《一种产衣康酸的重组酵母菌株及其构建方法与应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种产衣康酸的重组酵母菌株及其构建方法与应用.pdf（8页完整版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710080169.6 (22)申请日 2017.02.15 (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大 道1800号 (72)发明人 诸葛斌赵美琳陆信曜宗红 宋健许乔 (51)Int.Cl. C12N 1/19(2006.01) C12N 15/81(2006.01) C12N 9/88(2006.01) C12P 7/44(2006.01) C12R 1/72(2006.01) (54)发明名称 一种产衣康酸的重组酵母菌株及其构建方 法与应用。
2、 (57)摘要 本发明公开了一种产衣康酸的重组酵母菌 株及其构建方法与应用。 所述重组酵母菌以 C .g l y c e r o l g e n e s i s 为 出 发 菌 株 ， 在 C.glycerolgenesis基因组中插入顺乌头酸脱羧 酶基因得到的重组酵母菌株。 通过基因工程改造 构建含顺乌头酸脱羧酶基因表达盒Pgap-CadA- Tgap-zeocin的重组质粒， 将其线性化后插入 C.glycerolgenesis基因组中表达顺乌头酸脱羧 酶催化顺乌头酸获得衣康酸。 本发明提供的重组 酵母菌株能够合成衣康酸， 为衣康酸生产提供了 新思路。 权利要求书1页 说明书3页 序列表1。
3、页 附图2页 CN 107058144 A 2017.08.18 CN 107058144 A 1.一种产衣康酸的重组酵母菌株， 其特征在于： 所述重组酵母菌以C.glycerolgenesis CCTCC AB 204047为出发菌株， 通过基因工程改造在C.glycerolgenesis基因组中插入顺乌 头酸脱羧酶基因表达盒Pgap-CadA-Tgap-zeocin得到的重组酵母菌株。 2.根据权利1所述的重组酵母菌株， 其特征在于所述的顺乌头酸脱羧酶表达盒Pgap- CadA-Tgap-zeocin由土曲霉顺乌头酸脱羧酶基因， C.glycerolgenesis甘油醛-3-磷酸脱氢 酶基。
4、因启动子和终止子， 博来霉素zeocin基因、 启动子和终止子组成。 3.根据权利1至2所述的重组酵母菌株， 其特征在于： 所述土曲霉顺乌头酸脱羧酶基因 编码a的蛋白质： a、 由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。 4.根据权利1至2所述的重组酵母菌株， 其特征在于： 所述C.glycerolgenesis甘油醛- 3-磷酸脱氢酶基因启动子和终止子分别被连接至编码顺乌头酸脱羧酶的核苷酸序列两端， 分别启动和终止顺乌头酸脱羧酶基因的转录。 5.根据权利1至2所述的重组酵母菌株， 其特征在于： 所述博来霉素zeocin作为表达盒 中的抗性筛选标记， 该基因的启动子和终止子分别连接。
5、在基因序列的两端， 分别启动和终 止基因的转录。 6.根据权利要求1至5所述产衣康酸的重组酵母菌株的构建方法， 其特征在于： 通过基 因工程改造构建含顺乌头酸脱羧酶表达盒的重组质粒， 重组质粒线性化后将其插入 C.glycerolgenesis基因组中得到含顺乌头酸脱羧酶表达盒的重组酵母菌株。 7.根据权利要求1至6所述的重组酵母菌株在制备衣康酸中的应用， 其特征在于： 将所 述的重组酵母菌培养于发酵培养基； 以及收集该培养基以分离衣康酸。 8.根据权利要求7所述的重组酵母菌株在制备衣康酸中的应用， 其特征在于： 所述发酵 培养基为： 50g/L葡萄糖， 10g/L酵母粉， 20g/L蛋白胨，。
6、 zeocin 150 g/mL， 余量为水。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107058144 A 2 一种产衣康酸的重组酵母菌株及其构建方法与应用 技术领域 0001 本发明涉及一种产衣康酸的重组酵母菌株及其构建方法与应用， 属于基因工程领 域。 背景技术 0002 衣康酸是一种重要的化工产品， 是美国能源部认证为的十二个重要高附加值化学 品之一， 主要用于生产树脂、 塑料、 橡胶、 合成纤维、 表面活性剂等。 衣康酸多聚体也可以用 替代原有添加剂丙烯酸。 此外， 有研究发现在哺乳动物免疫细胞中衣康酸可以作为一种抗 菌物质起作用。 0003 目前， 衣康酸的生产菌株主要是土曲霉。 在土。
7、曲霉中衣康酸的代谢途径是由TCA循 环分流出来的 ， TCA循环中的顺乌头酸在顺乌头酸脱羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase,CAD)的作用下转化成衣康酸(Dwiarti,L.,Yamane,K.,Yamatani,H., Kahar,P.,Okabe,M.,2002.Purification and characterization of cis-aconitic acid decarboxylase from Aspergillus terreus TN484-M1.J.Biosci.Bioeng.94,2933； Kanamasa ,S.,Dwiarti,。
8、L.,Okabe,M.,Park,E.Y.,2008.Cloning and functional characterization of the cis-aconitic acid decarboxylase(CAD)gene from Aspergillus terreus.Appl.Microbiol.Biotechnol.80,223-229)， 顺乌头酸脱羧酶CAD是 衣康酸生物合成途径中的关键酶。 然而， 在衣康酸合成过程中， 土曲霉生长缓慢， 发酵周期 长； 发酵过程中需要连续曝气和高速搅拌来满足菌体生长对溶氧的需求， 但高速搅拌产生 的机械压力又会使得菌丝受损而影响菌体生长。 。
9、土曲霉的这些缺点使得亟要寻求一种新的 宿主来生产衣康酸。 0004 产甘油假丝酵母(C.glycerolgenesis CCTCC AB 204047)是我国拥有自主知识产 权的一株具有优良发酵性能的工业菌株， 生长速度快， 能在55葡萄糖或15Nacl的高渗 透压培养基上正常生长繁殖， 具有耐高渗和高抗逆性的特点， 对衣康酸有较强耐受性。 发明内容 0005 本发明目的在于提供一种产衣康酸的重组酵母菌株及其构建方法与应用。 0006 为了实现上述目的， 本发明采用的技术方案为： 0007 一种产衣康酸的重组酵母菌株， 所述菌株以C.glycerolgenesis CCTCC AB204047。
10、 为出发菌株， 通过基因工程改造在C.glycerolgenesis基因组中插入顺乌头酸脱羧酶表达 盒Pgap-CadA-Tgap-zeocin得到的重组酵母菌株。 0008 本发明中所述顺乌头酸脱羧酶表达盒Pgap-CadA-Tgap-zeocin包括能够在宿主细 胞中表达SEQ ID NO.1所示的顺乌头酸脱羧酶的DNA， 启动所述顺乌头酸脱羧酶基因转录的 C.glycerolgenesis甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子， 终止顺乌头酸脱羧酶基因转录的 C.glycerolgenesis甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因终止子， 还包括表达博来霉素的DNA， 该DNA 包括启动和终止所述博来霉素。
11、基因转录的启动子和终止子。 说明书 1/3 页 3 CN 107058144 A 3 0009 产衣康酸的重组酵母菌株的构建方法， 通过基因工程构建含顺乌头酸脱羧酶表达 盒Pgap-CadA-Tgap-zeocin的重组质粒， 重组质粒线性化后将其插入C.glycerolgenesis基 因组中得到重组酵母菌株。 0010 产衣康酸的重组酵母菌株在制备衣康酸中的应用， 将所述的重组酵母菌株培养于 发酵培养基中， 所述发酵培养基为： 50g/L葡萄糖， 10g/L酵母粉， 20g/L蛋白胨， zeocin 150 g/mL， 余量为水。 0011 本发明所具有的优点： 本发明提供的通过基因工程改。
12、造使产甘油假丝酵母合成衣 康酸的方法， 目的明确， 可操作性强。 提供的重组酵母菌株衣康酸发酵产量普遍高于其他酵 母重组菌株(Blazeck J ,Miller J ,Pan A ,et al .Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for itaconic acid production .J .Applied Microbiology and Biotechnology,2014,98(19):8155-64； Blazeck J,Hill A,Jamoussi M,et al.Metabolic engineering of 。
13、Yarrowia lipolytica for itaconic acid production.J.Metabolic Engineering,2015,32:66-73.)， 而且菌株本身具有优良发酵 性能， 并对衣康酸有较强的耐受性， 具有很强的应用价值， 可以作为潜在的衣康酸生产菌 株。 附图说明 0012 图1为背景技术中提到的土曲霉中衣康酸的相关代谢途径。 0013 图2为本发明实施例提供的载体pCadA-T质粒图谱， 其中CadA为顺乌头酸脱羧酶基 因。 0014 图3为本发明实施例提供的载体pURGAPZ质粒图谱， Pgap为产甘油假丝酵母甘油 醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子， 。
14、Tgap为C.glycerolgenesis甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因终止 子， ZEOCIN由Pzeocin、 zeocin和Tzeocin组成。 0015 图4为本发明实施例提供的载体pURGAPZC质粒图谱。 0016 图5为重组酵母菌株发酵合成衣康酸的过程曲线。 具体实施方式 0017 下面通过实施例对本发明进一步详细描述。 0018 实施例1顺乌头酸脱羧酶基因cadA表达盒的构建 0019 1.1土曲霉顺乌头酸脱羧酶基因的克隆 0020 本发明所使用的土曲霉CICC 40205菌株来自中国工业微生物菌株保藏管中心。 根 据 土 曲 霉 F G S C A 1 1 5 6 基 因 组 。
15、数 据 库 公 布 的 信 息 设 计 引 物 c a d A - F ( 5- AAGGGATCCATGACCAAACAATCTGCGGAC-3 )和cadA-R(5 -CGAGGTACCTTATACCAGTGGCGATTTCA- 3 )， 以土曲霉CICC 40205的cDNA为模板扩增顺乌头酸脱羧酶基因， 经1.0琼脂糖凝胶电 泳检测目的片段长度约为1.5kb， 目的产物割胶回收纯化后与pMD19-T连接， 获得含cadA基 因序列的重组质粒pCadA-T。 将pCadA-T进行测序， 测序结果显示克隆的DNA片段为土曲霉顺 乌头酸脱羧酶基因。 与土曲霉FGSC A1156已公布的序列同。
16、源性为100。 0021 1.2目的基因cadA表达载体构建 0022 提取质粒pCadA-T和质粒pURGAPZ(实验室已构建好)， 分别用BamHI和KpnI进行酶 说明书 2/3 页 4 CN 107058144 A 4 切， 并进行割胶回收纯化， 其中pCadA-T的酶切产物回收大小约为1.5kb的cadA基因条带， pURGAPZ的酶切产物回收大小约为6.2kb的目的条带。 将回收片段进行连接， 获得含Pgap- CadA-Tgap-zeocin表达盒的重组质粒pURGAPZC。 0023 实例2制备含有Pgap-CadA-Tgap-zeocin表达盒的重组酵母菌株 0024 2.1。
17、含有Pgap-CadA-Tgap-zeocin表达盒的重组酵母菌株获得 0025 1)提取重组质粒pURGAPZC， HindIII酶切线性化。 0026 2)挑取1环产甘油假丝酵母菌株接入种子培养基(酵母粉10g/L， 蛋白胨20g/L， 葡 萄糖20g/L， zeocin 150 g/mL， 余量为水)中， 在30， 200r/min条件下， 振荡培养18h， 得到 液态种子。 将得到的液态种子按1(v/v)的接种量接入种子培养基中， 装液量为10mL/ 100mL， 控制发酵温度为30， 转速为200r/min， 培养直至OD600为1。 取1mL菌夜， 离心收集菌 体， 弃上清液， 细。
18、胞重新悬浮在1mL无菌水中， 离心洗涤2次； 按下列顺序加入 “转化Buffer” ： 240 L PEG， 36 L 1.0mol/L LiAc， 50 L线性化片段， 加水补足至360 L； 充分混匀后， 42水 浴1h； 离心收集菌体， 重悬于1mL液体YEPD中， 30200r/min震荡培养2h； 离心收集菌体， 1M 山梨醇淸洗2次； 取100 L细胞悬浮液涂布于zeocin筛选平板， 于30培养23d， 获得转化 子。 0027 2.2含有Pgap-CadA-Tgap-zeocin表达盒的重组酵母菌株基因型验证 0028 从筛选平板上挑取转化子在YEPD平板上划线纯化， 30培养。
19、18h。 挑取单菌落接种 于种子培养基中， 在30， 200r/min条件下， 振荡培养18h， 收集菌体提取基因组， 以GAP-F (5 -ATAGGGCCCCACCACAGCAGCACCAAC-3 )和ura5-R(5 -CCGCGGATCTCGAGTGAACACCATTGT ACCAATG-3 )为引物， 进行PCR扩增重组酵母菌中的Pgap-CadA-Tgap-zeocin表达盒。 经 0.8琼脂糖凝胶电泳结果显示， 挑选的转化子中能检测到约为4.2kb的目的片段， 以出发 菌株基因组DNA模板作为阴性对照， 没有扩增到DNA片段。 因此， 能证明转化子中成功整合了 Pgap-CadA。
20、-Tgap-zeocin表达盒， 即所需的重组酵母菌株。 0029 实例3重组酵母菌株生产衣康酸 0030 1)配制种子培养基： 葡萄糖20g/L， 酵母粉10g/L， 蛋白胨5g/L， zeocin 150 g/mL， 余量为水； 衣康酸发酵培养基： 葡萄糖50g/L， 酵母粉10g/L， 蛋白胨20g/L， zeocin 150 g/ mL， 余量为水。 0031 2)将上述所得重组酵母菌株接种于种子培养基中， 在30， 200r/min条件下， 振荡 培养18h， 得到液态种子。 将得到的液态种子按4(v/v)的接种量接入发酵培养基中， 装液 30mL/250mL， 控制发酵温度为30，。
21、 转速为200r/min， 时间为48h， 发酵结束。 0032 发酵液中衣康酸的含量采用高效液相色谱(HPLC)进行检测。 仪器： Agilent高效液 相色谱仪(配紫外可见检测器、 示差检测器和工作站)； 色谱柱： Bio-RAD Aminex HPX-87H column 300mm7.8mm； 流动相： 5mmol/L硫酸； 流速： 0.6mL/min， 柱温： 60， 紫外检测器 (210nm)， 进样10 L。 0033 发酵结束后所得的发酵液进行衣康酸含量的检测， 经过HPLC分析， 发酵液中衣康 酸的浓度约为200mg/L。 0034 以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明， 。
22、而依据本发明的技术方案所作的任 何等效变换均应属于本发明的保护范围。 说明书 3/3 页 5 CN 107058144 A 5 SEQ ID NO.1 MTKQSADSNAKSGVTSEICHWASNLATDDIPSDVLERAKYLILDGIACAWVGARVPWSEKYVQATMSFEPPGA CRVIGYGQKLGPVAAAMTNSAFIQATELDDYHSEAPLHSASIVLPAVFAASEVLAEQGKTISGIDVILAAIVGFESG PRIGKAIYGSDLLNNGWHCGAVYGAPAGALATGKLLGLTPDSMEDALGIACTQACGLMSAQYGGMVKRVQHG。
23、FAARN GLLGGLLAHGGYEAMKGVLERSYGGFLKMFTKGNGREPPYKEEEVVAGLGSFWHTFTIRIKLYACCGLVHGPVEAIE NLQGRYPELLNRANLSNIRHVHVQLSTASNSHCGWIPEERPISSIAGQMSVAYILAVQLVDQQCLLSQFSEFDDNLE RPEVWDLARKVTSSQSEEFDQDGNCLSAGRVRIEFNDGSSITESVEKPLGVKEPMPNERILHKYRTLAGSVTDESRV KEIEDLVLGLDRLTDISPLLELLNCPVKSPLV 序列表 1/1 页 6 CN 107058144 A 6 图1 图2 说明书附图 1/2 页 7 CN 107058144 A 7 图3 图4 图5 说明书附图 2/2 页 8 CN 107058144 A 8 。