绵羊多头蚴病特异性基因及其分离与鉴定
技术领域
本发明涉及一种绵羊多头蚴病新基因的克隆、表达及初步的免 疫性试验，更具体说，涉及从绵羊多头蚴病总RNA中分离1个新的 基因，利用基因工程的方法在高效大肠杆菌表达系统表达并纯化出 具有免疫原性的重组蛋白，它可有效激起动物机体的免疫反应，其 抗血清可以识别自然虫体(成虫和幼虫)抗原的特异性蛋白。
背景技术
多头蚴病(俗称脑包虫)是由多头绦虫(Multiceps multiceps) 引起的人兽共患寄生虫病。成虫主要寄生于终末宿主家犬的小肠内， 狼、狐等肉食动物也有感染。家畜羊、牛、猪和人等中间宿主误食 虫卵后，卵移行至大脑、延髓、脊髓，发育成包囊，表现中枢神经 受损症状，死亡率为80-100％。人偶有感染，虫体寄生于脑、皮下 肌肉和眼内。此病在西北牧区感染率较高且牛羊并行感染，新疆绵 羊多头蚴病历年的平均发病率为1-2％，死亡率为100％，平均每年因 该病就死亡数十万只羊。新疆局部地区如伊犁地区感染率达5％，塔里 木河南岸垦区感染率达5.7％，哈密地区感染率为4％，在西藏绵羊感 染率高达0.9-22.85％。严重危害人畜健康，对畜牧业生产造成很大 的经济损失。研制有效的疫苗作为预防该病的有力“武器”实属刻 不容缓。
羊绦虫(Taenia ovis)基因工程疫苗(45W)的问世为寄生虫 病疫苗的研制掀开了具有历史意义的篇章。此后，Lightowlers等用 高免六钩蚴的羊血清在细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus) 六钩蚴cDNA文库中筛选获得阳性克隆Eg95，其重组蛋白(16.5KD) 对羊抗细粒棘球绦虫感染的免疫保护可达到96-98％。Charles等从 多房棘球蚴(Echinococcus alveolaris)中获得Eg95的同源基因 EM95，将其重组蛋白运用于小鼠免疫实验，证实EM95的免疫保护率 可达63.1-82.9％。目前国际上已成功研制出羊绦虫、细粒棘球绦虫、 多房棘球绦虫、牛带绦虫(Taenia saginata)、猪带绦虫(Taenia solium)的基因工程疫苗，对中间宿主可产生很高的免疫。有趣的是 不同绦虫的保护性抗原的特异性基因碱基序列具有很大的同源性， 在大肠杆菌中经诱导表达后，重组蛋白的生物学功能也非常相似。 虽然这些保护性重组蛋白的生物功能及其免疫学作用机制有待于进 一步的研究，但这为其它带科绦虫特异性抗原基因的分离提供了理 论依据。
对于多头绦虫特异性基因的分离研究在国内外很少有人涉及。 文献查新显示，目前国际刊物发表的有关多头蚴病的文章仅有72篇， 主要偏重于多头蚴病的流行病学、生化组织形态学、运用分子生物 学手段与其它绦虫进行区别鉴定、分离脂蛋白抗原作为诊断抗原的 研究等方面。我课题组于1991年在国内首次报道利用多头绦虫的六 钩蚴或六钩蚴的分泌代谢抗原免疫绵羊，可以取得85-100％的保护， Verster等也证实了这一点。但这种抗原不可能依靠培养六钩蚴的途 径工业化生产，只能通过重组基因疫苗的方法，关键是寻找保护性 抗原基因，为多头蚴病疫苗的研制奠定基础。
本发明通过对多种绦虫保护性基因的综合分析，设计出多种绦 虫保护性基因共有的引物，运用RT-PCR法，从多头蚴cDNA中扩增 出可能具有保护性的基因片断，将其命名为45m，其长度为698bp， 编码232个氨基酸。这段基因未在genebank中发表，是新发现的多 头蚴病的新基因。经同源性比较得，45m蛋白与羊绦虫的45W蛋白的 同源性为89％，与牛带绦虫保护性抗原的同源性为85％。将45m基因 利用基因工程的方法在高效大肠杆菌表达系统表达并进行纯化，该 重组蛋白可有效激起动物机体的免疫反应，其抗血清可以识别自然 虫体(成虫和幼虫)抗原的特异性蛋白。45m重组蛋白有可能成为候 选疫苗。
发明内容
本发明的目的在于，研究绵羊多头蚴病特异性基因及其分离与 鉴定，通过对畜间多种绦虫病保护性基因的综合分析，设计引物， 用RT-PCR的方法，绵羊多头蚴病的幼虫阶段分离到新基因，将其命 名为45m，其长度为698bp，编码232个氨基酸。这段基因未在 genebank中发表，是新发现的多头蚴病的新基因。该基因和羊绦虫、 牛带绦虫的保护性基因片断具有很高的同源性。所表达的蛋白质分 子量约为6,300道尔顿。将45m克隆到pET41b表达载体中，构建 符合读码框的融合基因，表达量可达100-120mg/L。将该蛋白用于绵 羊的免疫试验中，可有效激起机体的免疫反应，其抗血清可以与成 虫和幼虫抗原总蛋白在63KD处发生特异性反应。
本发明所述的一种绵羊多头蚴病特异性基因及其分离与鉴定，提 供一种序列表中所示的碱基序列，命名为45m基因，其长度为698bp， 其碱基序列为：
TTTTGTTAGCGACTGCAGTTTTGGCTTCGGACTTCGAACAACCCATCGAG
AGGACAGTGACAGGACATCAATCATTACGCGATATCTTCACTTGGGGTCC
TGTGTTCTCTGAGCTCATTGGCCTAAATTGGAATAGGGATGCATTTCATA
ATGCGTACCATGAAGTGCTCACATTAAAGGCAGCGCTGTCTTCTGACCCT
AGTAACACAAAGACAACATATGCGCAACTCGGCGATGGAAGTGCCACTCT
TAAAGGACTGACGTCTAATGCCACATATCTTGTGACTGCGACGGTAAATA
TAAGTGGAAACACAATTCTGGTATTGAGCAGCACTATTCATACACTGGCC
AACGACACGGATCCTATCCAAAACTGCTTCCATTGGGGCCCTGTGACTAA
CCAATCCATTCAAGTAAGTTGGGATCAGCTAGATCCGGAGGACACACACG
ATATGATAGTCACACTGACGGCAGAGATGGCTTCGAACCCCAGTGTGGAA
AGATCGGAGTCTGCACGCTTCAGTCAAGGAAGAGTCACCGTTGACGGACT
GATGTCCGACACACTATATATTGCAACCGTGACAGTATTGAAAGATGGAC
GGCAATTCTTCAATTCCACCAGAGACATTCAAACACTCGATACTGGCCAT
AAGGAAGTAACAGTCGTAACGACTAGTGGATCTGCTATAGTCTCCGCA
提供一种序列表中所示碱基序列编码的232个氨基酸，其氨基酸 序列为：
LLATAVLASDFEQPIERTVTGHQSLRDIFTWGPVFSELIGLNWNRDAFHN
AYHEVLTLKAALSSDPSNTKTTYAQLGDGSATLKGLTSNATYLVTATVNI
SGNTILVLSSTIHTLANDTDPIQNCFHWGPVTNQSIQVSWDQLDPEDTHD
MIVTLTAEMASNPSVERSESARFSQGRVTVDGLMSDTLYIATVTVLKDGR
QFFNSTRDIQTLDTGHKEVTVVTTSGSAIVSA
提供一种重组载体，该载体包括一种核苷酸序列。
重组载体是以谷胱甘肽转移酶为融合伴体，并有6个His的亲和 标记位点的高效表达载体pET-41b。
提供一种含有重组载体的原核细菌。
原核细菌是大肠杆菌。
提供一种用作引物的DNA片断，该片断由核苷酸序列的一部分 序列组成。上下游引物分别为：
上游引物：5′GGAATTCTGCCTCATTTTGTTAGCGACTGCAGT3′，
下游引物：5′TGCGGAGACTATAGCAGATCCACTAGTC3′。
本发明所述的绵羊多头蚴病特异性基因及其分离与鉴定，采用 (1)用RT-PCR的方法，从多头绦虫的多头蚴阶段虫体的总RNA中分 离到1个新的基因，此基因同羊绦虫和牛带绦虫的保护性基因具有很 高的同源性；(2)利用基因工程的方法，在高效大肠杆菌表达系统 表达重组蛋白并进行纯化；(3)通过绵羊的动物免疫试验，表明该 重组蛋白可有效激起动物机体的免疫反应，其抗血清还可以识别成虫 和幼虫抗原，为进一步进行该病的疫苗研究奠定基础。
本发明所选择的绵羊多头蚴病的多头蚴采自新疆巴音郭楞蒙古 自治州种畜场。首先解剖患病羊的脑部，分离到寄生于脑部的包囊， 从囊腔和囊壁获得多头蚴，然后提取总RNA，通过多羊绦虫(45W)、 细粒棘球绦虫(Eg95)、牛带绦虫保护性基因的保守序列的综合分析， 设计引物，运用RT-PCR方法，扩增得到目的条带(图3)，将得到的 目的条带连接到pGEM-T载体，并转化到JM109中，进行蓝白斑筛选 挑选重组克隆。经基因测序获得1个新的基因，命名为45m。通过基 因工程方法表达出重组蛋白。新基因编码232个氨基酸，分子量为 63KD。
本发明通过设计一对引物，将新基因45m用PCR方法从pGEM-T 载体中扩增出来，克隆到原核表达载体pET-41b上，构建成表达质粒 并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。通过对大肠杆菌培养时间、诱导 时间、温度等条件的摸索和优化，45m融合蛋白表达量可达100mg/L。
本发明获得的45m重组蛋白可激起绵羊机体很强的免疫反应， ELISA检测效果(图7)。Western-blot试验结果表明，经四次免疫后 的绵羊的抗血清可以与成虫和幼虫的虫体总蛋白在63KD处发生特异 性反应(图8)，这表明45m重组蛋白是具有免疫原性的。
多头蚴病的45m基因是首次发现，45m蛋白与羊绦虫的45W蛋白、 牛带绦虫保护性抗原有很高的同源性。经中间宿主绵羊的免疫试验证 实，45m重组蛋白可有效激起机体的免疫应答，其抗血清可以与成虫 和幼虫抗原总蛋白在63KD处发生特异性反应。认为该基因有可能成 为多头蚴病的候选疫苗分子。
附图说明
图1为本发明45m基因的碱基序列图
图2为本发明45m基因的氨基酸序列图
图3为本发明运用RT-PCR方法从多头蚴cDNA中扩增得到目的 片断(698bp)
图4为本发明45m重组蛋白与羊绦虫的45W蛋白、牛带绦虫(Ts) 和羊绦虫(To)的保护性抗原蛋白的氨基酸序列进行同源性对比分析。 45m蛋白与羊绦虫的45W蛋白的同源性为89％，与牛带绦虫(Ts)保护 性抗原的同源性为85％，与羊绦虫(To)的保护性抗原的同源性为81％。
图5为本发明45m重组蛋白的诱导表达(1、IPTG诱导前大肠杆 菌菌液的SDS-PAGE电泳图；2、经IPTG诱导4小时后大肠杆菌菌液裂 解液的SDS-PAGE电泳图。)
图6为本发明45m重组蛋白的纯化(采用亲和层析柱TALON进 行纯化，将45m重组蛋白的纯化产物做SDS-PAGE电泳。)
图7为本发明用ELISA法检测45m重组蛋白免疫绵羊后特异性 抗体的变化图(横坐标为第一次免疫后的周数，纵坐标为OD405读值， 45m表示用45m重组蛋白免疫绵羊的免疫组，GST表示用pET41b空载 体接种绵羊的对照组，PBS表示用PBS接种绵羊的空白对照组。)
图8为本发明45m重组蛋白免疫绵羊后抗血清可以与成虫和幼 虫的虫体总蛋白在63KD处发生特异性反应(1、2、3分别为多头蚴 虫体总蛋白、多头绦虫虫体总蛋白、45重组蛋白的SDS-PAGE电泳图； 4、5、6分别为45m重组蛋白免疫绵羊后抗血清与多头绦虫虫体蛋白、 多头绦虫虫体蛋白、45重组蛋白进行的Western-blot反应，在63KD处 发生特异性结合)
具体实施方式
实施例1
一、多头绦虫的多头蚴阶段虫体的获取
采集患病绵羊脑部寄生的包囊，小心分离获得附着在囊壁和悬浮 在囊液中的多头蚴，将收集到的虫体沉淀用灭菌的PBS冲洗10遍，存 于液氮中备用。
二、多头蚴的总RNA的提取和RT-PCR扩增
用Trizol试剂(Gibco)提取多头蚴的总RNA；获得多头蚴的总 RNA，浓度测定为300ng/μl，经1％甲醛变性胶电泳检测可见清晰的18s 和28s两条带，表明总 RNA完整性良好。取3μg RNA用 SUPERSCRIPTTM反转录酶系统(Invitrogen)进行反转录以合成 cDNA第一链，得到20ul cDNA第一链产物。
引物设计依据对羊绦虫的45W蛋白、细粒棘球绦虫(Eg95)、牛 带绦虫保护性基因等基因的保守序列的综合分析，用Oligo引物设计 软件设计出上下游引物：
上游引物(A1)：5′GGAATTCTGCCTCATTTTGTTAGCGACTGCAGT3′，
下游引物(A2)：5′TGCGGAGACTATAGCAGATCCACTAGTC3′。
每50ul PCR反应体积加入1ul cDNA单链作为模板，PCR扩增试 剂与条件如下：
10x Taq DNA聚合酶缓冲液 5μl
模板cDNA 1μl
A1上游引物(1.25μg/μl) 1μl
A2下游引物(1.25μg/μl) 1μl
脱氧核苷酸混合物dNTP(2.5mM) 1μl
Taq DNA聚合酶 0.5μl
灭菌水 37.5μl
总体积 50μl
PCR反应条件为：首先94℃变性2分钟，然后进入下列循环：94℃ 1分钟，50℃ 1分钟，72℃ 1分钟30秒，共进行37个循环，最后72℃延 伸7分钟。
电泳检测，发现在700附近出现预期的特异性条带(图3)，回收 此带。
三、45m基因序列的测定和分析
将回收的电泳产物连接到pGEM-T载体(Promega公司)，转化 到JM109菌中，经蓝白斑筛选，挑出10个克隆，进行重组克隆的序列 测定，其碱基序列均一致，序列如下：
45m基因的碱基序列：
TTTTGTTAGCGACTGCAGTTTTGGCTTCGGACTTCGAACAACCCATCGAG
AGGACAGTGACAGGACATCAATCATTACGCGATATCTTCACTTGGGGTCC
TGTGTTCTCTGAGCTCATTGGCCTAAATTGGAATAGGGATGCATTTCATA
ATGCGTACCATGAAGTGCTCACATTAAAGGCAGCGCTGTCTTCTGACCCT
AGTAACACAAAGACAACATATGCGCAACTCGGCGATGGAAGTGCCACTCT
TAAAGGACTGACGTCTAATGCCACATATCTTGTGACTGCGACGGTAAATA
TAAGTGGAAACACAATTCTGGTATTGAGCAGCACTATTCATACACTGGCC
AACGACACGGATCCTATCCAAAACTGCTTCCATTGGGGCCCTGTGACTAA
CCAATCCATTCAAGTAAGTTGGGATCAGCTAGATCCGGAGGACACACACG
ATATGATAGTCACACTGACGGCAGAGATGGCTTCGAACCCCAGTGTGGAA
AGATCGGAGTCTGCACGCTTCAGTCAAGGAAGAGTCACCGTTGACGGACT
GATGTCCGACACACTATATATTGCAACCGTGACAGTATTGAAAGATGGAC
GGCAATTCTTCAATTCCACCAGAGACATTCAAACACTCGATACTGGCCAT
AAGGAAGTAACAGTCGTAACGACTAGTGGATCTGCTATAGTCTCCGCA
用Sequence Utilities程序(http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/)寻 找其编码区，结果如下：
DNA：TTTTGTTAGCGACTGCAGTTTTGGCTTCGGACTTCGAACAACCCATCGAGA
+3： L L A T A V L A S D F E Q P I E R
DNA：GGACAGTGACAGGACATCAATCATTACGCGATATCTTCACTTGGGGTCCTG
+3： T V T G H Q S L R D I F T W G P V
DNA：TGTTCTCTGAGCTCATTGGCCTAAATTGGAATAGGGATGCATTTCATAATG
+3： F S E L I G L N W N R D A F H N A
DNA：CGTACCATGAAGTGCTCACATTAAAGGCAGCGCTGTCTTCTGACCCTAGTA
+3： Y H E V L T L K A A L S S D P S N
DNA：ACACAAAGACAACATATGCGCAACTCGGCGATGGAAGTGCCACTCTTAAAG
+3： T K T T Y A Q L G D G S A T L K G
DNA：GACTGACGTCTAATGCCACATATCTTGTGACTGCGACGGTAAATATAAGTG
+3： L T S N A T Y L V T A T V N I S G
DNA：GAAACACAATTCTGGTATTGAGCAGCACTATTCATACACTGGCCAACGACA
+3： N T I L V L S S T I H T L A N D T
DNA：CGGATCCTATCCAAAACTGCTTCCATTGGGGCCCTGTGACTAACCAATCCA
+3： D P I Q N C F H W G P V T N Q S I
DNA：TTCAAGTAAGTTGGGATCAGCTAGATCCGGAGGACACACACGATATGATAG
+3： Q V S W D Q L D P E D T H D M I V
DNA：TCACACTGACGGCAGAGATGGCTTCGAACCCCAGTGTGGAAAGATCGGAGT
+3： T L T A E M A S N P S V E R S E S
DNA：CTGCACGCTTCAGTCAAGGAAGAGTCACCGTTGACGGACTGATGTCCGACA
+3： A R F S Q G R V T V D G L M S D T
DNA：CACTATATATTGCAACCGTGACAGTATTGAAAGATGGACGGCAATTCTTCA
+3： L Y I A T V T V L K D G R Q F F N
DNA：ATTCCACCAGAGACATTCAAACACTCGATACTGGCCATAAGGAAGTAACAG
+3： S T R D I Q T L D T G H K E V T V
DNA：TCGTAACGACTAGTGGATCTGCTATAGTCTCCGCA
+3： V T T S G S A I V S A
45m氨基酸序列为：
LLATAVLASDFEQPIERTVTGHQSLRDIFTWGPVFSELIGLNWNRDAFHN
AYHEVLTLKAALSSDPSNTKTTYAQLGDGSATLKGLTSNATYLVTATVNI
SGNTILVLSSTIHTLANDTDPIQNCFHWGPVTNQSIQVSWDQLDPEDTHD
MIVTLTAEMASNPSVERSESARFSQGRVTVDGLMSDTLYIATVTVLKDGR
QFFNSTRDIQTLDTGHKEVTVVTTSGSAIVSA
对该序列进行蛋白家族分析，应用protein-protein BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)程序进行基因的蛋白家族进行分析， 其中与其同源性最高的三个蛋白例举如下：
gi|2114399|gb|AAC47532.1|45W antigen ToW5/7[Taenia ovis]Length＝254 Score＝355 bits(911)，Expect＝1e-96，Method：Composition-based stats.
Identities＝194/232(83％)，Positives＝207/232(89％)，Gaps＝0/232(0％) gi|39837079|emb|CAE83579.1|host-protective antigen homologue[Taenia saginata]
Length＝255 Score＝324 bits(831)，Expect＝2e-87，Method：
Composition-based stats.
Identities＝177/233(75％)，Positives＝200/233(85％)，Gaps＝1/233(0％) gi|683737|gb|AAC46949.1|host-protective antigen(Taenia ovis) Score＝308bits(789)，Expect＝1e-82，Method：Composition-based stats.
Identities＝168/232(72％)，Positives＝190/232(81％)，Gaps＝0/232(0％)
将上述三个蛋白羊绦虫45W蛋白、牛带绦虫保护性抗原、羊绦虫 保护性抗原与45m重组蛋白进行对比分析(图4)。45m蛋白与三者的 同源性分别为89％，85％和81％，表明45m蛋白很可能与这三个保护 性蛋白一样是具有个体特异性的保护性蛋白。
四、45m基因表达质粒的构建
依据45m基因的两端序列合成一对引物，上游引物含EcoRI酶切 位点，下游引物含XhoI酶切位点。
上游引物(B1)：5′G GAATTCCTTTTGTTAGCGACTGCAGTTTTG3′ EcoRI
下游引物(B2)：5′G CTCGAGTAGTGGATCTGCTATAGTCTCCGCA3′ XhoI
以含45m基因的pGEM-T的质粒为模板，B1，B2为引物PCR 扩增，得到特异性扩增的单一条带，产物大小约在700bp的位置。 将PCR扩增产物克隆到原核表达载体pET-41b上，①用EcoRI和 XhoI酶切pET-41b载体(Novagen)；②用T4 DNA连接酶(Promega) 将目的基因45m插入pET-41b表达载体；③将含45m基因的质粒转 化入BL21(DE3)大肠杆菌中(Novagen)，铺板培养；④提取转 化后大肠杆菌的质粒(QIAGEN)，融合的表达载体中外源基因经双 酶切和测序鉴定正确。
五、45m重组融合蛋白的表达和纯化
将pET41b-45m融合蛋白转化到大肠杆菌BL21后，进行蛋白的诱 导表达。超声裂解基因工程菌上清液经SDS-PAGE电泳分析表明，菌 体经诱导后有明显的特异表达产物带，分子量与用软件PROTEIN ANALYSIS预测的理论值63KD相符(图5)。
经过对培养时间，诱导浓度，温度等条件的摸索，菌体扩大培养 不同时间后诱导表达量的比较，基因工程菌的培养条件为：接单菌落 于50ml卡那抗性LB培养基中，37℃，250rpm培养过夜，取过夜培养 物20ml接种于2L的卡那抗性LB培养基中，37℃，250rpm培养至 OD600＝0.6，加入IPTG至终浓度为1mM，继续37℃，250rpm诱导培 养4小时后离心收获菌体。经SDS-PAGE电泳分析表明，在此条件下 45m融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的80％以上(图5)。
采用亲和层析柱TALON(Clontech)纯化表达蛋白，将纯化产物 做SDS-PAGE电泳(图6)，可获得较纯的重组蛋白。将重组蛋白大 肠杆菌培养液的量与最终获得纯化蛋白的量进行比较分析得，该45m 重组蛋白的表达量为110mg/L培养液。具有较理想的重组蛋白产量。
使用效果
动物免疫试验
一、45m重组蛋白用于中间宿主(绵羊)的免疫接种
分四次将纯化的45m重组蛋白免疫接种绵羊，接种剂量为50μg/ 只，0.5ml/只；第一次免疫使用弗氏完全佐剂，第二、三、四次免疫 均使用弗氏不完全佐剂途；第一次免疫途径为皮下接种，第二、三、 四次免疫途径均为腹腔接种；第一次和第二次免疫间隔时间为三周， 第二、三、四次免疫间隔时间均为二周；每周定期采集试验绵羊的血 清，4℃储存备用。
二、对定期采集到的血清进行ELISA和Western-blot检测试验
1、酶链免疫吸附实验(ELISA)检测
用45m重组蛋白作为包被抗原，10ng/孔包板；将自第一次免疫 后0-24周的绵羊血清稀释至1∶2400作为工作浓度；使用二抗为辣 根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗羊IgG；使用ABST(2，2′ -azino-bis(3-ethylbenz-thiazoline-6-sulfonic))显色，室温作用约10min， 观察结果时以样品孔(双孔平均)与参考阴性血清(双孔平均)的光 密度OD405比值等于或大于3(P/N≥3，N＝0.1)为阳性，反之为阴性。 记录读值，并做抗体水平消涨图(图7)。结果表明，45m重组蛋白 可有效激起中间宿主绵羊的体液免疫反应，产生高滴度抗血清。
2、免疫印迹实验(Western-blot)检测
提取多头绦虫(成虫)和多头蚴(幼虫)虫体粗抗原：将虫体 反复冻融、研磨三次后，10,000rpm 4℃离心20分钟，收集上清。 将成虫抗原、幼虫抗原和45m重组蛋白做SDS-PAGE电泳；将三种 蛋白从凝胶转移至NC膜上；经5％的脱脂奶粉封闭后；与1∶100的 绵羊血清反应；并与辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗羊IgG结合； 使用4-氯-1-奈酚(4-chloro-l-naphthol)(Sigma)显色1-5分钟。在三种 抗原的63KD处均出现反应条带(图8)。Western-blot结果表明45m 基因是自然存在于多头蚴(幼虫)和多头绦虫(成虫)中的，同时 45m重组蛋白具有良好的免疫原性，并进一步验证了其引起机体免疫 反应的能力。
TTTTGTTAGCGACTGCAGTTTTGGCTTCGGACTTCGAACAACCCATCGAG
AGGACAGTGACAGGACATCAATCATTACGCGATATCTTCACTTGGGGTCC
TGTGTTCTCTGAGCTCATTGGCCTAAATTGGAATAGGGATGCATTTCATA
ATGCGTACCATGAAGTGCTCACATTAAAGGCAGCGCTGTCTTCTGACCCT
AGTAACACAAAGACAACATATGCGCAACTCGGCGATGGAAGTGCCACTCT
TAAAGGACTGACGTCTAATGCCACATATCTTGTGACTGCGACGGTAAATA
TAAGTGGAAACACAATTCTGGTATTGAGCAGCACTATTCATACACTGGCC
AACGACACGGATCCTATCCAAAACTGCTTCCATTGGGGCCCTGTGACTAA
CCAATCCATTCAAGTAAGTTGGGATCAGCTAGATCCGGAGGACACACACG
ATATGATAGTCACACTGACGGCAGAGATGGCTTCGAACCCCAGTGTGGAA
AGATCGGAGTCTGCACGCTTCAGTCAAGGAAGAGTCACCGTTGACGGACT
GATGTCCGACACACTATATATTGCAACCGTGACAGTATTGAAAGATGGAC
GGCAATTCTTCAATTCCACCAGAGACATTCAAACACTCGATACTGGCCAT
AAGGAAGTAACAGTCGTAACGACTAGTGGATCTGCTATAGTCTCCGCA