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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610847168.5 (22)申请日 2016.09.23 (71)申请人 中国农业科学院生物技术研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12号 (72)发明人 郎志宏张杰杨丽梅李圣彦 汪海黄大昉宋福平 (74)专利代理机构 北京兆君联合知识产权代理 事务所(普通合伙) 11333 代理人 胡敬红 (51)Int.Cl. C12N 15/32(2006.01) C12N 15/84(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (54)发明名称 人。
2、 工 合 成 的 对 鳞 翅 目 害 虫 高 毒 力 的 mcry1Ba、 mcry1Ia基因序列及基因组合 (57)摘要 本发明为 “人工合成的对鳞翅目害虫高毒力 的mcry1Ba、 mcry1Ia基因序列及基因组合” ， 属生 物防治技术领域。 本发明提供的两种对鳞翅目害 虫具有高毒力的Btcry1Ba基因和Btcry1Ia基因 的人工优化、 改造并合成的新的DNA序列(见序列 表SEQIDNO1和SEQIDNO2)， 以利用植物偏好 的密码子序列， 提高Btcry1Ba基因和Btcry1Ia 基因在转基因过程中的转化成功率， 同时提高在 转基因植物中的表达量和稳定表达的特性， 通过 双基。
3、因的组合应用提高基因的杀虫活性。 本发明 利用组成型表达的启动子构建了新的植物表达 载体， 转化率高， 表达量高且稳定， 可用于转基因 植物的研究。 权利要求书1页 说明书6页 序列表3页 附图5页 CN 106318954 A 2017.01.11 CN 106318954 A 1.一种用于植物转化的mcry1Ba的人工合成序列， 其特征是该具有SEQ ID NO 1所示的 核苷酸序列。 2.一种用于植物转化的mcry1Ia的人工合成序列， 其特征是该具有SEQ ID NO 2所示的 核苷酸序列。 3.一种用于植物转化的Bt基因组合， 该组合包含权利要求书1和权利要求2所示人工合 成序列。 。
4、4.一种植物表达载体， 其特征是该植物表达载体含有权利要求1或/和权利要求2所述 的人工合成序列以及一种在大肠杆菌和根癌农杆菌中穿梭的双元载体。 5.根据权利要求4所述的植物表达载体， 所述双元载体为pCAMBIA2300载体。 6.根据权利要求5所述的所述植物表达载体， 命名为pCSm1BN、 pCSm1IN和pCSm1B1IN， 其 结构分别如图1、 图2、 图7所示。 7.权利要求46任一所述植物表达载体在转化植物使之生产抗虫特性方面的应用。 8.根据权利要求7所述的应用， 所述转化的方法为农杆菌介导法， 所述植物为花椰菜。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106318954 A 2 。
5、人工合成的对鳞翅目害虫高毒力的mcry1Ba、 mcry1Ia基因序 列及基因组合 技术领域 0001 本发明属于生物防治技术领域， 特别是涉及人工合成的对鳞翅目害虫高毒力的 mcry1Ba、 mcry1Ia基因序列及基因组合。 背景技术 0002 虫害是世界农作物减产的一个重要因素， 平均每年因此损失粮食总产量的10左 右， 直接经济损失达100亿美元以上。 过去几十年的防治主要依赖化学农药， 在为农业生产 做出巨大贡献的同时， 化学农药却造成了环境污染、 人畜中毒、 生态失衡等严重后果。 在这 些巨大的代价面前， 全球都在寻找和开辟新的病虫害防治策略和技术。 0003 苏云金芽胞杆菌(Ba。
6、cillus thuringiensis,简称Bt)是一种分布极其广泛的革兰 氏阳性细菌。 它在形成芽胞的同时， 能产生蛋白性质的伴胞晶体(parasporal crystal)， 对 鳞翅目(Lepidoptera)、 双翅目(Diptera)、 鞘翅目(Coleoptera)、 膜翅目(Hymenoptera)、 同 翅目(Homoptera)、 直翅目(Orthoptera)、 食毛目(Mallophaga)等多种昆虫， 以及线虫、 螨类 和原生动物具有特异性的杀虫活性(Schnepf E .et al ,1998 ,Microbiology and Molecular Biology 。
7、Review,62(3):775-806)。 这种杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)又称 -内毒素(Delta-endotoxin)， 在昆虫中肠首先溶解， 成为原毒素， 之 后被肠道蛋白酶降解为具有专一活性的毒素， 与中肠上特异的受体进行结合(Craig,2007, Microbiology and Molecular Biology Review,71(2):255 281)， 导致昆虫死亡， 苏云金 芽胞杆菌对人畜无害， 不污染环境， 因而Bt在害虫的生物防治中得到了广泛应用。 0004 目前人们已经克隆了825多种编码杀虫晶体蛋白的Bt。
8、杀虫基因， 它们分属318种模 式基因(可参见http:/www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/ holo2.html)。 0005 1987年， Vaeck等人首次将Bt杀虫晶体蛋白基因转入烟草， 开创了人类利用转基因 技术防治害虫的先河(Vaeck et al,1987， Nature,328:33-37)。 但是在转基因研究中人们 发现将来源于Bt的杀虫蛋白基因直接转入植物， 存在着表达产物不稳定、 表达量少的缺陷 (van Aarssen et al,1995,Plant Molecular Biology,28:513-524。
9、)。 具体问题包括： 1)天 然Bt基因高含AT， 超过60， 在植物体内这样的基因表达的mRNA极易被植物降解； 2)天然Bt 基因中存在类似真核基因的内含子切点、 转录终止子序列， 从而造成转录不完整、 mRNA异常 剪切等； 3)天然Bt基因中使用的密码子与植物存在较大差异， 会造成蛋白翻译效率降低； 4) 天然Bt基因作为原核生物来源的基因， 其结构与植物等真核生物差异显著， 如真核生物含 有5 -UTR序列， 3 末端的polyA尾序列。 因此， 这些关键问题的解决是实现Bt基因在植物中 高效、 稳定表达的重要保证。 随着这些技术的改进和完善， 自1996年来的二十年内， 转基因 抗。
10、虫玉米、 马铃薯、 水稻等作物相继研制成功， 并逐步进入应用阶段(James C， ISAAA Briefs， 2016)。 0006 来源于苏云金芽胞杆菌的杀虫基因cry1Ba和cry1Ia基因被证明对鳞翅目害虫有 说明书 1/6 页 3 CN 106318954 A 3 很强的杀虫活性(Wang et al,Journal of Applied Microbiology,2008,105(5):1536- 1543； 窦黎明等， 农业生物技术学报， 2007， 15(6)： 1053-1057)， 同时发现Cry1Ba蛋白和 Cry1Ia蛋白对Cry1Ac抗性小菜蛾有很好的杀虫活性， 两个。
11、基因组合应用可以增强单基因的 毒力并减缓害虫抗性的产生， 不存在拮抗作用(刘楠等， 植物保护， 2010， 36(2)： 66-70)， 多 个研究组已经将cry1Ia基因、 cry1Ba基因、 两个基因杂合到一个ORF(opening read frame) 和两个基因组合在一起进行转基因植物研究， 也获得了抗虫的转基因植物(张永侠等， 中国 农业科技导报， 2011， 13(1)： 15-19； 崔磊等， 园艺学报， 2009， 36(8)： 128-134； Yi et al, Agricultural Science in China,2011,10(11):1693-1700； Yi。
12、 et al,Plant Cell Tiss Organ Cult ,2013 ,115:419 428； Naimov et al， Applied and Environmental Microiology， 2001， 67(11)： 5328-5330)。 影响外源基因的表达因素很多， 包括不同启动子、 增强子(enhancer)的应用、 基因的密码子优化形式及终止信号识别序列等， 不同的调控元 件及不同的基因密码子序列将会产生不同的转基因事件(event)， 产生的抗虫效果也不尽 相同。 本发明对Bt cry1Ba和cry1Ia的核苷酸序列进行了改造， 并通过人工合成的方式合成 了新。
13、基因， 构建植物表达载体转化植物， 获得了抗虫的转基因蔬菜。 发明内容 0007 本发明的目的是提供两种对鳞翅目害虫具有高毒力的Bt cry1Ba基因和Bt cry1Ia基因的人工优化、 改造并合成的新的DNA序列， 以及其基因组合， 通过转化使植物具 有抗虫特性。 0008 一种用于植物转化的mcry1Ba的人工合成序列， 其特征是该具有SEQ ID NO 1所示 的核苷酸序列。 0009 一种用于植物转化的mcry1Ia的人工合成序列， 其特征是该具有SEQ ID NO 2所示 的核苷酸序列。 0010 一种用于植物转化的Bt基因组合， 该组合包含权利要求书1和2所示基因序列。 0011 。
14、一种植物表达载体， 其特征是该植物表达载体含有权利要求1或/和权利要求2所 述的人工合成序列和一种在大肠杆菌和根癌农杆菌中穿梭的双元载体。 0012 所述双元载体为pCAMBIA2300载体。 0013 所述植物表达载体为pCSm1BN、 pCSm1IN和pCSm1B1IN， 其结构分别如图3、 图4、 图9 所示。 0014 上述植物表达载体在转化植物使之生产抗虫特性方面的应用。 0015 所述转化的方法为农杆菌介导法， 所述植物为花椰菜。 0016 本发明提供的两种对鳞翅目害虫具有高毒力的Bt cry1Ba基因和Bt cry1Ia基因 的人工优化、 改造并合成的新的DNA序列， 以利用植物。
15、偏好的密码子序列， 提高Bt cry1Ba基 因和Bt cry1Ia基因在转基因过程中的转化成功率， 同时提高在转基因植物中的表达量和 稳定表达的特性， 通过双基因的组合应用提高基因的杀虫活性。 0017 本发明利用组成型表达的启动子构建新的植物表达载体， 实验表明， 本发明的构 建的载体转化率高， 表达量高且稳定， 可用于转基因植物的研究。 附图说明 说明书 2/6 页 4 CN 106318954 A 4 0018 图1 Cry1Ba3蛋白结构域预测图 0019 图2 Cry1Ia8蛋白结构域预测图 0020 图3植物表达载体pCSm1BN构建示意图， 0021 图4植物表达载体pCSm1。
16、IN构建示意图， 0022 图5花椰菜转化及再生植株的获得， 0023 其中A预培养时期的外植体； B转化外植体的筛选； C抗性愈伤组织的生成； D转化植 株的生根培养； E转化植株转移至土壤中； F转化植株的获得， 0024 图6转mcry1Ia8基因花椰菜的PCR检测， 0025 其中M DNA分子量Marker； 1以pCSm1IN质粒为模板的PCR扩增； 2以H2O为模板的空 白对照； 3以非转基因花椰菜基因组DNA为模板的PCR扩增； 47以转化植株基因组DNA为模 板的PCR扩增， 0026 图7转mcry1Ba8基因花椰菜的PCR检测， 0027 其中M DNA分子量Marker。
17、； 1以pCSm1BN质粒为模板的PCR扩增； 2以H2O为模板的空 白对照； 3以非转基因花椰菜基因组DNA为模板的PCR扩增； 48以转化植株基因组DNA为模 板的PCR扩增， 0028 图8转基因花椰菜的抗虫性鉴定， 0029 其中A阴性对照花椰菜叶片的抗虫性检测； B转mcry1Ba基因花椰菜叶片的抗虫性 检测； C转mcry1Ia基因花椰菜叶片的抗虫性检测， 0030 图9双基因植物表达载体pCSm1B1IN的构建， 0031 图10转双价基因花椰菜对抗性小菜蛾的生物活性检测， 0032 其中A阴性对照花椰菜叶片被抗性小菜蛾咬食严重； B转mcry1Ba和mcry1Ia基因花 椰菜可。
18、以防止抗性小菜蛾的危害， 0033 图11转mcry1Ba和mcry1Ia基因花椰菜在温室自然发虫情况下未被小菜蛾危害。 具体实施方式 0034 下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。 0035 1、 Bt cry1Ba和cry1Ia基因的密码子优化 0036 Bt cry1Ba3基因(GenBank No.AF368257)是中国农业科学院植物保护研究所张杰 课题组从国内分离的Bt菌株中克隆的基因， 基因的编码区有3684bp， 其编码的蛋白质由 1228个氨基酸残基组成， 通过对Cry1Ba3蛋白序列结构域分析， 存在三个保守的结构域： 结 构域 (Endotoxin_N)、 结构域(。
19、Endotoxin_M)和结构域(Endotoxin_C)(图1)， 保守位点 分别位于蛋白的第90位氨基酸270位氨基酸、 第278位氨基酸第489位氨基酸， 第490位 氨基酸第636位氨基酸， 不同的结构域行使不同的功能， 例如， 结构域 穿膜及孔洞的形 成， 结构域和结构域与昆虫中肠上皮受体结合及杀虫活性的发挥， 除保守的结构域以 外， 有些区段并不是Bt蛋白发挥功能所必需的。 对N端的90个氨基酸进行分析， 在第1位和第 22位都存在着起始密码子M， 与其他已知的cry1B基因序列比较发现， 第22位起始密码子可 以正确启动基因的表达， 并且在121位氨基酸区段不包含活性发挥必需区段。
20、， 所以新改造 的基因从Cry1Ba3的22位起始。 对C端636位1228位氨基酸进行序列分析， 该序列在Bt Cry 蛋白之间是保守序列(https:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/blastp)， 与蛋白活性的发挥没 说明书 3/6 页 5 CN 106318954 A 5 有直接作用。 由于在做植物转基因研究时， 如果转入的外源基因较大， 会影响基因的转化效 率和表达水平， 所以根据cry1Ba3的序列分析， 进行基因改造时选用了第22位667位之间 的序列， 并在基因的3 端增加了6个氨基酸的SEKDEL内质网滞留信号， 维持蛋白的稳定性。 按照植物偏好的密码子对截短。
21、的cry1Ba3基因序列的646个氨基酸和内质网滞留信号的6个 氨基酸的编码序列进行了优化， 改造基因的GC含量为48， 与原始cry1Ba3核酸序列的相似 性为86.27， 核酸序列见SEQ ID NO 1。 0037 Bt cry1Ia8基因是从国内分离的Bt菌株Btc008中克隆的杀虫基因， 该编码蛋白由 719个氨基酸组成， 该基因对玉米螟(Ostrinia furnacalis)和小菜蛾(Plutella xylostella)具有高毒力,对大豆食心虫(Leguminivora glycinivorella)等害虫也有一定 的毒杀效果(窦黎明等， 苏云金芽胞杆菌cry1Ia基因的克隆。
22、、 表达与活性研究， 农业生物技 术学报， 2007,15 (6):10531057)。 对Cry1Ia8蛋白的保守结构域进行分析(图2)， 结构域 (Endotoxin_N)、 结构域(Endotoxin_M)和结构域(Endotoxin_C)的保守位点分别位于 蛋白的第76位氨基酸279位氨基酸、 第287位氨基酸第497位氨基酸， 第498位氨基酸 第644位氨基酸， 对cry1Ia全长基因2157个核苷酸按照植物偏好的密码子进行了密码子优 化， 并进行了人工合成， 在基因的3 端增加了6个氨基酸的内质网滞留信号SEKDEL， 改造后 的基因GC含量为47， 与原始cry1Ia8的核酸序。
23、列的相似性为83.79， 核酸序列见SEQ ID NO 2。 0038 2、 植物表达载体的构建 0039 在人工合成的mcry1Ba和mcry1Ia基因的两端分别增加了多克隆位点， 5 端含有 HindIII、 XbaI、 SmaI和NcoI， 3 端含有KpnI、 XhoI、 SacI和EcoRI， 合成的基因构建到pUC57载 体， 分别称为pUmIa和pUm1Ba(质粒保存在中国农业科学院生物技术研究所郎志宏课题组， 可以向公众提供)。 用Nco 和Kpn 双酶切质粒pUmIa和pUm1Ba， 分别回收2Kb和2.1Kb的片段， 连接到用同样酶切的pU2mG2载体上(质粒保存在中国农业。
24、科学院生物技术研究所郎志宏课 题组， 可以向公众提供)， 引入68bp的烟草花叶病毒元件和Kozak序列， 获得的载体称为 pUKmIa和pUKmBa， pE35SN是一个中间载体， 载体含有两个enhancer的CaMV35S启动子和一个 nos终止子(质粒保存在中国农业科学院生物技术研究所郎志宏课题组， 可以向公众提供)， 用BamH 和Kpn 双酶切pUKmIa和pUKmBa， 回收2Kb和2.1Kb的片段， 连接到用同样酶切的 pE35SN上， 再将两个载体的表达盒转入pCAMBIA2300载体上(pCAMBIA2300是一个商用载 体)， 构建获得的载体称为pCSm1BN和pCSm1。
25、IN(载体构建示意图见图3和图4)。 0040 3、 转基因花椰菜的获得 0041 用农杆菌转化法将构建的pCSm1BN和pCSm1IN转化花椰菜， 转化方法是常规的农杆 菌转化双子叶植物方法， 首先将预培养两天的花椰菜的具柄子叶和下胚轴切下(图5A)， 经 农杆菌侵染后在黑暗中共培养2d， 再用MS盐(Murashigea&Skoog培养基)冲洗后， 将其移至 在附加羧苄青霉素的延迟培养基(MS盐+2mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA(萘乙酸)+28mg/L sugar(蔗糖)+7g/L agar(琼脂)+300mg/L Cab(羧苄青霉素),pH 5.8)一周， 然后转入筛选 培。
26、养基(MS盐+2mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+28mg/L sugar+7g/L agar+10mg/L Kan+300mg/L Cab,pH 5.8)中， 经过23周的筛选， 大部分外植体褐化死亡(图5B)， 少部分在外植体伤口 附近产生肉眼可见的不定芽(图5C)， 待不定芽长成幼苗的过程中绝大多数再生芽白化或者 变紫， 最终死亡。 抗性植株则能在选择培养基上始终保持绿色、 正常生长状态， 最终生根培 说明书 4/6 页 6 CN 106318954 A 6 养成苗(图5D)。 将生根状态良好的植株在温室炼苗12d后， 移入营养钵中(图5E)， 保湿， 待 苗子成活后移到大花。
27、盆生长(图5F)， 获得抗性植株。 0042 4、 转基因植株PCR鉴定 0043 提取转化植株的基因组DNA， 按照mcry1Ia和mcry1Ba序列设计引物， 扩增mcry1Ia 基因的特异引物序列： 上游引物mcry1IaF为： 5 -GTTTGTTAGTGCCTCCACC-3 ， 下游引物 mcry1IaR为： 5 -GATAGAAGTGTTAGTAGAGCCTT-3 ， 预扩增的片段大小为999bp； 反应条件为： 0044 0045 反应程序： 955min； 9430s， 5430s， 7245s， 35cycles； 7210min， 4 pause， PCR产物结果图见图6。。
28、 0046 扩 增 m c r y 1 B a 基 因 的 特 异 引 物 序 列 ： 上 游 引 物 m c r y 1 B a F 为 ： 5 - AATCCTTGGCGTATTGGGTG-3 ， 下游引物mcry1BaF为： 5 -GATGCCATGTTGACACCTG-3 ， 扩增产物 长度为720bp。 0047 反应体系如下： 0048 0049 反应程序： 955min； 9430s， 5130s， 7245s， 35cycles； 7210min， 4 pause， PCR产物结果图见图7。 0050 在转mcry1Ia基因的花椰菜转化中， 由于新合成的mcry1Ia基因与原基。
29、因相比较， 在N端和C端共有1746bp序列的截短， 可以保证基因表达的稳定性， 如果基因过长， 易产生断 裂或者被内源核酸酶识别而降解， 检测了转mcry1Ia基因的转化植株18株， 有14株为转基因 阳性植株， 阳性率为78， 而转cry1Ia基因花椰菜的阳性转化率是60(张永侠等， 中国农 业科技导报， 2011， 13(1)： 15-19)， 提高了转基因的阳性率， 保证了基因正确表达。 在转 mcry1Ba基因的花椰菜的转基因阳性率为82.5(40株转化植株， 33株阳性植株)， 选用植物 偏好的密码子、 减少真核生物可以识别的剪切点、 终止信号， 可以使表达的外源基因正确转 说明书。
30、 5/6 页 7 CN 106318954 A 7 录并维持基因稳定， 可以提高转基因效率。 0051 5、 转基因花椰菜的抗虫性鉴定 0052 挑选虫体大小一致的2龄末期小菜蛾， 用转基因植株与对照植株的离体叶片饲喂。 发现饲喂6d后， 转基因植株大部分表现出明显的抗虫性， 其叶片仅被取食几个小孔后， 幼虫 成黑色中毒状态死亡， 少数未死亡幼虫但仍处于二龄末期三龄初期， 呈现一种僵化状态， 对 叶片不再有损害。 而非转基因植株(CK-)的叶片对小菜蛾完全没有抗虫作用， 其叶片的大部 分被取食， 试验结束时只留下叶脉和极少量的叶片(图8)。 对获得的14株转mcry1Ia基因花 椰菜用离体叶片。
31、饲喂小菜蛾， 校正死亡率在92.44.4100之间， 最抗虫材料对小菜 蛾的杀虫活性达到100， 无不抗虫材料。 在前期研究中， 转cry1Ia基因的花椰菜在抗虫上 差异很大， 有些材料对小菜蛾的校正死亡率达到100， 但是有些转基因材料因外源基因未 正确表达而表现出完全不抗虫， 利用植物偏好密码子优化原核生物来源的基因可以使基因 更易被受体植物接受， 可以稳定提高基因的表达量， 从而保证高表达植株的比例。 转 mcry1Ba基因花椰菜也表现出同样的结果， 在对获得的33株阳性植株中随机选取了10株进 行小菜蛾生物活性检测， 10株小菜蛾均具有抗虫性， 校正死亡率在91.56.7100之 间，。
32、 没有外源基因沉默现象。 通过转基因植物研究证明mcry1Ba基因和mcry1Ia基因可以用 于抗虫植物的培育。 0053 6、 转mcry1Ba和mcry1Ia双基因抗虫花椰菜的获得 0054 将pCSm1BN用HindIII和EcoRI双酶切， 回收3.2Kb的片段， 并利用Klenow酶补平， 将 pCSm1IN用HindIII酶切， 用Klenow酶将切口补平， 用T4DNA连接酶连接， 获得了含有mcry1Ba 和mcry1Ia双基因的载体pCSm1B1IN， 载体示意图见9。 0055 将载体pCSm1B1IN利用农杆菌转化法获得转双基因的花椰菜， 取转基因花椰菜叶 片置于培养皿中。
33、， 叶柄处用浸湿的棉花包裹保湿， 非转基因花椰菜作为对照， 将11头2日龄 对Cry1Ac蛋白产生2000倍抗性的小菜蛾接种于培养皿中， 96小时后观察结果， 如图10所示， 转双基因花椰菜对抗性小菜蛾有很好的杀虫活性， 双价基因的抗虫效果是两个单基因抗虫 效果的累积， 供试小菜蛾的校正死亡率达到100。 0056 将转基因花椰菜培育在温室里， 在自然发虫的情况下， 转基因花椰菜表现出很强 的杀虫活性(图11)， 结果表明mcry1Ba和mcry1Ia基因组合可以用于抗虫植物的培育。 说明书 6/6 页 8 CN 106318954 A 8 0001 序列表 1/3 页 9 CN 106318954 A 9 0002 序列表 2/3 页 10 CN 106318954 A 10 0003 序列表 3/3 页 11 CN 106318954 A 11 图1 图2 图3 说明书附图 1/5 页 12 CN 106318954 A 12 图4 图5 说明书附图 2/5 页 13 CN 106318954 A 13 图6 图7 图8 说明书附图 3/5 页 14 CN 106318954 A 14 图9 图10 说明书附图 4/5 页 15 CN 106318954 A 15 图11 说明书附图 5/5 页 16 CN 106318954 A 16 。