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一种应用于燃料油中含硫杂环化合物脱硫的分枝杆菌及其用途.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101134944 B (45)授权公告日 2012.06.06 CN 101134944 B *CN101134944B* (21)申请号 200710068080.4 (22)申请日 2007.04.20 1817 2006.09.18 C12N 1/20(2006.01) C10G 32/00(2006.01) C12R 1/32(2006.01) (73)专利权人浙江大学地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路 38 号 (72)发明人李伟陈晗张文娟蔡郁蓓 (74)专利代理机构杭州天勤知识产权代理有限公司 33224 代理人胡红娟 CN 。

2、1544581 A,2004.11.10, 全文 . CN 1379084 A,2002.11.13, 全文 . 蔡郁蓓 . 新分离菌株对燃料油中有机硫的代谢途径及脱硫特性研究 . 浙江大学硕士学位论文 .2006, 全文，具体参见参见摘要第 1-4 段、第 44 页第（2）、（4）段 . (54) 发明名称一种应用于燃料油中含硫杂环化合物脱硫的分枝杆菌及其用途 (57) 摘要本发明公开了一种应用于燃料油中含硫杂环化合物脱硫的细菌菌株。该菌株经鉴定命名为分枝杆菌 (Mycobacterium sp.)ZD-19，保藏号为： CGMCC NO.1817。本发明还公开。

3、了该菌株在对含硫杂环化合物的燃料油中进行专一性脱硫的用途，以此菌株为催化剂，采用生物脱硫技术，降解燃料油中的含硫杂环化合物，对二苯并噻吩及其衍生物 4， 6- 二甲基二苯并噻吩的降解过程遵循独特的 “扩展 4S 途径” ，能将传统 “4S 途径” 的产物 2- 羟基联苯及 3， 3 - 二甲基 -2- 羟基联苯进一步甲氧基化，生成最终产物2-甲氧基联苯及3， 3 -二甲基-2-甲氧基联苯，有效地减弱了产物抑制。该菌株用于燃料油中的生物脱硫，性能优越，具有工业应用前景。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件审查员丁海权利要求书 1。

4、页说明书 4 页附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利权利要求书 1 页说明书 4 页附图 5 页 1/1 页 2 1. 一种应用于燃料油中含硫杂环化合物脱硫的分支杆菌 (Mycobacterium sp.)ZD-19 菌种保藏号为： CGMCC NO.1817。 2. 根据权利 1 所述的分支杆菌 (Mycobacterium sp.)ZD-19，其特征在于：该菌属分支杆菌属，菌落形状呈圆形，直径 1 2mm ；细胞呈球状， 0.5 1.0m ；无芽孢，无夹膜；革兰氏阳性菌株，好氧；能以含硫杂环化合物为唯一硫源。 3.。

5、根据权利要求 1 所述的分支杆菌 (Mycobacterium sp.)ZD-19 在对含硫杂环化合物的燃料油中进行专一性脱硫的应用，其特征在于：所述的含硫杂环化合物为二苯并噻吩、 4， 6- 二甲基 - 二苯并噻吩、噻吩，苯并噻吩、二苯硫醚或其混合物。 4. 根据权利要求 3 所述的应用，其特征在于：所述的含硫杂环化合物为二苯并噻吩和 4， 6- 二甲基 - 二苯并噻吩的混合物。 5. 根据权利要求 3 或 4 所述的应用，其特征在于：分支杆菌 (Mycobacterium sp.) ZD-19 降解二苯并噻吩、 4， 6- 二甲基 - 二苯并噻吩遵循 “扩展 4。

6、S 途径” ，将羟基联苯甲氧基化，生成终产物为甲氧基联苯。权利要求书 CN 101134944 B 2 1/4 页 3 一种应用于燃料油中含硫杂环化合物脱硫的分枝杆菌及其用途技术领域 0001 本发明涉及能应用于燃料油中含硫杂环化合物脱硫的细菌菌株及其用途。背景技术 0002 化石燃料是当今世界最主要的能源物质，但其一般都含有大量的含硫化合物，这些含硫化合物在燃烧过程中会生成大量的二氧化硫，而二氧化硫又是形成酸雨的最主要因素。随着燃料油使用量的不断增加，低硫含量的高品质油的减少，人们使用高含硫量的燃料油，加剧了环境的污染。为了应对这一严峻形势，世界。

7、各国都对燃料油的含硫量作出了严格的规定 ( 莫蒂克 .DJ，生物工艺学， 2000， 11 ： 540-546)， 2006 年燃料规范要求汽油含硫量低于3010-6g/g。我国也对燃油的含硫量制订了严格的控制标准，新标准GB17930-1999规定硫含量要小于 0.08。 0003 原油中的硫大致可以分为无机硫和有机硫两种，无机硫主要包括溶解或悬浮在油中的元素硫、硫化氢、硫化物和硫铁矿等；而占含硫量的大部分的是石油中大约 200 种左右之多的有机硫，这些有机硫由各种硫醇、硫醚和噻吩及其衍生物组成(郑嘉惠，当代石油石化， 2003， 11(1) ： 4-6)。。

8、 0004 当前石油及其产品中的脱硫普遍采用的方法为加氢脱硫 (HDS)。HDS 是在高温 (300 )、高压 (10MPa)、加氢和金属催化剂的条件下进行的脱硫反应。该法可有效地脱除无机硫和简单的有机硫化合物，而对于杂环类含硫化合物，如二苯并噻吩 (DBT)，特别是烷基取代 DBT 衍生物， HDS 很难脱除这部分硫。 0005 近年来，生物脱硫技术 (BDS) 得到了极大地发展。生物脱硫技术 (BDS) 是一种在常温常压下利用需氧、厌氧菌去除杂环化合物中结合的有机硫的一种新技术 ( 丹尼尔 .J，莫蒂克，化工工艺， 1998， 28(7) ： 38-45)。该方法有。

9、效脱除 DBT 等含硫杂环化合物，而且反应条件温和，投资和操作费用低。据估计， BDS 的设备投资仅为 HDS 的 50，操作费用将减少 10 -20 ( 斯蒂芬罗曼诺 - 加西亚，碳氢化合物加工， 1995， 74(5) ： 19-20)。发明内容 0006 本发明提供了一种能对燃料油中含硫杂环化合物脱硫的分枝杆菌，该菌株用于降解燃料油中二苯并噻吩及其衍生物 4， 6- 二甲基二苯并噻吩、噻吩、苯并噻吩、二苯硫醚等含硫杂环化合物。 0007 从油田、炼油厂、污水处理厂等地提取污泥和被污染的土壤样品，样品经浸取、富集和驯化后，将菌液涂布于选择性培养基平板上。

10、，分离单菌落扩大培养，用 GC-MS 检测降解 DBT 后的产物，初筛得到按 “4S” 氧化途径选择性降解 DBT 的菌株。以 DBT 为唯一硫源培养初筛菌种至指数生长后期停止培养，收集休止细胞，系统比较了各休止细胞的脱硫性能，复筛得到一株生长特性较好、活性较高的目标菌株。 0008 该菌株该菌株属于分枝杆菌属 (Mycobacterium sp.) ；菌落形状呈圆形，直径 1 说明书 CN 101134944 B 3 2/4 页 4 2mm ；细胞呈球状， 0.5-1.0m ；无芽孢，无夹膜；革兰氏阳性菌株，好氧。能以二苯并噻吩为唯一硫源。其保藏编号为。

11、： CGMCC NO.1817。 0009 本发明采用生物脱硫技术，以分枝杆菌(Mycobacterium sp.)ZD-19菌株为生物催化剂，在常温常压条件下降解燃料中的含硫化合物，二苯并噻吩 (DBT) 是燃料油生物脱硫公认的模型化合物，该菌株降解二苯并噻吩 (DBT) 过程遵循独特的 “扩展 4S 途径” ( 如图 1 所示 )，能专一地切断 DBT 中的 C-S 键，生成 2- 羟基联苯 (2-HBP)，然后继续将其甲氧基化，产生终产物 2- 甲氧基联苯 (2-MBP)，能部分消除 2-HBP 对酶的抑制和对细胞的毒害，从而更有利于生物脱硫。同时将硫原子氧化。

12、成无机硫化合物转入水相，产物 2-MBP 仍留在油相中，不损失油的热值。降解 DBT 的衍生物 4， 6- 二甲基二苯并噻吩也同样遵循独特的 “扩展 4S 途径” ( 如图 2 所示 )。除 DBT 外，该菌株还能以燃料油中的其他含硫杂环化合物：噻吩 (TH)、苯并噻吩(BTH)、二苯硫醚(DPS)和4， 6-二甲基二苯并噻吩(4， 6-DMDBT)作为底物降解，表现出较广的底物范围；同时该菌株还能同时降解 DBT 和 4， 6-DMDBT 的混合物，有利于超低硫油品的生产，具有较好的燃料油生物脱硫工业应用前景。附图说明 0010 图 1 为该菌株降解 DBT 。

13、的 “扩展 4S 途径” ； 0011 图 2 为该菌株降解 DBT 的衍生物 4， 6- 二甲基二苯并噻吩的 “扩展 4S 途径” ； 0012 图 3 为该菌的休止细胞脱除 DBT 的底物和产物浓度随时间变化； 0013 图 4 为该菌的休止细胞脱除 DBT 在不同时间的底物和代谢产物的 GC 图； 0014 图 5 为该菌的休止细胞脱除 4， 6-DMDBT 的底物和产物随时间变化的 GC 图； 0015 图 6 为该菌的休止细胞脱除 TH、 BTH、 DPS、 4， 6-DMDBT 时其降解程度随时间变化； 0016 图 7 为该菌的休止细胞同时脱除 DBT 和 4， 6-DM。

14、DBT 时其浓度随时间变化。具体实施方式 0017 实施例 1 0018 1. 菌种的选育： 0019 从油田、炼油厂、污水处理厂等地取污泥和被污染的土壤样品，经浸取、富集和驯化之后，将培养液按 10 倍稀释法进行系列稀释，取 10-4到 10-8稀释倍数的菌液涂布于固体选择培养基平板，倒置于恒温培养箱， 30培养 5 6 天，挑出分离的单菌落扩大培养，用 GC-MS 检测降解 DBT 后的产物，初筛得到按 “4S” 氧化途径选择性降解 DBT 的菌株。以 DBT 为唯一硫源培养初筛菌种至指数生长后期停止培养，收集休止细胞，系统比较了各休止细胞的脱硫性能，复。

15、筛得到一株生长特性较好、活性较高的目标菌株。该菌株的短期保藏，接入添加DBT的斜面培养基，于冰箱4保藏。长期保藏，制备冻干管，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，中国科学院微生物研究所，保藏日期： 2006 年 9 月 18 日，保藏编号： CGMCC NO.1817。 0020 2. 该菌株的培养条件 0021 1000mL 液体培养基组成如下： 0022 K2HPO43H2O5.0g， NaH2PO42H2O2.0g， MgCl26H2O0.2g， NH4Cl2.0g，甘油 2g，微量元素 1mL，硫源为 0.2 0.5mM DBT。其中微。

16、量元素组成 ( 每 100mL 蒸馏水 ) ：说明书 CN 101134944 B 4 3/4 页 5 CuCl22H2O0.011mg， CoCl26H2O0.04mg， ZnCl20.02mg， CaCl20.4mg， H3BO30.005mg， NaMoO42H2O0.02mg， FeCl37H2O0.4mg， AlCl36H2O0.01mg， MnCl24H2O0.08mg。 0023 固体选择性培养基平板和斜面：液体选择培养基加 1.5 2水洗琼脂。 0024 培养条件：适宜生长 pH 范围为 6.5 9.5 ；适宜生长温度为 20 40；以氯化铵为氮源，适宜浓。

17、度为 0.5 2.0g L-1；以甘油为碳源，适宜浓度为 1.0 4.0g L-1；以 DBT 为硫源，浓度为 0.1 0.5mM。 0025 3. 菌株形态及分子生物学鉴定 0026 该菌株属于分枝杆菌属(Mycobacterium sp). ；菌落形状呈圆形，直径12mm ；个体形状呈球状， 0.5-1.0m ；无芽孢，无夹膜；革兰氏阳性菌株，好氧。 0027 根据测得的该菌株的 16S rDNA 基因序列在 NCBI 网站，以 BLAST 程序进行比较分析，对其同源分类鉴定。发现它与分枝杆菌属 (Mycobacterium sp.) 的多个菌株序列相似。

18、性都达到 98以上。选取 14 株分枝杆菌利用 DNAStar 软件将这些相应序列与该菌序列进行同源性比较，建立系统进化树。结合系统进化树和 MegAlign 的同源性分析，将该菌归属为分枝杆菌属，最后将该菌株命名为 Mycobacterium sp.ZD-19。 0028 实施例 2 ： Mycobacterium sp.ZD-19 降解含硫杂环化合物的新途径 0029 1. 休止细胞的制备：将 4冰箱保存的菌种接种于斜面培养基， 30下培养 96 小时。再将经活化的菌种接入灭菌后的DBT为唯一硫源的液体培养基，置于30摇床， 180rpm 培养至对数期后期停止培养，将。

19、菌悬液离心分离，用 0.85的生理盐水洗涤两次，下层菌相浓缩悬浮于 pH7.0 的 0.1M 的磷酸缓冲液中，制备得到休止细胞，用于含硫杂环化合物的脱硫。 0030 2. 水溶液脱硫反应：将休止细胞悬浮液和一定浓度的含硫杂环化合物，置于转速 180rpm，温度 30的摇床中反应，间隔一定时间取样，用等量乙酸乙酯萃取， 4800g 离心分离 10 分钟，有机相用 GC 分析，有机相中产物成分用 GC-MS 分析。 0031 3. 休止细胞降解 DBT 结果比较和分析：在水相脱硫时，加入 DBT 浓度为 0.5mM，置于摇床中反应，间隔 3、 6、 9、。

20、12、 16、 20、 24、 30、 36、 42、 48 小时取样，离心，有机相用 GC 分析，测定产物生成量， GC-MS 分析，确定物质结构。如图 3 所示该菌株脱硫的产物 2-HBP 在 9 小时到达最大值， DBT完全被转换为2-HBP，而随后2-HBP浓度逐渐下降，其进一步被细胞氧化成 2-MBP，在 36 小时 2-HBP 完全被氧化成 2-MBP。图 4 是该菌休止细胞脱除 DBT 在不同时间的底物和代谢产物的 GC 图，十分直观的表明底物和产物的变化。这种将 “4S 途径” 的终产物 2-HBP 甲氧基化成 2-MBP 的 “扩展 4S 途径” 是非。

21、常罕见的，且由于 2-HBP 对细胞有很强的毒性，对 DBT 的降解有很强的抑制作用，而 2-MBP 相对于 2-HBP 极性较小，对细胞的毒性也较小，因此将 2-HBP 氧化成 2-MBP 可在很大程度减轻 2-HBP 对脱硫的抑制作用，因此这种新途径的发现对油品脱硫有着积极意义。 0032 4. 休止细胞降解 4， 6-DMDBT 结果分析：应用休止细胞进行 4， 6-DMDBT 脱硫反应，测定不同反应时间的底物消耗和代谢产物生成情况。如图 5 所示，反应初始， 4， 6-DMDBT 按 “4S 途径” 代谢生成 3， 3 - 二甲基 -2- 羟基联苯，随产物浓。

22、度积累到一定程度，反应进行到 24h 后，产物 3， 3 - 二甲基 -2- 羟基联苯上的羟基也被甲基化，生成新产物 3， 3 - 二甲基 -2- 甲氧基联苯。这也进一步验证了该菌具有独特的 “扩展 4S 途径” 的特性。 0033 实施例 3 ：专一降解燃料油中的多种含硫杂环化合物说明书 CN 101134944 B 5 4/4 页 6 0034 DBT 是燃料油生物脱硫公认的模型化合物，但是除 DBT 外，油中的含硫杂环化合物还有很多，如 4， 6-DMDBT、 TH、 BTH 和 DPS。 0035 1. 生长细胞降解多种含硫杂环化合物反应：培养基中分别加入。

23、不同的含硫杂环化合物4， 6-DMDBT、 TH、 BTH和DPS作为唯一硫源，浓度均为0.25mM。接入1g L-1休止细胞菌液，置于转速 180rpm，温度 30的摇床中反应，间隔时间取样，加入 10盐酸调 pH 2 后，等量乙酸乙脂萃取， 4800g 离心分离 10 分钟，萃取相用 GC 分析。 0036 2. 生长细胞降解多种含硫杂环化合物结果分析：如图 6 所示，在 10 小时之内，该菌能完全脱除 TH，在 50 小时完全脱除 BTH 和 4， 6-DMDBT ；相对脱除效果较差的 DPS 在 50 小时之内也能去除 60， 90 小时之内脱除 8。

24、0。该菌株能完全去除 4， 6-DMDBT、 TH、 BTH，并脱除部分 DPS 中的硫，比其他菌株的脱硫范围更广，对燃料油脱硫来说具有无可比拟的优越性，因此将更具有工业应用前景。 0037 实施例 4 ：同时降解两种含硫杂环化合物 0038 1. 休止细胞同时降解两种含硫杂环化合物反应：水溶液反应体系中，休止细胞初始菌液浓度为 25g1-1，同时加入 DBT 和 4， 6-DMDBT 各 0.25mM，总硫浓度为 0.5mM，置于转速 180rpm，温度 30的摇床中反应，间隔时间取样，加入 10盐酸调 pH 2 后，等量乙酸乙脂萃取， 4800g 离心。

25、分离 10 分钟，萃取相用 GC 分析。 0039 2. 休止细胞同时降解两种含硫杂环化合物结果分析：如图 7 所示，随着脱硫反应的进行，反应体系中两种化合物的浓度同时降低， ZD-19 对于混合硫化物反应 8h 后， 0.25mM DBT 和 4， 6-DMDBT 的脱硫率分别为 91.6和 53.2，总硫脱除率为 77，说明当 DBT 和 4， 6-DMDBT 两种含硫杂环化合物共同存在时，该菌株能同时将其降解，这一点对于实际油品脱硫是很重要的，有利于超低硫油品的生产。说明书 CN 101134944 B 6 1/5 页 7 图 1 说明书附图 CN 101134944 B 7 2/5 页 8 图 2 图 3 说明书附图 CN 101134944 B 8 3/5 页 9 图 4 说明书附图 CN 101134944 B 9 4/5 页 10 图 5 图 6 说明书附图 CN 101134944 B 10 5/5 页 11 图 7 说明书附图 CN 101134944 B 11 。

摘要
申请专利号：	CN200710068080.4	申请日：	20070420
公开号：	CN101134944B	公开日：	20120606
当前法律状态：		有效性：	失效
法律详情：
IPC分类号：	C12N1/20,C10G32/00,C12R1/32	主分类号：	C12N1/20,C10G32/00,C12R1/32
申请人：	浙江大学
发明人：	李伟,陈晗,张文娟,蔡郁蓓
地址：	310027 浙江省杭州市西湖区浙大路38号
优先权：	CN200710068080A
专利代理机构：	杭州天勤知识产权代理有限公司	代理人：	胡红娟
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内容摘要

本发明公开了一种应用于燃料油中含硫杂环化合物脱硫的细菌菌株。该菌株经鉴定命名为分枝杆菌(Mycobacterium?sp.)ZD-19，保藏号为：CGMCC?NO.1817。本发明还公开了该菌株在对含硫杂环化合物的燃料油中进行专一性脱硫的用途，以此菌株为催化剂，采用生物脱硫技术，降解燃料油中的含硫杂环化合物，对二苯并噻吩及其衍生物4，6-二甲基二苯并噻吩的降解过程遵循独特的“扩展4S途径”，能将传统“4S途径”的产物2-羟基联苯及3，3’-二甲基-2-羟基联苯进一步甲氧基化，生成最终产物2-甲氧基联苯及3，3’-二甲基-2-甲氧基联苯，有效地减弱了产物抑制。该菌株用于燃料油中的生物脱硫，性能优越，具有工业应用前景。

权利要求书

1.一种应用于燃料油中含硫杂环化合物脱硫的分支杆菌(Mycobacterium sp.)ZD-19菌种保藏号为：CGMCC NO.1817。 2.根据权利1所述的分支杆菌(Mycobacterium sp.)ZD-19，其特征在于：该菌属分支杆菌属，菌落形状呈圆形，直径1～2mm；细胞呈球状，0.5～1.0μm；无芽孢，无夹膜；革兰氏阳性菌株，好氧；能以含硫杂环化合物为唯一硫源。 3.根据权利要求1所述的分支杆菌(Mycobacterium sp.)ZD-19在对含硫杂环化合物的燃料油中进行专一性脱硫的应用，其特征在于：所述的含硫杂环化合物为二苯并噻吩、4，6-二甲基-二苯并噻吩、噻吩，苯并噻吩、二苯硫醚或其混合物。 4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的含硫杂环化合物为二苯并噻吩和4，6-二甲基-二苯并噻吩的混合物。 5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：分支杆菌(Mycobacterium sp.)ZD-19降解二苯并噻吩、4，6-二甲基-二苯并噻吩遵循“扩展4S途径”，将羟基联苯甲氧基化，生成终产物为甲氧基联苯。

说明书

技术领域

本发明涉及能应用于燃料油中含硫杂环化合物脱硫的细菌菌株及其用途。

背景技术

化石燃料是当今世界最主要的能源物质，但其一般都含有大量的含硫化合物，这些含硫化合物在燃烧过程中会生成大量的二氧化硫，而二氧化硫又是形成酸雨的最主要因素。随着燃料油使用量的不断增加，低硫含量的高品质油的减少，人们使用高含硫量的燃料油，加剧了环境的污染。为了应对这一严峻形势，世界各国都对燃料油的含硫量作出了严格的规定 (莫蒂克.DJ，《生物工艺学》，2000，11：540-546)，2006年燃料规范要求汽油含硫量低于30×10-6g/g。我国也对燃油的含硫量制订了严格的控制标准，新标准GB17930-1999规定硫含量要小于0.08％。

原油中的硫大致可以分为无机硫和有机硫两种，无机硫主要包括溶解或悬浮在油中的元素硫、硫化氢、硫化物和硫铁矿等；而占含硫量的大部分的是石油中大约200种左右之多的有机硫，这些有机硫由各种硫醇、硫醚和噻吩及其衍生物组成(郑嘉惠，《当代石油石化》，2003，11(1)：4-6)。

当前石油及其产品中的脱硫普遍采用的方法为加氢脱硫(HDS)。HDS 是在高温(>300℃)、高压(>10MPa)、加氢和金属催化剂的条件下进行的脱硫反应。该法可有效地脱除无机硫和简单的有机硫化合物，而对于杂环类含硫化合物，如二苯并噻吩(DBT)，特别是烷基取代DBT衍生物，HDS 很难脱除这部分硫。

近年来，生物脱硫技术(BDS)得到了极大地发展。生物脱硫技术 (BDS)是一种在常温常压下利用需氧、厌氧菌去除杂环化合物中结合的有机硫的一种新技术(丹尼尔.J，莫蒂克，《化工工艺》，1998，28(7)：38-45)。该方法有效脱除DBT等含硫杂环化合物，而且反应条件温和，投资和操作费用低。据估计，BDS的设备投资仅为HDS的50％，操作费用将减少 10％-20％(斯蒂芬罗曼诺-加西亚，《碳氢化合物加工》，1995，74(5)：19-20)。

发明内容

本发明提供了一种能对燃料油中含硫杂环化合物脱硫的分枝杆菌，该菌株用于降解燃料油中二苯并噻吩及其衍生物4，6-二甲基二苯并噻吩、噻吩、苯并噻吩、二苯硫醚等含硫杂环化合物。

从油田、炼油厂、污水处理厂等地提取污泥和被污染的土壤样品，样品经浸取、富集和驯化后，将菌液涂布于选择性培养基平板上，分离单菌落扩大培养，用GC-MS检测降解DBT后的产物，初筛得到按“4S”氧化途径选择性降解DBT的菌株。以DBT为唯一硫源培养初筛菌种至指数生长后期停止培养，收集休止细胞，系统比较了各休止细胞的脱硫性能，复筛得到一株生长特性较好、活性较高的目标菌株。

该菌株该菌株属于分枝杆菌属(Mycobacterium sp.)；菌落形状呈圆形，直径1～2mm；细胞呈球状，0.5-1.0μm；无芽孢，无夹膜；革兰氏阳性菌株，好氧。能以二苯并噻吩为唯一硫源。其保藏编号为：CGMCC NO.1817。

本发明采用生物脱硫技术，以分枝杆菌(Mycobacterium sp.)ZD-19菌株为生物催化剂，在常温常压条件下降解燃料中的含硫化合物，二苯并噻吩 (DBT)是燃料油生物脱硫公认的模型化合物，该菌株降解二苯并噻吩(DBT) 过程遵循独特的“扩展4S途径”(如图1所示)，能专一地切断DBT中的 C-S键，生成2-羟基联苯(2-HBP)，然后继续将其甲氧基化，产生终产物 2-甲氧基联苯(2-MBP)，能部分消除2-HBP对酶的抑制和对细胞的毒害，从而更有利于生物脱硫。同时将硫原子氧化成无机硫化合物转入水相，产物2-MBP仍留在油相中，不损失油的热值。降解DBT的衍生物4，6-二甲基二苯并噻吩也同样遵循独特的“扩展4S途径”(如图2所示)。除DBT 外，该菌株还能以燃料油中的其他含硫杂环化合物：噻吩(TH)、苯并噻吩 (BTH)、二苯硫醚(DPS)和4，6-二甲基二苯并噻吩(4，6-DMDBT)作为底物降解，表现出较广的底物范围；同时该菌株还能同时降解DBT和4，6-DMDBT 的混合物，有利于超低硫油品的生产，具有较好的燃料油生物脱硫工业应用前景。

附图说明

图1为该菌株降解DBT的“扩展4S途径”；

图2为该菌株降解DBT的衍生物4，6-二甲基二苯并噻吩的“扩展4S 途径”；

图3为该菌的休止细胞脱除DBT的底物和产物浓度随时间变化；

图4为该菌的休止细胞脱除DBT在不同时间的底物和代谢产物的GC 图；

图5为该菌的休止细胞脱除4，6-DMDBT的底物和产物随时间变化的 GC图；

图6为该菌的休止细胞脱除TH、BTH、DPS、4，6-DMDBT时其降解程度随时间变化；

图7为该菌的休止细胞同时脱除DBT和4，6-DMDBT时其浓度随时间变化。

具体实施方式

实施例1

1.菌种的选育：

从油田、炼油厂、污水处理厂等地取污泥和被污染的土壤样品，经浸取、富集和驯化之后，将培养液按10倍稀释法进行系列稀释，取10-4到 10-8稀释倍数的菌液涂布于固体选择培养基平板，倒置于恒温培养箱，30 ℃培养5～6天，挑出分离的单菌落扩大培养，用GC-MS检测降解DBT后的产物，初筛得到按“4S”氧化途径选择性降解DBT的菌株。以DBT为唯一硫源培养初筛菌种至指数生长后期停止培养，收集休止细胞，系统比较了各休止细胞的脱硫性能，复筛得到一株生长特性较好、活性较高的目标菌株。该菌株的短期保藏，接入添加DBT的斜面培养基，于冰箱4℃保藏。长期保藏，制备冻干管，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2006年9月18日，保藏编号：CGMCC NO.1817。

2.该菌株的培养条件

1000mL液体培养基组成如下：

K2HPO4·3H2O5.0g，NaH2PO4·2H2O2.0g，MgCl2·6H2O0.2g，NH4Cl2.0 g，甘油2g，微量元素1mL，硫源为0.2～0.5mM DBT。其中微量元素组成(每100mL蒸馏水)：CuCl2·2H2O0.011mg，CoCl2·6H2O0.04mg，ZnCl20.02mg，CaCl20.4mg，H3BO30.005mg，NaMoO4·2H2O0.02mg， FeCl3·7H2O0.4mg，AlCl3·6H2O0.01mg，MnCl2·4H2O0.08mg。

固体选择性培养基平板和斜面：液体选择培养基加1.5～2％水洗琼脂。

培养条件：适宜生长pH范围为6.5～9.5；适宜生长温度为20～40℃；以氯化铵为氮源，适宜浓度为0.5～2.0g L-1；以甘油为碳源，适宜浓度为 1.0～4.0g L-1；以DBT为硫源，浓度为0.1～0.5mM。

3.菌株形态及分子生物学鉴定

该菌株属于分枝杆菌属(Mycobacterium sp).；菌落形状呈圆形，直径 1～2mm；个体形状呈球状，0.5-1.0μm；无芽孢，无夹膜；革兰氏阳性菌株，好氧。

根据测得的该菌株的16S rDNA基因序列在NCBI网站，以BLAST 程序进行比较分析，对其同源分类鉴定。发现它与分枝杆菌属 (Mycobacterium sp.)的多个菌株序列相似性都达到98％以上。选取14 株分枝杆菌利用DNAStar软件将这些相应序列与该菌序列进行同源性比较，建立系统进化树。结合系统进化树和MegAlign的同源性分析，将该菌归属为分枝杆菌属，最后将该菌株命名为Mycobacterium sp.ZD-19。

实施例2：Mycobacterium sp.ZD-19降解含硫杂环化合物的新途径

1.休止细胞的制备：将4℃冰箱保存的菌种接种于斜面培养基，30℃ 下培养96小时。再将经活化的菌种接入灭菌后的DBT为唯一硫源的液体培养基，置于30℃摇床，180rpm培养至对数期后期停止培养，将菌悬液离心分离，用0.85％的生理盐水洗涤两次，下层菌相浓缩悬浮于pH7.0的 0.1M的磷酸缓冲液中，制备得到休止细胞，用于含硫杂环化合物的脱硫。

2.水溶液脱硫反应：将休止细胞悬浮液和一定浓度的含硫杂环化合物，置于转速180rpm，温度30℃的摇床中反应，间隔一定时间取样，用等量乙酸乙酯萃取，4800×g离心分离10分钟，有机相用GC分析，有机相中产物成分用GC-MS分析。

3.休止细胞降解DBT结果比较和分析：在水相脱硫时，加入DBT浓度为0.5mM，置于摇床中反应，间隔3、6、9、12、16、20、24、30、36、 42、48小时取样，离心，有机相用GC分析，测定产物生成量，GC-MS 分析，确定物质结构。如图3所示该菌株脱硫的产物2-HBP在9小时到达最大值，DBT完全被转换为2-HBP，而随后2-HBP浓度逐渐下降，其进一步被细胞氧化成2-MBP，在36小时2-HBP完全被氧化成2-MBP。图4 是该菌休止细胞脱除DBT在不同时间的底物和代谢产物的GC图，十分直观的表明底物和产物的变化。这种将“4S途径”的终产物2-HBP甲氧基化成2-MBP的“扩展4S途径”是非常罕见的，且由于2-HBP对细胞有很强的毒性，对DBT的降解有很强的抑制作用，而2-MBP相对于2-HBP极性较小，对细胞的毒性也较小，因此将2-HBP氧化成2-MBP可在很大程度减轻2-HBP对脱硫的抑制作用，因此这种新途径的发现对油品脱硫有着积极意义。

4.休止细胞降解4，6-DMDBT结果分析：应用休止细胞进行 4，6-DMDBT脱硫反应，测定不同反应时间的底物消耗和代谢产物生成情况。如图5所示，反应初始，4，6-DMDBT按“4S途径”代谢生成3，3’-二甲基-2-羟基联苯，随产物浓度积累到一定程度，反应进行到24h后，产物 3，3’-二甲基-2-羟基联苯上的羟基也被甲基化，生成新产物3，3’-二甲基-2- 甲氧基联苯。这也进一步验证了该菌具有独特的“扩展4S途径”的特性。

实施例3：专一降解燃料油中的多种含硫杂环化合物

DBT是燃料油生物脱硫公认的模型化合物，但是除DBT外，油中的含硫杂环化合物还有很多，如4，6-DMDBT、TH、BTH和DPS。

1.生长细胞降解多种含硫杂环化合物反应：培养基中分别加入不同的含硫杂环化合物4，6-DMDBT、TH、BTH和DPS作为唯一硫源，浓度均为0.25mM。接入1g L-1休止细胞菌液，置于转速180rpm，温度30℃的摇床中反应，间隔时间取样，加入10％盐酸调pH≤2后，等量乙酸乙脂萃取，4800×g离心分离10分钟，萃取相用GC分析。

2.生长细胞降解多种含硫杂环化合物结果分析：如图6所示，在10 小时之内，该菌能完全脱除TH，在50小时完全脱除BTH和4，6-DMDBT；相对脱除效果较差的DPS在50小时之内也能去除60％，90小时之内脱除 80％。该菌株能完全去除4，6-DMDBT、TH、BTH，并脱除部分DPS中的硫，比其他菌株的脱硫范围更广，对燃料油脱硫来说具有无可比拟的优越性，因此将更具有工业应用前景。

实施例4：同时降解两种含硫杂环化合物

1.休止细胞同时降解两种含硫杂环化合物反应：水溶液反应体系中，休止细胞初始菌液浓度为25g1-1，同时加入DBT和4，6-DMDBT各0.25 mM，总硫浓度为0.5mM，置于转速180rpm，温度30℃的摇床中反应，间隔时间取样，加入10％盐酸调pH≤2后，等量乙酸乙脂萃取，4800×g 离心分离10分钟，萃取相用GC分析。

2.休止细胞同时降解两种含硫杂环化合物结果分析：如图7所示，随着脱硫反应的进行，反应体系中两种化合物的浓度同时降低，ZD-19对于混合硫化物反应8h后，0.25mM DBT和4，6-DMDBT的脱硫率分别为 91.6％和53.2％，总硫脱除率为77％，说明当DBT和4，6-DMDBT两种含硫杂环化合物共同存在时，该菌株能同时将其降解，这一点对于实际油品脱硫是很重要的，有利于超低硫油品的生产。