028 实施例2 磷脂酶D的固定化 称取46mgCoCl6H2O， 将其溶于10ml水中， 搅拌， 溶解备用。 将41.4mg脱氧胆酸钠溶于 8ml水中， 并加入1ml粗酶液， 搅拌至澄清后，。
19、 滴加到已配制的CoCl6H2O溶液中， 室温下， 搅拌 30min， 得固定化酶溶液； 将固定化酶溶液离心， 并用去离子水冲洗1-3次， 洗去未吸附的游 离酶， 真空冷冻干燥至恒重即可得到固定化后的磷脂酶D。 游离酶的蛋白浓度： 2mg/ml， 粗酶 液体积为1ml,上清中的蛋白量： 1.15mg， 洗液中的蛋白量:0.022mg， 载体质量为41.4mg,根 据公式计算得固定化率为： 2%。 0029 实施例 3 不同表面活性剂对磷脂酶D固定化的影响 称取6份46mgCoCl6H2O， 将其分别溶于10ml水中， 搅拌， 溶解备用。 分别称取41.4mg脱 氧胆酸钠、 鹅脱氧胆酸钠、 AO。
20、T、 CTAB及Tween80， 将其溶于8ml水中， 各加入1ml粗酶液， 搅拌 至澄清后， 滴加到已配制的CoCl6H2O溶液中， 室温下， 搅拌30min， 得固定化酶溶液； 将固定 说明书 3/4 页 5 CN 107099562 A 5 化酶溶液离心， 并用去离子水冲洗1-3次， 洗去未吸附的游离酶， 真空冷冻干燥至恒重即可 得到固定化后的磷脂酶D， 5种的固定化酶的固定化率基本一致为2%。 0030 分别称取上述制得的0.1g固定化酶， 加入2ml的含有10g/l的卵磷脂的二氯甲烷及 2ml的26.25g/l的丝氨酸水溶液中 （卵磷脂与丝氨酸的摩尔比为1:20） ， 37、 200。
21、rpm 下反 应 6h， HPLC 分析测定磷脂酰丝氨酸的产量， 如图1所示。 表面活性剂为脱氧胆酸钠时， 磷脂 酰丝氨酸的产量最高为6.8g/l。 0031 实施例 4固定化磷脂酶D生产磷脂酰丝氨酸的酶活对比及固定化酶的重复使用性 分别称取0.1g实施例2制备的固定化酶 （相当于2mg蛋白含量） 与1ml的游离酶 （蛋白含 量为2mg） ， 于2ml的含有10g/l的卵磷脂的二氯甲烷及2ml的26.25g/l的丝氨酸的水溶液 (卵磷脂与丝氨酸的摩尔比为1:20)中进行反应， 反应体系的条件为温度 37， 转速为200 rpm， 反应时间 8h， 得含有磷脂酰丝氨酸的转化液， 测定转化液中磷脂。
22、酰丝氨酸的含量， 结 果如表1所示。 固定化酶的磷脂酰丝氨酸的产量是游离酶的5倍。 0032 上述一次转化完成后， 用 pH7.0 磷酸缓冲液清洗固定化酶 2 次， 重新将该固定 化酶投入反应中进行上述反应， 共重复进行 4次反应， 固定化酶活性仍保留 50%左右， 重复 试验结果见表2所示， 固定化酶的重复使用率可达到4次。 。 0033 转化液中磷脂酰丝氨酸的含量测定方法： 转化液经洗脱液后经色谱柱为安捷伦 ZORBAX Rx-SIL 正向硅胶色谱柱(250 mm 4.6 mm5um） 。 具体条件为： 流动相A:85%甲 醇， 14.5%水， 0.45%乙酸， 0.05%三乙胺， 流动相。
23、B:20%正己烷， 48%异丙醇， 32%流动相A。 采用 梯度洗脱， 条件如下： 初始2% A, 5min： 10%A,9min： 30%A， 11min： 10%A， 14min： 10%A， 17min: 2%A。 流速1ml/min， 柱温： 38； 进样量： 10ul。 检测使用蒸发光散射检测器， 检测温度72， 漂移管温度72， 氮气流速2.0SLM。 0034 表1: 固定化酶8h游离酶8h 磷脂酰丝氨酸 （g/l）9.42+0.0351.63+0.012 摩尔收率(%)94.2+0.3516.3+0.12 结论： 固定化酶的磷脂酰丝氨酸的产量是游离酶的5倍左右。 0035 表2： 说明书 4/4 页 6 CN 107099562 A 6 图1 说明书附图 1/1 页 7 CN 107099562 A 7 。