技术领域
本发明涉及MicroRNA，尤其是涉及一种基于AllGlo探针荧光定量PCR的 hsa-miR-520a-3p检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是一类广泛存在于真核细胞中的长约22个核苷酸的非编码RNA分 子，参与了在生物体中许多生理病理过程,通过调节基因表达,在细胞增殖、凋亡、生长发育、 细胞分化、代谢等过程中发挥重要作用，具体表现为miRNA在细胞核内经过形成最初的初 级转录本pri-miRNA到pre-miRNA，后转运出细胞核，通过剪切形成成熟miRNA，通过与 Ago蛋白等形成RISC（RNA诱导的沉默复合体），部分抑制或降解靶mRNA序列，参与基 因表达调控（BartelDP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,andfunction[J]. Cell,2004,116(2):281-297）。
由于miRNA在肿瘤的发生、发展、预后判断以及许多其他疾病状态下扮演着重要角色， 精确检测其表达情况对于研究miRNA的作用具有重大意义。目前，检测miRNA的方法主要 有northernblot技术、实时荧光定量PCR技术、原位杂交技术、微阵列芯片技术等。其中， northernblot技术是RNA检测的早期手段之一，但其特异性和敏感性低，如果样本RNA含 量低或存在降解，可能检测不到；原位杂交技术用于检测组织和细胞水平miRNA的分布情 况，同时对miRNA进行半定量检测，其不足地方在于不能准确检测到低表达的miRNA；微 阵列芯片技术是一种高通量的检测技术，能同时检测一种或多种样本的大量的miRNA，但存 在芯片制作费时，费力和标记成本高，检测灵敏度和特异性低等问题。
实时荧光定量技术（RT-qPCR）是目前最普遍用于基因表达检测的技术之一，具有简便 快速、敏感性高和特异性好等特点。目前，用于检测miRNA的实时荧光定量PCR方法包括 miRNA逆转录和下游的荧光定量PCR两部分，其中逆转录根据反转录引物的不同分为两种： 同聚物加尾法和茎环逆转录法；荧光定量PCR的检测分为染料法和探针法，其中目前检测 miRNA的探针多为Taqman-MGB探针（一种适合于扩增短片段的荧光探针），由于成熟的 miRNA具有片段短小的特点，要特异的检测，探针法更有优势，在敏感性和特异性上优于染 料法。基于茎环结构的逆转录引物能特异识别，扩增成熟的miRNA序列，而miRNA的前体 并未被扩增，Taqman-MGB探针检测miRNA缺点在于合成价格贵，不利于推广。
目前，AllGlo探针已经成功应用于检测疱疹病毒、乙型肝炎病毒基因突变（Feng,Z.L.Yu, X.Y.Lu,Z.M.Geng,D.Y.Zhang,L.Chen,S.J.RapiddetectionofthehepatitisBvirusYMDD mutantusingAllGloTMprobes[J].ClinChimActa,2011，412(11-12)：1018-1021）、侵袭性曲霉 菌病（Wu,D.S.Shen,J.Z.Zhou,X.Q.Shen,S.F.Wu,X.M.Theestablishmentandevaluationof diagnosticaccuracyofAllGlo(TM)probe-basedtechniquesforinvasiveaspergillosis[J].Zhonghua NeiKeZaZhi,2010,49(2):142-145）、K-ras基因突变、强直性脊柱炎等检测。
有研究报道表明在肝癌患者的糖酵解过程中hsa-miR-520a-3p扮演重要角色（ParkYY, KimSB,HanHD,SohnBH,KimJH,LiangJ,etal.Tat-activatingregulatoryDNA-bindingprotein regulatesglycolysisinhepatocellularcarcinomabyregulatingtheplateletisoformof phosphofructokinasethroughmicroRNA520[J].Hepatology，2013，58(1):182-191.）,在部分雌 激素受体阴性乳腺癌患者中，hsa-miR-520a-3p做为抑癌因子存在（KeklikoglouI,KoernerC, SchmidtC,ZhangJD,HeckmannD,ShavinskayaA,etal.MicroRNA-520/373familyfunctionsas atumorsuppressorinestrogenreceptornegativebreastcancerbytargetingNF-kappaBand TGF-betasignalingpathways.Oncogene[J].2012,31(37):4150-4163.),目前hsa-miR-520a-3p在 生物及其他领域的功能越来越得到重视。
发明内容
本发明的目的之一在于针对现有检测miRNA方法中使用的试剂盒和检测方法存在的上 述缺陷，提供基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-520a-3p检测试剂盒。
本发明的目的之二在于提供基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-520a-3p的检测方 法。
所述hsa-miR-520a-3p为一种人源性miRNA，其核苷酸序列为：SEQIDNO.15＇- AAAGUGCUUCCCUUUGGACUGU-3＇。
所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-520a-3p检测试剂盒，设有盒体、隔板、 外源性参照瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶；隔板设在盒体内，外源性参 照瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶插在隔板上，外源性参照瓶内装有外源 性参照，茎环逆转录试剂瓶内装有茎环逆转录试剂，实时荧光定量PCR试剂瓶内装有实时荧 光定量PCR试剂。
所述外源性参照可采用cel-miR-39等，所述cel-miR-39为一种线虫类miRNA,其核苷酸 序列为：SEQIDNO.25＇-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3＇；其工作浓度可为5nmol。
所述茎环逆转录试剂包括以下组份：200单位/μL的MMLV酶、10mmoldNTP混合液、 5×RT缓冲液（所述5×RT缓冲液由250mmolTris-HCl、375mmolKCl、15mmolMgCl2、50m molDTT组成）、40单位/μL的RNA酶抑制剂、10mmol的MgCl2、1μmol的特异的miRNA 的逆转录引物、miRNA标准品（这里的miRNA标准品是指人工合成的miRNA，浓度为100n mol）。
所述miRNA的特异逆转录引物由hsa-miR-520a-3p的特异逆转录引物、外源性参照 cel-miR-39的特异逆转录引物和内源性参照U6的特异逆转录引物组成：
所述hsa-miR-520a-3p的特异逆转录引物的核苷酸序列为：SEQIDNO.35＇- GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACAGTCCA-3＇；
所述外源性参照cel-miR-39的特异逆转录引物的核苷酸序列为：SEQIDNO.45＇ -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCTGTTCCT-3＇；
所述内源性参照U6的特异逆转录引物的核苷酸序列为：SEQIDNO.55＇ -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3＇。
所述实时荧光定量PCR试剂包括以下组份：10×Taq缓冲液(10×Taq缓冲液包括100m molTris-HCl，500mmolKCl）、10mmol的MgCl2、5单位/μL的Taq聚合酶、10mmoldNTP 混合液、100mL无核酶水、10μmol特异正向引物、10μmol通用反向引物和AllGlo探针。
所述特异正向引物由hsa-miR-520a-3p的特异引物、外源性参照cel-miR-39的特异引物和 内源性参照U6的特异引物组成：
所述hsa-miR-520a-3p的特异引物的核苷酸序列为：
SEQIDNO.65＇-TACCCAAAGTGCTTCCCT-3＇；
所述外源性参照cel-miR-39的特异引物的核苷酸序列为：
SEQIDNO.75＇-CAGAGTCACCGGGTGTAAAT-3＇；
所述内源性参照U6的特异引物的核苷酸序列为：
SEQIDNO.85＇-CTCGCTTCGGCAGCACA-3＇。
所述通用反向引物的核苷酸序列为：
SEQIDNO.95＇-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3＇。
所述AllGlo探针由hsa-miR-520a-3p的特异探针、内源性参照U6的特异探针和外源性参 照cel-miR-39的特异探针组成；
所述hsa-miR-520a-3p的特异探针的核苷酸序列为：
SEQIDNO.10MAR-CACTGGATACGACACAGTCCAAAGG-MAR；
所述内源性参照U6的特异探针的核苷酸序列为：
SEQIDNO.11JUP-CGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCC-JUP；
所述外源性参照cel-miR-39的特异探针的核苷酸序列为：
SEQIDNO.12JUP-TGCACTGGATACGACCAAGCT-JUP。
所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-520a-3p的检测方法，其步骤如下：
1）采用常规方法提取样本中miRNA，如果为血清/血浆或其他体液样本，在样本充分裂 解后加入所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-520a-3p检测试剂盒提供的浓度为5n mol的外源性参照cel-miR-395μL，立即进行漩涡震荡15s；若为细胞或组织样本，则无需加 入外源性参照cel-miR-39；
2）采用所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-520a-3p检测试剂盒提供的茎环 逆转录试剂逆转录miRNA为cDNA；
3）采用所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-520a-3p检测试剂盒提供的实时 荧光定量PCR试剂将cDNA进行实时PCR扩增；
4）综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值（Threshold）和基线（Baseline），进 行结果分析。
所述AllGlo探针可采用美国A1leLogicBiosciencesCorporation公司的荧光定量探针，它 拥有普通Taqman，Taqman-MGB及分子信标(molecularbeacon)探针所有优点，克服了目前 这几种探针的最大弊端，它打破了传统Taqman一端报告基团一端淬灭基团的限制，利用了 美国A1leLogicBiosciencesCorporation公司研制的几种常见波长的特制荧光染料，标记在寡 核苷酸上面互为报告基团和粹灭基团，而且上面含有特殊的可以提高Tm值（退火温度）的 化学基团，提高探针特异性，杂交特异性大大提高，在杂交水解之后两端标记的染料又全部 变为报告基团，提高荧光增量。
所述AllGlo探针具有以下优势：①提高Tm值（可达10℃以上），探针更短可以达到 15～16个碱基，可以适用A,T含量比较高的序列设计探针；②加大了多重荧光定量的选择， 因为每种染料即是报告基团又是淬灭基团，打破传统Taqman探针因波长原因标记选择困难， 不受淬灭基团波长限制；③大大提高信噪比，无背景信号，空间距离近，更好的淬灭效果； ④成本较低，价格仅相当于Taqman-MGB探针的一半，具有MGB探针所有优势。
本发明采用了AllGlo探针技术，建立了能检测miRNA的实时荧光定量PCR的方法，与 taqman-MGB探针法相比，线性范围均能达到7个数量级。本发明建立的实时荧光定量PCR 灵敏度最低可达10拷贝/μL，最高可达107拷贝/μL。
本发明采用了AllGlo探针技术，设计了特异性引物和相应的AllGlo探针，探针分别标记 2种特殊荧光基团(MAR、JUP),并对该技术反应条件进行优化，建立了一种AllGlo探针荧光 定量PCR技术检测hsa-miR-520a-3p的方法，应用前景广阔。
本发明的有益效果如下：
本发明提供了一种基于AllGlo探针RT-qPCR的hsa-miR-520a-3p检测试剂盒和检测方 法，其特异性和敏感性高，可快速准确检测样本中miRNA的含量，与现有技术相比具有以 下优势：
1.与northernblot，miRNA芯片相比，AllGlo探针检测的特异性和敏感性均要高，价格比 miRNA芯片要便宜；
2.与taqman-MGB探针相比，AllGlo探针采用相同的荧光基团，互为报告基团和淬灭基 团，一方面释放的荧光信号更强，另一方面本底信号更低；而且合成程序简单，价格仅相当 于Taqman-MGB的一半。
3.相比目前普遍采用的基于SYBGreen染料检测miRNA方法，基于AllGlo探针检测 miRNA的反应时间大大缩短，而且敏感性与特异性要明显高于基于SYBGreen检测miRNA 的方法；
4.本发明建立了基于AllGlo探针的RT-qPCR检测hsa-miR-520a-3p的方法，适合于作为 筛选miRNA的临床样本验证，为进一步研究miRNA在相关疾病中扮演的作用起到推动作用。
附图说明
图1为本发明基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-520a-3p检测试剂盒实施例的结 构组成示意图。
具体实施方式
实施例1
参见图1，本发明所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-520a-3p检测试剂盒实 施例，设有盒体1、隔板2、外源性参照瓶3、茎环逆转录试剂瓶4、实时荧光定量PCR试剂 瓶5；隔板2设在盒体1内，外源性参照瓶3、茎环逆转录试剂瓶4、实时荧光定量PCR试剂 瓶5插在隔板2上，外源性参照瓶3内装有外源性参照，茎环逆转录试剂瓶4内装有茎环逆 转录试剂，实时荧光定量PCR试剂瓶5内装有实时荧光定量PCR试剂。
①所述外源性参照可采用cel-miR-39等，所述cel-miR-39为一种线虫类miRNA,，其工 作浓度可为5nmol，其作用在于监测从miRNA提取到后续实时荧光定量PCR全过程的反应 效率；
②茎环逆转录试剂包括以下组份：200单位/μL的MMLV酶、10mmoldNTP混合液、5×RT 缓冲液（5×RT缓冲液由250mmolTris-HCl，375mmolKCl，15mmolMgCl2，50mmolDTT 组成）、40单位/μL的RNA酶抑制剂、10mmol的MgCl2、1μmol的特异的miRNA的逆转录 引物、miRNA标准品（这里的miRNA标准品是指人工合成的miRNA，浓度为100nmol）;
③实时荧光定量PCR试剂包括以下组份：10×Taq缓冲液(10×Taq缓冲液包括100mmol Tris-HCl，500mmolKCl）、10mmol的MgCl2、5单位/μL的Taq聚合酶、10mmoldNTP混合 液、100mL无核酶水、10μmol特异正向引物、10μmol通用反向引物和AllGlo探针。
实施例2
血清或血浆hsa-miR-520a-3p的检测，包括以下步骤：
1.收集血浆或血清：
抽取新鲜血液标本2mL装于EDTA抗凝管或无抗凝剂管中，立即将上述试管颠倒混匀6～ 8次，然后将上述试管置于离心机3000r离心10min，结束后取出置于试管架上，小心吸取上 清置于新的1.5mL的无RNA酶的离心管中，将装有上清的1.5mL的离心管置于离心机中 13000r离心10min，结束后将上层血浆或血清转移至新的1.5mL无RNA酶的离心管中（此 步骤注意不要吸取到下层的细胞沉淀。），每管分装400～500μL，取200μL用于下一步提取， 其余血浆或血清于-80℃冻存。
2.提取microRNA
采用天根生物科技有限公司的生产的miRNA提取试剂盒(DP501)，按照操作说明书进行 样本（血浆或血清）miRNA提取，其中200μL血浆或血清在加入同等体积的裂解液剧烈震荡 30s后静置5min，然后加入外源性参照cel-mir-39(其工作浓度为5nmol)5μL，后按照说明书 操作进行，最后用30μL的去核酶水溶解miRNA，于核酸分光光度仪器NanoDrop2000上分 别测定浓度和纯度，取纯度A260/A280比值在1.6～2.2之间，取浓度2～20ng/μL的已提取 的miRNA用于下游的逆转录，其余的miRNA均于-80℃冻存。
3.miRNA的逆转录：
3.1将逆转录所需成分于室温下溶解，震荡混匀后置于冰上；请按照表1配制逆转录反应 液。
表1
组分 加入体积（μL） MMLV逆转录酶(200单位/μL）（promega公司） 0.4 MMLV5倍逆转录酶缓冲液（promega公司） 8 脱氧核苷混合液（10mL） 1.6 RNA酶抑制剂（40单位/μL） 0.4 特异性茎环逆转录引物（1μL) 各1.2,共2.4 无核酶水 25.2 总体积 38
注：表1中特异性逆转录引物各1.2μL分别是指目的hsa-miR-520a-3p的特异逆
转录引物和外源性参照cel-miR-39的特异引物。
3.2将配好的38μL混合液分装于无RNA酶的PCR管中，后加入2μL已提取富集的miRNA 溶液，用无RNA酶枪头充分混匀（此操作尽量避免气泡的产生），短暂离心甩至管底后置于 普通PCR仪（Biorad公司生产）上，逆转录反应条件如表2。
表2
步骤 条件 1 25℃5min 2 42℃60min 3 70℃15min
反应结束后置于4℃或冰上。
4.实时荧光定量PCR检测hsa-miR-520a-3p
4.1将荧光定量PCR的各组分置于室温溶解，混匀后置于冰上。
4.2配制PCR反应混合液如表3。
表3
组分 每管体积（μL) dNTP混合液（10m mol) 2 MgCl2(25m mol) 2 10×Taq缓冲液(无Mg2+) 2 Taq(5单位/μL)(takara公司) 0.2 正向引物（10μmol) 0.4 反向引物(10μmol) 0.4 探针(10μmol) 0.2 去核酶水 10.8 总体积 18
4.3于8联管中分装配制好PCR反应混合液，每管加入2μL的cDNA，充分混匀，整个 过程在冰上进行，避免气泡的产生。
4.4荧光定量PCR反应反应条件如表4。
表4
检测在实时荧光定量PCR仪器上进行，可使用ABI7300，7500（美国AppliedBiosystems 公司）等多种仪器。
5.数据分析与标准化处理：应用ABI仪器自带软件以及Excel进行数据分析，用上述方 法可测的样本（血清或血浆）中hsa-miR-520a-3p和外源性对照cel-mir-39的CT值，根据参 照的CT值水平求得hsa-miR-520a-3p在血清或血浆中的相对含量，以qPCR中相对定量的2-ΔCt方式表示血清或血浆中目的hsa-miR-520a-3p的水平（ΔCt为hsa-miR-520a-3p与外源参照的 Ct值之差)。
实施例3.组织或细胞miRNA检测
1.样品处理：
a.组织：将组织在液氮中磨碎。每30～50mg动物组织或者100mg植物组织加1mL裂 解液MZ（天根生物科技有限公司生产），用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过裂解液 MZ体积的10%。
b.单层培养细胞：直接在培养板中加入裂解液MZ裂解细胞，每10cm2面积加1mLMZ。 用取样器抽打几次。
c.细胞悬液：离心800r5min取细胞，弃上清。加入1mL裂解液MZ，振荡器振荡或移 液器吸打数次混匀。加裂解液MZ前不要洗涤细胞，以免降解RNA。
2.组织，细胞miRNA提取和富集
采用天根生物科技有限公司的生产的miRNA提取试剂盒(DP501),按照操作说明书进行组 织或细胞miRNA提取，最后用50μL的去核酶水溶解RNA，于核酸分光光度仪器Nano Drop2000上分别测定浓度和纯度，
3.组织，细胞miRNA的逆转录及实施荧光定量检测。
后续步骤参照实施例2的步骤2～4，但作以下更改：
①在实施例2步骤2中逆转录反应液的混合液中外源性参照cel-miR-39的特异引物要换 成U6的特异引物，引物的浓度及体积不变；
②后续实时荧光定量的PCR混合液中外源性参照cel-miR-39的特异引物和探针要换成 U6的特异引物和探针。
可应用范围：
基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-520a-3p检测试剂盒及其检测方法可应用于人 类组织、血细胞及体液中细胞hsa-miR-520a-3p表达水平的检测，以上显示和描述了本发明的 基本原理、主要特征和本发明的优点。