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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810934535.4 (22)申请日 2018.08.16 (83)生物保藏信息 CGMCC No. 15770 2018.05.17 (71)申请人 浙江农林大学 地址 311300 浙江省杭州市临安区武肃街 666号 (72)发明人 陈杰袁静黄晓慧 (74)专利代理机构 杭州千克知识产权代理有限 公司 33246 代理人 赵芳李欣玮 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) A01N 63/00(2006.01) A01P 21/00(2006.0。
2、1) C05G 3/00(2006.01) C05F 11/08(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称 一种芽孢杆菌在促进植物生长中的应用 (57)摘要 本发明公开了一种芽孢杆菌在促进植物生 长中的应用。 本发明的芽孢杆菌为特基拉芽孢杆 菌(Bacillustequilensis)， 菌株号： HTTA- X0189， 保藏编号CGMCCNo .15770。 本发明的 HTTA-X0189菌株生物学特性和肥料作用稳定， 培 养方法简便可行， 生产成本低， 容易实现产业化， 且本发明的HTTA-X0189菌株能从多方面促进植 物生长， 并能诱导植物抗盐， 是一。
3、株对植物有多 功能促进作用的菌株， 可减少化肥使用。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 109097302 A 2018.12.28 CN 109097302 A 1.一种芽孢杆菌在促进植物生长中的应用， 其特征在于， 所述特基拉芽孢杆菌 (Bacillus tequilensis)， 菌株号： HTTA-X0189， 保藏编号CGMCC No.15770。 2.根据权利要求1所述的一种芽孢杆菌在促进植物生长中的应用， 其特征在于， 所述应 用包括降解磷、 钾、 植酸。 3.根据权利要求1所述的一种芽孢杆菌在促进植物生长中的应用， 其特征在于， 所述应 用包括将空气中N2还原为NH4。
4、。 4.根据权利要求1所述的一种芽孢杆菌在促进植物生长中的应用， 其特征在于， 所述应 用包括产生吲哚乙酸。 5.根据权利要求1所述的一种芽孢杆菌在促进植物生长中的应用， 其特征在于， 所述应 用包括产生铁。 6.根据权利要求1所述的一种芽孢杆菌在促进植物生长中的应用， 其特征在于， 所述应 用包括诱导植物抗逆或提高植物K+含量。 7.一种化肥， 包含如权利要求1-6任一项所述的芽孢杆菌。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109097302 A 2 一种芽孢杆菌在促进植物生长中的应用 技术领域 0001 本发明属于微生物技术领域， 具体涉及一种芽孢杆菌在促进植物生长中的 应用。 背景技术 0。
5、002 栽培植物是人类赖以生存的保证， 我国地少人多， 使用肥料是提高作物单 位面积 产量的重要措施， 虽然化肥曾在对农作物增产起过重要的作用， 但长期 单纯施用化学肥 料， 使耕地的理化性状渐趋于恶化， 土壤酸化板结， 正常结构 被破坏， 地力下降， 不但直接 影响作物产量和质量， 而且未利用的化肥进入大 气和水体造成二次污染。 纤维素是地球上 分布最广， 但其它生物包括植物无法 直接利用的资源， 我国仅农作物废弃物每年就可高达 0.7109吨， 这些原料大 部分被焚烧， 不但利用率低， 而且给环境保护带来巨大压力。 微生 物可以降解 有毒物质和纤维素， 修复已经污染的土壤， 促进秸秆还田，。
6、 具有双重的经济和 生态价值。 0003 氮、 磷、 钾称之为植物生长必需的三要素， 氮是构成蛋白质的主要成分， 对植物茎 叶的生长和果实的发育有重要作用， 磷能够促进花芽分化根系生长和 改善果实品质。 钾可 调节植物内部细胞水分流动作用， 促进植株茎秆健壮改善 果实品质， 增强植株抗逆能力。 任何一种元素的缺少， 将导致植物的代谢和光 合作用受到干扰和抑制， 造成植株矮小叶片 黄化， 产量低品质差。 微生物肥料 是微生物生命活动产生的酶和有益物质发挥作用， 固氮 微生物通过基因nifH编 码合成固氮还原酶将空气中的N2还原为可以被植物直接吸收利用 的NH4。 土 壤中存在有大量溶解性差， 难。
7、于被植物吸收无机磷和硅酸盐矿物形式的钾， 微 生物由phy基因编码合成的植酸酶， 可以将植物不能利用的植酸转化成植物可 以利用的有 效磷元素。 0004 植物激素对植物生长发育开花结果具有重要的调节控制作用， 没有这些生 长素 的参与植物无法达到供人类食用的标准， 吲哚乙酸(IAA)是一种植物内源 生长素， 参与细 胞生长和形成层分裂等多种生理生化过程的调节与控制， 在植 物生长中不可缺乏， 一些微 生物由ysnE基因编码的 -乙酰转移酶和yhcX基因 合成的 -乙腈水解酶控制产生IAA， 对植 物生长具有很好的补充作用。 0005 自然界中铁元素大多数以不溶解状态存在， 植物难以利用， 铁载。
8、体是一类 具有很 强特异螯合Fe3+的小分子化合物， 许多植物根际益生微生物可通过合成 这类物质来摄取 环境中的铁， 与病原菌争夺铁并将多余的铁提供给植物利用， 达到促进植物生长和控制病 害的双重作用， 铁载体还可螯合锰、 铅、 汞、 铬、 镉等金属离子， 对土壤环境修复、 食品安全 等领域具有重要意义。 0006 我国耕地现有超过0.2亿hm2面积的盐碱地， 并有逐年增加的趋势， 因人 多地少的 国情， 提高盐渍土壤的生产力一直受到从国家到地方政府的大力提倡， 微生物肥料是微生 物在植物附近代谢起作用， 大多为活菌制剂， 来自陆地的微 生物因为盐渍土壤盐分含量较 高， 影响其生长而不能正常发。
9、挥作用， 海洋尤其 极地独特的地理位置和酷寒、 高盐等极端 环境， 造就了微生物的多种适应性生 存， 能更好的在盐渍地发挥作用， 促进植物生长， 诱导 说明书 1/5 页 3 CN 109097302 A 3 植物抗盐。 发明内容 0007 本发明的目的是提供一种芽孢杆菌在促进植物生长中的应用。 0008 本发明的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)保藏于中国微生物菌种保 藏 管理委员会普通微生物中心(CGMCC)， 保藏日期2018年5月17日， 保藏地 址： 中国北京， 菌株 号： HTTA-X0189， 保藏编号CGMCC No.15770。 0009 为了实现上述。
10、目的， 本发明提供如下技术方案： 0010 一种芽孢杆菌在促进植物生长中的应用， 所述特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)， 菌株号： HTTA-X0189， 保藏编号CGMCC No.15770。 0011 进一步地， 所述应用包括降解磷、 钾、 植酸。 0012 进一步地， 所述应用包括将空气中N2还原为NH4。 0013 进一步地， 所述应用包括产生吲哚乙酸。 0014 进一步地， 所述应用包括产生铁。 0015 进一步地， 所述应用包括诱导植物抗逆或提高植物K+含量。 0016 一种化肥， 包含上述芽孢杆菌。 0017 菌株功能基因组中存在phy基因和nifH基因。
11、， 分别为610bp和632bp， 可 合成固氮 还原酶， 具有将空气中N2还原为NH4的固氮能力， 可以将植物不能利 用的植酸， 转化成可以 利用的有效磷元素。 菌株的生物学测试也进一步证实基 因测试结果正确， HTTA-X0189菌株 具有良好的固氮和降解磷钾的作用 0018 从芽孢杆菌HTTA-X0189菌株基因组中扩增到ysnE和yhcX基因片段， 分别 为 1260bp和500bp， 菌株可通过ysnE， yhcX基因控制合成相关酶， 催化生成 促进植物生长吲哚 乙酸IAA， 经L-色氨酸R2A培养基培养， Salkowski比色呈阳 性， 进一步说明菌株可产生吲哚 乙酸IAA。 0。
12、019 菌株在测铁载体CAS上生长良好， 24小时就出现明显的橙黄色晕圈， 随着 培养时 间的延长， 橙黄色晕圈逐渐变大， 48小时后晕圈直径达到25mm， 此时 菌株产铁载体活性达 到了68.7， 具有较强的产铁载体能力。 0020 经基因扩增检测到芽孢杆菌HTTA-X0189菌株存在3个与诱导植物抗逆有关 的 alsD， alsS， alsR基因， 分别为480bp， 870bp和500bp， 可推断菌株具有 诱导植物抗逆的能 力， 植物活体实验进一步证实， 菌株具有良好的诱导植物抗 盐的能力， 菌液处理后的番茄 苗株高平均增长50.1， 根长增长137.5， 鲜重 增加了97.1， 促进。
13、生长效果显著， 番茄 苗的叶绿素含量从处理后第二天开始 升高， 一直持续到第15天， 平均含量比对照增加了 57.4。 0021 经HTTA-X0189菌处理后， 与对照相比， 番茄根、 叶内Na+含量积聚降低了 39.6- 54.5， 根和叶片中K+含量提高了32.6-40.2。 说明菌株可以降低Na+在植物体内的积 聚， 提高植物体内K+含量， 从而不同程度地减轻或缓解盐伤害。 0022 本发明的应用效果在于： HTTA-X0189菌株能从多方面促进植物生长， 并能 诱导植 物抗盐， 是一株对植物有多功能促进作用的菌株， 人工培养发酵成本低， 可减少化肥使用。 说明书 2/5 页 4 CN。
14、 109097302 A 4 附图说明 0023 图1特基拉芽孢杆菌HTTA-X0189菌株亲缘关系分枝树。 具体实施方式 0024 以下具体实施例是对本发明提供的方法与技术方案的进一步说明， 但不应 理解 成对本发明的限制。 0025 实施例1： 芽孢杆菌菌株的分类鉴定 0026 芽孢杆菌HTTA-X0189菌株， 在固体蛋白胨培养基:蛋白胨4g， 酵母粉2g， NaCl,15- 25g， KCl 0.2-0.4g， MgCl27H2O 1.5-2.5g， 水1000ml， pH 7.0， 琼脂 16-19g,25-27培 养2-3天， 观察记录菌落形态、 颜色等变化， 显微镜观察菌 体形态。
15、， 细菌鉴定常规方法测试 其生理生化反应。 菌株经上述方法培养， 利用 细菌16SrDNA基因的通用引物， 常规方法PCR 扩增产物测序， 并通过NCBI的 BLAST程序进行对比， 分析序列同源性及做亲缘关系分枝树 (见图1)比较近缘 种类。 0027 结果证明， 生长正常的特基拉芽孢杆菌HTTA-X0189菌落表面粗糙不透明， 培养初 期菌落为白色， 后期转为褐色， 菌落大而平铺， 不透明， 表面有皱折， 边缘不圆整， 革兰氏染 色阳性， 显微镜下菌体直杆状或近直杆状， 周生鞭毛， 有椭圆形芽孢， 芽孢中生偏侧， 菌体 能运动。 兼性厌氧， 接触酶反应阳性， 精 氨酸双水解酶反应阳性， V。
16、-P反应阴性， 吲哚反应、 H2S反应阴性， 能利用葡萄 糖产酸， 不能使硝酸盐还原为亚硝酸盐。 0028 表1特基拉芽孢杆菌HTTA-X0189菌株的生理生化反应 0029 0030 0031 结合菌落形态、 生理生化反应与分子生物学信息， 参考国内外相关芽孢杆 菌分类 鉴定专著， 鉴定菌株为： 特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis。 0032 实施例2： 菌株的固氮和降解磷钾的相关的基因和作用确定 0033 根据微生物的各种功能都通过基因控制的原则， 先通过NCBI查到固氮还原 酶 nifH基因通用引物和植酸酶phy基因通用引物， 以菌株的基因组DNA为模板， 常规方法P。
17、CR 扩增， 检测菌株是否具有固氮和降解大分子有机磷的能力， 同时 通过已报道的测试微生物 固氮作用培养基(ACC培养基)、 降解钾作用培养基 (MYK培养基)、 降解无机磷作用的培养基 说明书 3/5 页 5 CN 109097302 A 5 (PKO培养基)等培养菌株并观察 其生长情况配合基因检查确定其功能。 0034 结果证明， 通过PCR扩增到菌株的nifH基因片段大小为610bp， 即菌株可 合成固氮 还原酶， 具有将空气中N2还原为NH4的固氮能力。 特异性引物也检测 到菌株基因组中存在 phy基因片段， phy基因片段大小为632bp， 此基因编码 合成的植酸酶， 可以将植物不能。
18、利用 的植酸转化成可以利用的有效磷元素。 菌 株在ACC无氮培养基上可生长较为明显的菌落， 培养5d后菌落直径达16mm， 证实基因测试结果正确， 特基拉芽孢杆菌HTTA-X0189菌株具有 良好的固氮作 用。 0035 同时特基拉芽孢杆菌HTTA-X0189菌株在测试降解钾作用培养基(MYK培 养基)、 降 解无机磷作用的培养基(PKO培养基)上都生长良好， 可产生明显且 较大的透明圈， 这表明 菌落周围培养基中的无机磷和无机钾被菌株降解， 且降 解作用很好 0036 实施例3： 菌株的产生铁载体、 激素和相关的基因 0037 通过与实施例1相同的特异性引物扩增方法， 先检查HTTA-X01。
19、89菌株合成植 物激 素吲哚乙酸IAA的ysnE和yhcX基因和与促进植物抗逆性相关的alsS， alsD， alsR基因， 再通 过培养测试等生物学方法验证， 已报道的测试微生物是否产生 吲哚乙酸IAA的L-色氨酸的 R2A培养基， 是否产铁载体的CAS培养基， 观察生长状 态， 菌液处理测定吸光值(630nm)As (0.2As0.8)， 并计算铁载体单位活性， 铁载体活性(ArAs)/Ar100。 3-1 0038 结果证明， 从特基拉芽孢杆菌HTTA-X0189菌株基因组中扩增到ysnE和yhcX 基因 片段， 大小分别为1260bp和500bp控制合成的ysnE和yhcX基因片段， 。
20、菌 株可通过基因组中 的ysnE， yhcX控制合成相关酶， 由ysnE基因编码的 -乙酰 转移酶， yhcX基因合成 -乙腈水 解酶， 催化生成促进植物生长吲哚乙酸IAA。 0039 经L-色氨酸的R2A培养基发酵培养4d后， 通过Salkowski比色发现， 菌株 反应呈阳 性， 进一步说明菌株可产生吲哚乙酸IAA。 菌株在测铁载体CAS上生 长良好， 24小时就出现 明显的橙黄色晕圈， 随着培养时间的延长， 橙黄色晕圈 逐渐变大， 48小时后晕圈直径达到 25mm， 此时菌株产铁载体活性达到了68.7， 具有较强的产铁载体能力。 0040 实施例4： 菌株诱导植物抗盐能力 0041 用实。
21、施例1相同方法先检测菌体是否存在与诱导植物抗逆有关的alsS， alsD， alsR基因， 然后植物活体检测其效果， 番茄苗经菌液处理后， 种植于人工盐渍 土(NaCl浓度 为0.4)， 设栽种在普通耕作土与无芽孢杆菌处理的盐渍土番茄 苗2个对照， 处理15天后， 常规方法测试株高和根长、 植株鲜重及番茄苗叶绿 素含量， 同时也测定叶片和的根的Na+、 K+含量， 数据用SPSS19.0进行分析(t- 检验， 0.05)。 0042 经基因扩增检测到特基拉芽孢杆菌HTTA-X0189菌株存在3个与诱导植物抗 逆有 关的alsS， alsD， alsR基因， alsD基因片段大小为480bp， 。
22、alsS基因片段大小 870bp， alsR基 因片段大小为500bp， 即可初步推测菌株具有诱导植物抗逆的能 力。 0043 植物活体实验进一步证实， 菌株具有良好的诱导植物抗盐的能力， 对照番 茄苗盐 害表现明显， 叶片失水干枯面积较大， 经菌株处理的番茄苗， 盐害症状 明显减轻， 株高， 根 长及鲜重比对照都有较大的提高， 液处理后的番茄苗株高 平均增长量比对照的增加 50.1， 根长平均增长量比对照的增长137.5， 平均 鲜重增加量比对照增加了97.1， 促 进效果显著， 番茄苗的叶绿素含量从处理 后第二天开始升高， 一直持续到第15天， 叶绿素 平均含量比对照增加了57.4。 说明。
23、书 4/5 页 6 CN 109097302 A 6 0044 表2经芽孢杆菌处理对番茄根叶内Na+、 K+含量的影响 0045 0046 经HTTA-X0189菌处理后， 与对照相比， 番茄根、 叶内Na+含量都有不同程度 的降 低， 与对照相比， Na+在根和叶内的积聚降低了39.6-54.5， 根和叶片中K+含量升高， 根、 叶中K+含量提高了32.6-40.2。 说明菌株可以降低Na+在植物体 内的积聚， 提高植物体 内K+含量， 从而不同程度地减轻或缓解盐伤害， 进一步验 证了基因测试的准确性。 0047 以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。 应当指出， 对于 本技术领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以 对本发明进行若 干改进和修饰， 这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范 围内。 说明书 5/5 页 7 CN 109097302 A 7 图1 说明书附图 1/1 页 8 CN 109097302 A 8 。