技术领域
本发明属于微生物领域，更具体地讲，涉及大肠杆菌O157：H7菌膜的培养方法和检测方法。
背景技术
食源性疾病的发病率在过去的几年里有所增加，并成为全球主要的公共卫生问题。食源性致病菌是导致食源性疾病的一个重要的诱因，因此，对食源性致病菌进行分析检测、并控制其蔓延具有重要意义。大肠杆菌O157：H7是重要的食源性致病菌，危害广泛，容易出现在蔬菜水果等食品中。大肠杆菌O157：H7难以清除是因为易于在食品及加工器械表面形成菌膜。
细菌能在固体表面结合、散播和生长，最终可形成一个生物膜。菌膜是细菌在生长过程中为了适应生存环境而吸附于物体后形成的一种特殊的复合体，由细菌和自身分泌的多糖、蛋白质等胞外基质组成，是一个三维立体空间结构的生态系。菌膜常紧紧附着于活性或惰性实体的表面，使菌体免受干燥、UV辐射以及其他环境胁迫，同时也可以防护菌体免受植物的免疫反应和其免疫产物的影响。对食物进行常规清洗和灭菌处理的过程中，菌膜也使得菌体得以存活，对食品安全控制造成极大威胁。
当细菌受到各种压力，如低pH值，高渗透压，抗菌剂和抗生素时，为了抵抗不利的环境，细菌便以同样的方式生长形成生物菌膜，这是细菌具有的一种非常重要的环境适应机制。细菌体从最初游离状态开始经历了5个发育阶段：细胞可逆性黏附、细胞不可逆聚集、菌膜的早期发育(微菌落扩增)、菌膜稳定及菌膜解离，并最终通过菌膜裂解释放出浮游细菌体启动下一轮菌膜发育。同时，菌膜作为一种微生物的主要生长状态，严重影响人类的健康，抵抗抗生素的作用，高达80％的细菌感染是由菌膜引起的。由菌膜导致的腐蚀和生物污损问题，严重降低了工业生产产率，并成为致病菌传播的主要途径之一。
目前对于菌膜的研究广泛，急需一种可控且定量的培养方法。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种大肠杆菌O157：H7菌膜的培养方法。
为实现以上目的，本发明公开以下技术方案：一种大肠杆菌O157：H7菌膜的培养方法，其特征在于，所述培养方法为“吸附—生长”两步法，前培养使用LB培养基，吸附时使用LB培养基，生长时使用MM培养基，并且在菌膜生长时聚苯乙烯板最外侧孔洞加入无菌水。
作为一个优选方案，孔洞加入无菌水的量至少为孔洞体积的三分之一。
作为一个优选方案，大肠杆菌O157：H7吸附时间为3-6小时，生长时间为24-96小时。
作为一个优选方案，染色时使用结晶紫染色法，脱色时使用乙醇脱色法
本发明的优点在于：本发明着眼于食源性致病菌大肠杆菌O157：H7菌膜的培养方法，创立了“吸附-生长”两步法，不同阶段所用的培养基和培养时间不同，生长时使用营养成分更少的MM培养基，并且生长时在外侧孔洞加入无菌水使得整个生长环境一致，优化了菌膜生长效率，为实验研究微生物菌膜提供有效技术方案。
附图说明
图1.96孔聚苯乙烯板培养大肠杆菌O157：H7接菌示意图；
图2.大肠杆菌O157：H7菌膜染色脱色后示意图；
图3.大肠杆菌O157：H7菌膜培养后结晶紫染色显微镜观察图；
图4.大肠杆菌O157：H7菌膜培养后活菌染色荧光显微镜观察图；
图5.不同培养方法菌膜生长量比较。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1.大肠杆菌O157：H7菌膜的培养及检测方法
培养基及试剂配方：
LB培养基：每1L含10g蛋白胨，5g酵母粉，10g NaCl，121℃高压灭菌20分钟。
MM培养基：每1L含200mL 5X M9培养液，800mL去离子水，121℃高压灭菌20分钟冷却后加入2mL 1M MgSO4，0.1mL 1M CaCl2，20mL 20％葡萄糖。
5X M9储存液：每1L含64g Na2HPO4·7H2O，15g KH2PO4，2.5g NaCl，5.0g NH4Cl。
1M MgSO4：每1L含246.5g MgSO4·7H2O，过滤除菌。
1M CaCl2：每1L含147.014g CaCl2·2H2O，过滤除菌。
20％葡萄糖溶液：每1L含200g葡萄糖，过滤除菌。
0.2％结晶紫染色液：每100mL超纯水含0.2g结晶紫。
75％乙醇脱色液：25mL去离子水混合75mL无水乙醇。
0.9％NaCl溶液：每1L含9g NaCl，121℃高压灭菌20分钟。
菌膜培养方法：
1.接种大肠杆菌O157：H7至LB培养基中，37℃，200rpm过夜培养至OD600≈0.8-1.0。
2.取无菌96孔聚苯乙烯板，取板中央区域，每孔加100μL菌液，37℃静置培养4小时。
3.倒去菌液，用0.9％NaCl溶液洗板1次。
4.倒去0.9NaCl溶液，加入100μL MM培养基，四周加入1/3孔体积的无菌NaCl溶液封口，37℃静置培养24-96小时。
5.与使用LB培养基的比较。倒去0.9NaCl溶液，加入100μL LB培养基，四周加入1/3孔体积的无菌NaCl溶液封口，37℃静置培养24-96小时。
6.与不使用无菌NaCl溶液封孔的比较。倒去0.9NaCl溶液，加入100μL MM培养基，37℃静置培养24-96小时。
7.与使用全部孔体积的无菌NaCl溶液封孔的比较。倒去0.9NaCl溶液，加入100μL MM培养基，四周加入全部孔体积的无菌NaCl溶液封口，37℃静置培养24-96小时。
菌膜检测方法：
1.倒去菌液，加入200μL去离子水洗板一次，风干。
2.加入100μL 0.2％结晶紫染液染色5分钟。
3.倒去染色液，用温和的水流洗去多余结晶紫染液。
4.用75％乙醇溶液脱色，在595nm处检测吸光度。
实验结果：
比较结果参见图5，使用MM培养基的情况下，经染色后菌膜在595nm处的吸光度可以达到1.521，使用LB培养基，菌膜的吸光度只有1.138，这是因为大肠杆菌O157：H7在营养丰富的LB培养基中正常生长，环境压力较小；在MM培养基中，营养物质主要是无机盐，大肠杆菌O157：H7难以利用，生成菌膜保护自身。
在不使用NaCl封孔的情况下，四周经染色后菌膜在595nm处的吸光度可以达到1.832，使用1/3孔体积NaCl封孔的情况下，菌膜的吸光度可以达到1.521，这是因为没有封孔的情况下，96孔聚苯乙烯版四周水蒸发较快，菌膜面对的环境压力更大，生长情况更好，会影响定量实验结果的准确性。
使用1/3孔体积NaCl封孔和使用全部孔体积NaCl封孔的情况下，由于水更丰富，菌膜的生长会受到微弱抑制。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。