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大豆种子总蛋白质的提取方法及其专用试剂.pdf

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文档编号：8955579

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1、(10)申请公布号 CN 103897018 A (43)申请公布日 2014.07.02 CN 103897018 A (21)申请号 201210576800.9 (22)申请日 2012.12.26 C07K 1/30(2006.01) C07K 1/14(2006.01) (71)申请人中国科学院植物研究所地址 100093 北京市海淀区香山南辛村 20 号 (72)发明人曲乐庆徐秀苹 (74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 代理人关畅 (54) 发明名称大豆种子总蛋白质的提取方法及其专用试剂 (57) 摘要本发明公开了大豆种子总蛋白质的提取方法。

2、及其专用试剂。所述方法包括如下步骤： 1）取大豆种子和溶液 S1 按 1g:3ml 的比例混合提取蛋白质，收集所有物质获得混合物甲； 2）向步骤 1）的所述混合物甲中加入与步骤 1）所述溶液 S1 体积相同的溶液 S2 再提取蛋白质，收集所有物质获得混合物乙； 3）将步骤 2）所述混合物乙离心，取上清液用三氯乙酸沉淀，获得所述大豆种子总蛋白质。所述溶液 S1 和 S2 为专用试剂。使用本发明方法及试剂提取大豆种子蛋白质量较好，纯度较高，在进行双向电泳分析时可得到 900 个蛋白点，一些低分子量、低丰度蛋白清晰可见。通过质谱可鉴定 363。

3、个蛋白点，远远高于现已报道的其他方法。本发明对植物蛋白质组学的研究具有重大的应用价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 6 页附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书6页附图3页 (10)申请公布号 CN 103897018 A CN 103897018 A 1/1 页 2 1. 一种提取大豆种子总蛋白质的方法，包括如下步骤： 1）取大豆种子和溶液 S1 按 1g:3ml 的比例混合提取蛋白质，收集所有物质获得混合物甲； 2）向步骤 1）的所述混合物甲中加入与步骤 1）所述溶液 S1 体积。

4、相同的溶液 S2 再提取蛋白质，收集所有物质获得混合物乙； 3）将步骤 2）所述混合物乙离心，取上清液用三氯乙酸沉淀，获得所述大豆种子总蛋白质；所述溶液 S1 的溶剂为水，溶质为蔗糖、 Tris-HCl、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、苯甲基磺酰氟和 - 巯基乙醇，所述蔗糖、 Tris-HCl、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、苯甲基磺酰氟和 -巯基乙醇在所述溶液S1中的浓度分别为170g/L、 40mmol/L、 20mmol/L、 2mmol/L和5%体积百分含量；所述溶液 S1 的 pH 值为 7.5 ；所述溶液 S2 的溶剂为水，溶质为蔗糖、 Tris-HCl。

5、、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、苯甲基磺酰氟和聚乙二醇辛基苯基醚，所述蔗糖、 Tris-HCl、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、苯甲基磺酰氟和聚乙二醇辛基苯基醚在所述溶液 S2 中的浓度分别为 170g/L、 40mmol/L、 20mmol/L、 2mmol/L 和 4% 体积百分含量；所述溶液 S2 的 pH 值为 7.5。 2. 根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于：步骤 1）中所述提取包括将所述大豆种子和所述溶液 S1 进行研磨的步骤，该研磨的时间为 812 分钟，如 10 分钟；和 / 或，步骤 2）中所述提取包括将所述混合物甲和所述溶液 S2 进行研磨。

6、的步骤，该研磨的时间为 812 分钟，如 10 分钟。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法，其特征在于：步骤 3）中所述离心的相对离心力为 10000g，离心时间为 10 分钟。 4.根据权利要求13中任一所述的方法，其特征在于：步骤3）中所述取上清液用三氯乙酸沉淀中三氯乙酸的使用终浓度为 10% 体积百分含量，所述沉淀的时间为 2535 分钟，如 30 分钟。 5. 根据权利要求 14 中任一所述的方法，其特征在于：步骤 3）中所述用三氯乙酸沉淀后，还包括将所述沉淀用溶液 S3 洗涤的步骤；所述溶液 S3 为二硫苏糖醇的丙酮溶液，所述。

7、溶液 S3 中二硫苏糖醇的含量为 2 克 / 升。 6. 根据权利要求 5 所述的方法，其特征在于：所述用溶液 S3 洗涤按每克所述大豆种子加 5mL 所述溶液 S3 的比例进行，所述洗涤的次数为 4 次以上。 7. 植物总蛋白质的提取试剂或试剂盒，包括分别独立包装的权利要求 1 中的所述溶液 S1 和所述溶液 S2。 8. 根据权利要求 7 所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒包括独立包装的权利要求 5 中的所述溶液 S3。 9. 权利要求 7 或 8 所述试剂或试剂盒在提取植物总蛋白质中的应用。 10. 根据权利要求 9 所述的应用，其特征在于：所述植。

8、物为大豆，所述提取的器官为所述大豆的种子。权利要求书 CN 103897018 A 2 1/6 页 3 大豆种子总蛋白质的提取方法及其专用试剂技术领域 0001 本发明涉及一种大豆种子总蛋白质的提取方法及其专用试剂。背景技术 0002 大豆是我国和世界上重要的经济作物，其种子油是人类与动物营养以及食品加工业植物食用油的重要来源，大豆油用量占全世界食用油的 31%。同时，大豆种子也包含丰富的蛋白，是世界上植物蛋白的主要来源。鉴定大豆种子表达全蛋白，对于进一步解析大豆种子中蛋白和油积累机制有重要的参考作用。 0003 蛋白质是基因表达的产物，也是许多生理功能的。

9、主要执行者和体现者，随着功能基因组学的兴起，蛋白质组学（Proteomics）已成为生命科学研究的重点之一。蛋白质组学研究的宗旨是对组织或细胞的所有蛋白质（至少是大部分）进行分离与鉴定。通过蛋白质组的分析可以检测生命活动变化过程中蛋白表达量及翻译后修饰等变化，从而阐明其生物学功能的分子机制。蛋白样品的提取和制备是进行蛋白质组学分析的关键步骤，蛋白样品的纯度和再溶性直接影响双向电泳分离结果的清晰度和重复性。经典双向电泳（2-DE）的分离方法与程序主要适用于模式植物拟南芥与重要经济作物水稻的全蛋白分析。Toorchi 等（J.Proteome Res.,2008,。

10、7:3035-3041）用三种不同的蛋白提取方法和两种裂解液对水稻和大豆的各种组织进行蛋白质组学分析，结果发现：大豆蛋白质组凝胶图谱的蛋白点数比水稻的少；蛋白提取方法与裂解液配方的不同严重影响大豆蛋白的溶解与分离；大豆和水稻对所有裂解液配方的敏感性不同。由此可见，探索、优化大豆各种组织器官蛋白样品制备的方法与程序是其蛋白质组学发展的前提与基础。 0004 大豆种子含有大约 36% 蛋白质、 30% 碳水化合物、 20% 油脂、 9% 粗纤维和 5% 灰分。另外，在大豆种子中还存在大量的次生代谢产物。大豆次生代谢产物、脂质、大量碳水化合物及酚类混合物等干扰。

11、物质的广泛存在不仅妨碍高质量蛋白样品的提取，也影响 2-DE 胶的分离效果，是导致条纹和污渍产生、影响高清晰度蛋白点数目的主要原因。高纯度大豆全蛋白样品的获得是大豆蛋白质组成功的关键。 0005 目前，在关于成熟大豆种子蛋白质组学研究的相关报道中， Mooney 等 (Phytochemistry 2004,65,1733-1744)和Barbosa等(Planta 1988,175,485-492)分别鉴定了 44 个和 192 个蛋白点；另两个研究 (Natarajan,et al.,Anal.Biochem.2009,394。

12、,259 -268;Krishnan,et al.,Proteomics 2009,9,3174-88) 通过去掉成熟大豆种子的高丰度储藏蛋白，分别鉴定到 107 个和 196 个蛋白点。但是大豆成熟种子中的蛋白远不止这些，进一步鉴定到更多的蛋白将会为大豆种子发育、成熟以及萌发等提供更多的参考资料。发明内容 0006 本发明的一个目的是提供一种提取大豆种子总蛋白质的方法，包括如下步骤： 0007 1）取大豆种子和溶液 S1 按 1g:3ml 的比例混合提取蛋白质，收集所有物质获得混合物甲；说明书 CN 103897018 A 3 2/6 页 4 0008 2）向。

13、步骤 1）的所述混合物甲中加入与步骤 1）所述溶液 S1 体积相同的溶液 S2 再提取蛋白质，收集所有物质获得混合物乙； 0009 3）将步骤 2）所述混合物乙离心，取上清液用三氯乙酸沉淀，获得所述大豆种子总蛋白质； 0010 所述溶液 S1 的溶剂为水，溶质为蔗糖、 Tris-HCl、乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）、苯甲基磺酰氟（PMSF）和 - 巯基乙醇，所述蔗糖、 Tris-HCl、 EGTA、 PMSF 和 - 巯基乙醇在所述溶液 S1 中的浓度分别为 170g/L、 40mmol/L、 20mmol/L、 2mmol/L 和 5% （体积百。

14、分含量）；所述溶液 S1 的 pH 值为 7.5 ； 0011 所述溶液 S2 的溶剂为水，溶质为蔗糖、 Tris-HCl、 EGTA、 PMSF 和聚乙二醇辛基苯基醚 (TritonX-100)，所述蔗糖、 Tris-HCl、 EGTA、 PMSF 和 TritonX-10 在所述溶液 S2 中的浓度分别为 170g/L、 40mmol/L、 20mmol/L、 2mmol/L 和 4%（体积百分含量）；所述溶液 S2 的 pH 值为 7.5。 0012 在上述方法中，步骤 1）中所述提取包括将所述大豆种子和所述溶液 S1 进行研磨的步骤，该研磨的时间为 812 分。

15、钟，如 10 分钟； 0013 和 / 或，步骤 2）中所述提取包括将所述混合物甲和所述溶液 S2 进行研磨的步骤，该研磨的时间为 812 分钟，如 10 分钟； 0014 所述研磨的温度为 0 ； 0015 在上述方法中，步骤 3）中所述离心的相对离心力可为 10000g，离心时间为 10 分钟；所述离心的温度为 4。 0016 在上述方法中，步骤 3）中所述取上清液用三氯乙酸沉淀中三氯乙酸的使用终浓度为 10% 体积百分含量，所述沉淀的时间为 2535 分钟，如 30 分钟；所述沉淀的温度条件为 0。 0017 在上述方法中，步骤 3）中所述用三。

16、氯乙酸沉淀后，还包括将所述沉淀用溶液 S3 洗涤的步骤；所述溶液 S3 为二硫苏糖醇（DTT）的丙酮溶液，所述溶液 S3 中，二硫苏糖醇的含量为 2 克 / 升。 0018 在上述方法中，所述用溶液 S3 洗涤是按每克所述大豆种子加 5mL 所述溶液 S3 进行洗涤，所述洗涤的次数为 4 次以上。 0019 本发明的另一个目的是提供一种植物总蛋白质的提取试剂或试剂盒，包括分别独立包装的所述溶液 S1 和所述溶液 S2。 0020 在上述试剂或试剂盒中，还可包括独立包装的所述溶液 S3。 0021 当然，上述植物总蛋白质的提取试剂或试剂盒可只由所述溶液 S1、所。

17、述溶液 S2 和所述溶液 S3 组成。 0022 本发明保护所述试剂或试剂盒在提取植物总蛋白质中的应用。 0023 在上述应用中，所述植物可为大豆，所述提取的器官具体可为所述大豆的种子。 0024 大豆种子中含有高丰度的 7S 和 11S 蛋白，掩盖了低丰度种子蛋白的提取和分析。使用本发明的方法和试剂提取大豆种子蛋白质量较好，纯度较高，在进行双向电泳分析后共得到 900 个蛋白点，一些低分子量、低丰度蛋白清晰可见。通过串联质谱分析，共鉴定到大豆种子中的 363 个蛋白点，远远高于现已报道的其他方法。本发明对植物蛋白质组学的研究具有重大的应用价值。说明书 CN 。

18、103897018 A 4 3/6 页 5 附图说明 0025 图 1 为本发明方法提取大豆种子总蛋白质的双向电泳图。 0026 图 2 为对照 1 提取大豆种子总蛋白质的双向电泳图。 0027 图 3 为对照 2（普通酚法）提取大豆种子总蛋白质的双向电泳图。 0028 图 4 为酶解一个蛋白点获得的 MALDI-TOF/TOF 二级质谱图。其中，横坐标为核质比，纵坐标为相对离子丰度。 0029 图 5 为将一个质谱数据利用 Mascot 软件在 NCBI 数据库中进行检索鉴定的结果。具体实施方式 0030 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 0031 下述实。

19、施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 0032 实施例 1、大豆种子总蛋白质的提取 0033 一、本发明的提取方法和试剂 0034 取 0.4g 大豆成熟种子中黄 13 （王连铮，赵容娟，农业科技通讯， 2005， 6 ： 40），砸碎，加入 1.2ml 溶液 S1, 冰上研磨 10 分钟，再加入 1.2ml 溶液 S2，继续研磨 10 分钟；将所有研磨物移至离心管中， 4、 10000g、离心 10 分钟；取上清液加入终浓度为 10% 的三氯乙酸，冰上放置半小时； 4、 15000g、离心 10 分钟，取沉淀加 2mL 溶。

20、液 S3 进行洗涤，共洗涤四次（多次大体积洗涤沉淀，可最大限度去除蛋白中的杂质），将沉淀在超净台内吹干，获得总蛋白质， -20保存。 0035 所述溶液 S1 的溶剂为水，溶质为蔗糖、 Tris-HCl、 EGTA（乙二醇二乙醚二胺四乙酸）、 PMSF（苯甲基磺酰氟）和 - 巯基乙醇，所述蔗糖、 Tris-HCl、 EGTA、 PMSF 和 - 巯基乙醇在所述溶液 S1 中的浓度分别为 170g/L、 40mmol/L、 20mmol/L、 2mmol/L、和 5% 体积百分含量；所述溶液 S1 的 pH 值为 7.5。 0036 所述溶液 S2 的溶剂为水。

21、，溶质为蔗糖、 Tris-HCl、 EGTA（乙二醇二乙醚二胺四乙酸）、 PMSF（苯甲基磺酰氟）和 TritonX-100( 聚乙二醇辛基苯基醚 )，所述蔗糖、 Tris-HCl、 EGTA、 PMSF 和 TritonX-100 在所述溶液 S2 中的浓度分别为 170g/L、 40mmol/L、 20mmol/L、 2mmol/L 和 4% 体积百分含量；所述溶液 S2 的 pH 值为 7.5。 0037 所述溶液 S3 为二硫苏糖醇（DTT）的丙酮溶液，所述溶液 S3 中，二硫苏糖醇的含量为 2 克 / 升。 0038 二、对照 1 0039 取 0.4g 大。

22、豆成熟种子中黄 13，砸碎，加入 1.5ml 所述溶液 S1, 冰上研磨 10 分钟，再加入 1.5ml 所述溶液 S2，继续研磨 10 分钟；将所有研磨物移至离心管中， 4、 10000g、离心10分钟；取上清液加入终浓度为10%的三氯乙酸，冰上放置半小时； 4、 15000g、离心10 分钟，取沉淀加 2mL 所述溶液 S3 进行洗涤，共洗涤四次，将沉淀在超净台内吹干，获得总蛋白质， -20保存。 0040 三、对照 2（普通酚法） 0041 取大豆成熟种子中黄13的籽粒1粒，加5倍体积提取缓冲液（0.1mol/L Tris-HCl （pH8.8）。

23、 ,10mmol/L EDTA,0.4% 体积百分含量的 - 巯基乙醇， 0.9mol/L 蔗糖 ,0.5%PVP）说明书 CN 103897018 A 5 4/6 页 6 研磨； 12000r/min 离心 10min，取上清液，加入等体积的水饱和酚（pH8.0），充分振荡，静置 10min 后， 12000r/min 离心 5min ；取酚相液体，加入 5 倍体积 0.1mol/L 乙醇铵，置于 -20 下 30min， 12000r/min 离心 10min，去上清，充分洗涤沉淀 4 次以上，除尽乙醇铵，冷冻抽干，所得干粉为粗蛋白，即总蛋白质。 00。

24、42 实施例 2、蛋白质双向电泳、染色及凝胶扫描分析 0043 将实施例 1 获得的总蛋白质、和分别进行蛋白质双向电泳、染色及凝胶扫描分析，结果分别如图 1、图 2 和图 3 所示。图 1 中蛋白点分散较好，横纹和纵纹较少，蛋白点较多，共得到蛋白点 900 个；由于研磨时产生较多气泡，导致蛋白氧化、降解，图 2 中双向电泳结果有较多横纹和纵纹，共得到蛋白点 530 个；图 3 中共得到蛋白点 410 个。 0044 上述蛋白质双向电泳及凝胶染色获得图 1-3 结果的具体方法如下： 0045 1、第一向等电聚焦电泳 0046 取 6mg 总蛋白质、或。

25、，加入 200l 的 lysis buffer（含 7mol/L 的尿素（urea）， 2mol/L 的硫代尿素（thoiurea）， 4%（w/v） CHAPS， 2%Ampholine（pH3.5-10）， 1%（w/ v） DTT），震荡器上震荡溶解后， 15000g、 4、离心 0.5 小时，取上清液用于上样。使用 IPG 预制胶条（11cm， pH47， GE 公司，货号 18-1016-60）在 20下进行等电聚焦电泳： 300V1 小时， 600V1 小时 ,1000V1 小时， 8000V5 小时。 0047 2、第二向 SDS-PAGE 电泳。

26、0048 步骤 1 的等电聚焦完成后，将 IPG 胶条取出，用滤纸吸去附着的矿物油，放在平衡缓冲液 a（1%DTT， 50mM/L Tris-HCl,6M/L 尿素， 30% 甘油， 2.5%SDS）中，置于摇床上平衡 15min 后，转入平衡缓冲液 b（2.5% 碘乙酰胺 ,50mM/L Tris-HCl,6M/L 尿素， 30% 甘油， 2.5%SDS）中平衡 15min。将平衡好的胶条转移到第二向垂直板胶（16% 分离胶， 4% 浓缩胶）的上端，用 1% 的琼脂糖密封，使用电泳液（pH 为 8.8）恒定电流 25mA 下进行 SDS-PAGE 凝胶电泳 4 。

27、小时。 0049 所述 16% 分离胶中含 16% 丙烯酰胺 - 甲叉双丙烯酰胺、 0.37M/L Tris、 0.1%SDS、 0.1%TEMED 和 0.07% 过硫酸胺； 0050 所述 4% 浓缩胶中含 4% 丙烯酰胺 - 甲叉双丙烯酰胺， 0.1M/L Tris,0.1%SDS， 0.3%TEMED 和 0.05% 过硫酸胺； 0051 所述电泳液中含 0.3%Tris、 1.44g/L 甘氨酸和 0.1%SDS。 0052 3、凝胶染色和脱色 0053 电泳完成后，取下凝胶，置于固定液中固定 40min ；将固定好的凝胶置于考马斯亮蓝 R250 染色液中，室温染色。

28、45min 以上；倒出染色液，加入脱色液脱色 30 分钟后更换脱色液，继续脱色 2 小时左右，其间更换数次脱色液，至凝胶背景合适，蛋白点鲜明为止。固定、染色以及脱色过程均在脱色摇床上晃动进行。 0054 所述固定液中含 40% 乙醇和 10% 乙酸。 0055 所述考马斯亮蓝 R250 染色液中含 0.116% 考马斯亮蓝 R250,25% 乙醇和 8% 乙酸。 0056 所述脱色液中含 25% 乙醇和 8% 乙酸。 0057 4、蛋白质凝胶的扫描及图像分析 0058 将步骤 3 处理后的凝胶用 UMAX Power Look2100XL 扫描仪 (Ma。

29、xium Tech,Taipei,China)直接扫描，扫描参数设置为256阶灰度、 300dpi透射扫描，图像保存为说明书 CN 103897018 A 6 5/6 页 7 TIF 格式。扫描后的图像用 ImageMaster 2D Platinum 软件（Amersham Bioscience）进行分析，将处理和对照的凝胶（每个处理三张凝胶）用软件转换成*.mel的文件，输入到软件界面。调整最佳的对比度。检测点的参数设定为 Smooth5， Min Area 50 和 Saliency2，进行点的检测，统计每张凝胶中的蛋白点个数。将检测到的蛋白点标记、挖胶。

30、，进行实施例 3 的质谱分析。 0059 实施例 3、蛋白点的质谱分析 0060 将实施例 1 获得的总蛋白质经实施例 2 电泳及分析获得的蛋白点（共 900 个）分别进行质谱分析，共鉴定到 363 个蛋白点，其中使用 MALDI TOF MS 鉴定到 126 个蛋白点 , 使用 MALDI-TOF/TOF 鉴定到 172 个蛋白点，使用 LC-MS/MS 鉴定到 65 个蛋白点，具体方法如下： 0061 1、胶内酶解 0062 将含目的蛋白点的凝胶块切成 1mm2左右的小块，加脱色液（50% 乙腈， 50mM NH4HCO3） 800l， 40脱色 2 小时，。

31、中间更换一次脱色液。吸去脱色液，用 200l HPLC 水冲洗，震荡 1min，之后吸去 HPLC 水，再加 200l HPLC 水冲洗，震荡 1min。吸去 HPLC 水，将胶块真空干燥后，加入 1520l 胰蛋白酶工作液（0.1U/l,Promega，货号 :V5280）， 4 放置 0.5 小时，以使干胶块充分吸胀。37酶解 16 小时，获得酶解液保存于 -20下备用。 0063 2、质谱鉴定 0064 将步骤 1 获得的酶解液与饱和的基质溶液（溶质为 - 氰基 -4- 羟基肉桂酸，溶剂为 1三氟乙酸和 50% 乙腈）均匀混合，在点样板上共结晶后用。

32、MALDI-TOF-MS 质谱仪 (Shimadzu Biotech,Kyoto,Japan) 或 MALDI-TOF/TOF 质谱仪 (UltrafleXtreme,Bruker Daltonics,Billerica,MA,USA)或LC-MS/MS质谱仪(Waters Ltd.,Manchester,UK)进行串联质谱分析，具体操作按照说明书进行。图 4 为酶解其中一个蛋白点，经 MALDI-TOF/TOF 质谱仪分析，获得的 VPSGTTYYVVNPDNNENLR 肽段的二级质谱图，数据库检索匹配情况良好，其中 y 离子系列可以全部检出。 0065 3、蛋白质数据。

33、库检索 0066 将经步骤 2 质谱分析后得到肽质量指纹图谱（peptide mass fingerprinting,PMF）数据，利用 Mascot 软件（Matrix Science Ltd.,London,UK）在 NCBI 数据库中进行检索鉴定蛋白。对于检索的结果，软件提供一个可信度分值（MOWSE Score），当检索到的蛋白分值大于该值时结果是可信的（即在 p 0.05 水平显著）。当出现多个大于标准可信度分值的结果时候，选取得分最大的结果，同时参考其匹配肽段的序列覆盖率（sequence coverage）以及分子量。

34、、等电点等参数来加以确定。 0067 图 5 为图 4 所做质谱蛋白点经 Mascot 软件比对后的结果，图 5 结果表明，该蛋白点是大豆中 - 伴球蛋白的亚单位，共比对到 11 个肽段，其中唯一（unique）的肽段有 7 个，得分（Score）为 1095 分，远远高于其可信度分值 48 分的标准。 0068 在前人关于成熟大豆种子蛋白质组学研究的相关报道中， Mooney 等 (Phytoche mistry2004,65,1733-1744) 使用酚法提取大豆种子蛋白，使用肽质量指纹图谱法鉴定了 44 个蛋白点； Barbosa 等 (Anal.Bioan。

35、al.Chem.2012， 402:299314) 通过醋酸铵沉淀法提取蛋白，使用 MALDI-TOF-MS 和 Q-TOF-MS/MS 质谱法鉴定了 192 个蛋白点； Natarajan 等 (Anal.Biochem.2009,394,259-268) 使用 30% 异丙醇富集低丰度蛋白，使用 MALDI-TOF-MS 说明书 CN 103897018 A 7 6/6 页 8 和 LC-MS/MS 质谱法鉴定了 107 个蛋白点； Krishnan 等（Proteomics2009,9,3174-88) 使用 10mM钙离子沉淀去除成熟大豆种子中87%的高丰度储藏蛋白，使用MALDI-TOF-MS质谱法鉴定了 196 个蛋白点。而使用本发明方法提取蛋白，经胶内酶解和 MALDI-TOF/TOF 质谱分析，共鉴定到大豆种子中 363 个表达蛋白，远远高于现已报道的其他方法。说明书 CN 103897018 A 8 1/3 页 9 图 1 图 2 说明书附图 CN 103897018 A 9 2/3 页 10 图 3 图 4 说明书附图 CN 103897018 A 10 3/3 页 11 图 5 说明书附图 CN 103897018 A 11 。

摘要
申请专利号：	CN201210576800.9	申请日：	20121226
公开号：	CN103897018A	公开日：	20140702
当前法律状态：		有效性：	失效
法律详情：
IPC分类号：	C07K1/30,C07K1/14	主分类号：	C07K1/30,C07K1/14
申请人：	中国科学院植物研究所
发明人：	曲乐庆,徐秀苹
地址：	100093 北京市海淀区香山南辛村20号
优先权：	CN201210576800A
专利代理机构：	北京纪凯知识产权代理有限公司	代理人：	关畅
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内容摘要

本发明公开了大豆种子总蛋白质的提取方法及其专用试剂。所述方法包括如下步骤：1）取大豆种子和溶液S1按1g:3ml的比例混合提取蛋白质，收集所有物质获得混合物甲；2）向步骤1）的所述混合物甲中加入与步骤1）所述溶液S1体积相同的溶液S2再提取蛋白质，收集所有物质获得混合物乙；3）将步骤2）所述混合物乙离心，取上清液用三氯乙酸沉淀，获得所述大豆种子总蛋白质。所述溶液S1和S2为专用试剂。使用本发明方法及试剂提取大豆种子蛋白质量较好，纯度较高，在进行双向电泳分析时可得到900个蛋白点，一些低分子量、低丰度蛋白清晰可见。通过质谱可鉴定363个蛋白点，远远高于现已报道的其他方法。本发明对植物蛋白质组学的研究具有重大的应用价值。

权利要求书

1.一种提取大豆种子总蛋白质的方法，包括如下步骤：1）取大豆种子和溶液S1按1g:3ml的比例混合提取蛋白质，收集所有物质获得混合物甲；2）向步骤1）的所述混合物甲中加入与步骤1）所述溶液S1体积相同的溶液S2再提取蛋白质，收集所有物质获得混合物乙；3）将步骤2）所述混合物乙离心，取上清液用三氯乙酸沉淀，获得所述大豆种子总蛋白质；所述溶液S1的溶剂为水，溶质为蔗糖、Tris-HCl、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、苯甲基磺酰氟和β-巯基乙醇，所述蔗糖、Tris-HCl、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、苯甲基磺酰氟和β-巯基乙醇在所述溶液S1中的浓度分别为170g/L、40mmol/L、20mmol/L、2mmol/L和5%体积百分含量；所述溶液S1的pH值为7.5；所述溶液S2的溶剂为水，溶质为蔗糖、Tris-HCl、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、苯甲基磺酰氟和聚乙二醇辛基苯基醚，所述蔗糖、Tris-HCl、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、苯甲基磺酰氟和聚乙二醇辛基苯基醚在所述溶液S2中的浓度分别为170g/L、40mmol/L、20mmol/L、2mmol/L和4%体积百分含量；所述溶液S2的pH值为7.5。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中所述提取包括将所述大豆种子和所述溶液S1进行研磨的步骤，该研磨的时间为8—12分钟，如10分钟；和/或，步骤2）中所述提取包括将所述混合物甲和所述溶液S2进行研磨的步骤，该研磨的时间为8—12分钟，如10分钟。 3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤3）中所述离心的相对离心力为10000g，离心时间为10分钟。 4.根据权利要求1—3中任一所述的方法，其特征在于：步骤3）中所述取上清液用三氯乙酸沉淀中三氯乙酸的使用终浓度为10%体积百分含量，所述沉淀的时间为25—35分钟，如30分钟。 5.根据权利要求1—4中任一所述的方法，其特征在于：步骤3）中所述用三氯乙酸沉淀后，还包括将所述沉淀用溶液S3洗涤的步骤；所述溶液S3为二硫苏糖醇的丙酮溶液，所述溶液S3中二硫苏糖醇的含量为2克/升。 6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述用溶液S3洗涤按每克所述大豆种子加5mL所述溶液S3的比例进行，所述洗涤的次数为4次以上。 7.植物总蛋白质的提取试剂或试剂盒，包括分别独立包装的权利要求1中的所述溶液S1和所述溶液S2。 8.根据权利要求7所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒包括独立包装的权利要求5中的所述溶液S3。 9.权利要求7或8所述试剂或试剂盒在提取植物总蛋白质中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述植物为大豆，所述提取的器官为所述大豆的种子。

说明书

技术领域

本发明涉及一种大豆种子总蛋白质的提取方法及其专用试剂。

背景技术

大豆是我国和世界上重要的经济作物，其种子油是人类与动物营养以及食品加工业植物食用油的重要来源，大豆油用量占全世界食用油的31%。同时，大豆种子也包含丰富的蛋白，是世界上植物蛋白的主要来源。鉴定大豆种子表达全蛋白，对于进一步解析大豆种子中蛋白和油积累机制有重要的参考作用。

蛋白质是基因表达的产物，也是许多生理功能的主要执行者和体现者，随着功能基因组学的兴起，蛋白质组学（Proteomics）已成为生命科学研究的重点之一。蛋白质组学研究的宗旨是对组织或细胞的所有蛋白质（至少是大部分）进行分离与鉴定。通过蛋白质组的分析可以检测生命活动变化过程中蛋白表达量及翻译后修饰等变化，从而阐明其生物学功能的分子机制。蛋白样品的提取和制备是进行蛋白质组学分析的关键步骤，蛋白样品的纯度和再溶性直接影响双向电泳分离结果的清晰度和重复性。经典双向电泳（2-DE）的分离方法与程序主要适用于模式植物拟南芥与重要经济作物水稻的全蛋白分析。Toorchi等（J.Proteome Res.,2008,7:3035-3041）用三种不同的蛋白提取方法和两种裂解液对水稻和大豆的各种组织进行蛋白质组学分析，结果发现：大豆蛋白质组凝胶图谱的蛋白点数比水稻的少；蛋白提取方法与裂解液配方的不同严重影响大豆蛋白的溶解与分离；大豆和水稻对所有裂解液配方的敏感性不同。由此可见，探索、优化大豆各种组织器官蛋白样品制备的方法与程序是其蛋白质组学发展的前提与基础。

大豆种子含有大约36%蛋白质、30%碳水化合物、20%油脂、9%粗纤维和5%灰分。另外，在大豆种子中还存在大量的次生代谢产物。大豆次生代谢产物、脂质、大量碳水化合物及酚类混合物等干扰物质的广泛存在不仅妨碍高质量蛋白样品的提取，也影响2-DE胶的分离效果，是导致条纹和污渍产生、影响高清晰度蛋白点数目的主要原因。高纯度大豆全蛋白样品的获得是大豆蛋白质组成功的关键。

目前，在关于成熟大豆种子蛋白质组学研究的相关报道中，Mooney等 (Phytochemistry 2004,65,1733-1744)和Barbosa等(Planta 1988,175,485-492) 分别鉴定了44个和192个蛋白点；另两个研究(Natarajan,et al.,Anal.Biochem. 2009,394,259-268;Krishnan,et al.,Proteomics 2009,9,3174-88)通过去掉成熟大豆种子的高丰度储藏蛋白，分别鉴定到107个和196个蛋白点。但是大豆成熟种子中的蛋白远不止这些，进一步鉴定到更多的蛋白将会为大豆种子发育、成熟以及萌发等提供更多的参考资料。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种提取大豆种子总蛋白质的方法，包括如下步骤：

1）取大豆种子和溶液S1按1g:3ml的比例混合提取蛋白质，收集所有物质获得混合物甲；

2）向步骤1）的所述混合物甲中加入与步骤1）所述溶液S1体积相同的溶液S2再提取蛋白质，收集所有物质获得混合物乙；

3）将步骤2）所述混合物乙离心，取上清液用三氯乙酸沉淀，获得所述大豆种子总蛋白质；

所述溶液S1的溶剂为水，溶质为蔗糖、Tris-HCl、乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）、苯甲基磺酰氟（PMSF）和β-巯基乙醇，所述蔗糖、Tris-HCl、EGTA、PMSF和β-巯基乙醇在所述溶液S1中的浓度分别为170g/L、40mmol/L、20mmol/L、2mmol/L和5% （体积百分含量）；所述溶液S1的pH值为7.5；

所述溶液S2的溶剂为水，溶质为蔗糖、Tris-HCl、EGTA、PMSF和聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)，所述蔗糖、Tris-HCl、EGTA、PMSF和TritonX-10在所述溶液S2 中的浓度分别为170g/L、40mmol/L、20mmol/L、2mmol/L和4%（体积百分含量）；所述溶液S2的pH值为7.5。

在上述方法中，步骤1）中所述提取包括将所述大豆种子和所述溶液S1进行研磨的步骤，该研磨的时间为8—12分钟，如10分钟；

和/或，步骤2）中所述提取包括将所述混合物甲和所述溶液S2进行研磨的步骤，该研磨的时间为8—12分钟，如10分钟；

所述研磨的温度为0℃；

在上述方法中，步骤3）中所述离心的相对离心力可为10000g，离心时间为10分钟；所述离心的温度为4℃。

在上述方法中，步骤3）中所述取上清液用三氯乙酸沉淀中三氯乙酸的使用终浓度为10%体积百分含量，所述沉淀的时间为25—35分钟，如30分钟；所述沉淀的温度条件为0℃。

在上述方法中，步骤3）中所述用三氯乙酸沉淀后，还包括将所述沉淀用溶液S3 洗涤的步骤；所述溶液S3为二硫苏糖醇（DTT）的丙酮溶液，所述溶液S3中，二硫苏糖醇的含量为2克/升。

在上述方法中，所述用溶液S3洗涤是按每克所述大豆种子加5mL所述溶液S3进行洗涤，所述洗涤的次数为4次以上。

本发明的另一个目的是提供一种植物总蛋白质的提取试剂或试剂盒，包括分别独立包装的所述溶液S1和所述溶液S2。

在上述试剂或试剂盒中，还可包括独立包装的所述溶液S3。

当然，上述植物总蛋白质的提取试剂或试剂盒可只由所述溶液S1、所述溶液S2和所述溶液S3组成。

本发明保护所述试剂或试剂盒在提取植物总蛋白质中的应用。

在上述应用中，所述植物可为大豆，所述提取的器官具体可为所述大豆的种子。

大豆种子中含有高丰度的7S和11S蛋白，掩盖了低丰度种子蛋白的提取和分析。使用本发明的方法和试剂提取大豆种子蛋白质量较好，纯度较高，在进行双向电泳分析后共得到900个蛋白点，一些低分子量、低丰度蛋白清晰可见。通过串联质谱分析，共鉴定到大豆种子中的363个蛋白点，远远高于现已报道的其他方法。本发明对植物蛋白质组学的研究具有重大的应用价值。

附图说明

图1为本发明方法提取大豆种子总蛋白质的双向电泳图。

图2为对照1提取大豆种子总蛋白质的双向电泳图。

图3为对照2（普通酚法）提取大豆种子总蛋白质的双向电泳图。

图4为酶解一个蛋白点获得的MALDI-TOF/TOF二级质谱图。其中，横坐标为核质比，纵坐标为相对离子丰度。

图5为将一个质谱数据利用Mascot软件在NCBI数据库中进行检索鉴定的结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、大豆种子总蛋白质的提取

一、本发明的提取方法和试剂

取0.4g大豆成熟种子中黄13（王连铮，赵容娟，农业科技通讯，2005，6：40），砸碎，加入1.2ml溶液S1,冰上研磨10分钟，再加入1.2ml溶液S2，继续研磨10 分钟；将所有研磨物移至离心管中，4℃、10000g、离心10分钟；取上清液加入终浓度为10%的三氯乙酸，冰上放置半小时；4℃、15000g、离心10分钟，取沉淀加2mL 溶液S3进行洗涤，共洗涤四次（多次大体积洗涤沉淀，可最大限度去除蛋白中的杂质），将沉淀在超净台内吹干，获得总蛋白质Ⅰ，-20℃保存。

所述溶液S1的溶剂为水，溶质为蔗糖、Tris-HCl、EGTA（乙二醇二乙醚二胺四乙酸）、PMSF（苯甲基磺酰氟）和β-巯基乙醇，所述蔗糖、Tris-HCl、EGTA、PMSF和β- 巯基乙醇在所述溶液S1中的浓度分别为170g/L、40mmol/L、20mmol/L、2mmol/L、和5%体积百分含量；所述溶液S1的pH值为7.5。

所述溶液S2的溶剂为水，溶质为蔗糖、Tris-HCl、EGTA（乙二醇二乙醚二胺四乙酸）、PMSF（苯甲基磺酰氟）和TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)，所述蔗糖、Tris-HCl、 EGTA、PMSF和TritonX-100在所述溶液S2中的浓度分别为170g/L、40mmol/L、20 mmol/L、2mmol/L和4%体积百分含量；所述溶液S2的pH值为7.5。

所述溶液S3为二硫苏糖醇（DTT）的丙酮溶液，所述溶液S3中，二硫苏糖醇的含量为2克/升。

二、对照1

取0.4g大豆成熟种子中黄13，砸碎，加入1.5ml所述溶液S1,冰上研磨10分钟，再加入1.5ml所述溶液S2，继续研磨10分钟；将所有研磨物移至离心管中，4℃、 10000g、离心10分钟；取上清液加入终浓度为10%的三氯乙酸，冰上放置半小时；4℃、 15000g、离心10分钟，取沉淀加2mL所述溶液S3进行洗涤，共洗涤四次，将沉淀在超净台内吹干，获得总蛋白质Ⅱ，-20℃保存。

三、对照2（普通酚法）

取大豆成熟种子中黄13的籽粒1粒，加5倍体积提取缓冲液（0.1mol/L Tris-HCl （pH8.8）,10mmol/L EDTA,0.4%体积百分含量的β-巯基乙醇，0.9mol/L蔗糖,0.5% PVP）研磨；12000r/min离心10min，取上清液，加入等体积的水饱和酚（pH8.0），充分振荡，静置10min后，12000r/min离心5min；取酚相液体，加入5倍体积 0.1mol/L乙醇铵，置于-20℃下30min，12000r/min离心10min，去上清，充分洗涤沉淀4次以上，除尽乙醇铵，冷冻抽干，所得干粉为粗蛋白，即总蛋白质Ⅲ。

实施例2、蛋白质双向电泳、染色及凝胶扫描分析

将实施例1获得的总蛋白质Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分别进行蛋白质双向电泳、染色及凝胶扫描分析，结果分别如图1、图2和图3所示。图1中蛋白点分散较好，横纹和纵纹较少，蛋白点较多，共得到蛋白点900个；由于研磨时产生较多气泡，导致蛋白氧化、降解，图 2中双向电泳结果有较多横纹和纵纹，共得到蛋白点530个；图3中共得到蛋白点410个。

上述蛋白质双向电泳及凝胶染色获得图1-3结果的具体方法如下：

1、第一向等电聚焦电泳

取6mg总蛋白质Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ，加入200μl的lysis buffer（含7mol/L的尿素（urea），2mol/L的硫代尿素（thoiurea），4%（w/v）CHAPS，2%Ampholine（pH3.5 -10），1%（w/v）DTT），震荡器上震荡溶解后，15000×g、4℃、离心0.5小时，取上清液用于上样。使用IPG预制胶条（11cm，pH4—7，GE公司，货号18-1016-60）在 20℃下进行等电聚焦电泳：300V1小时，600V1小时,1000V1小时，8000V5小时。

2、第二向SDS-PAGE电泳

步骤1的等电聚焦完成后，将IPG胶条取出，用滤纸吸去附着的矿物油，放在平衡缓冲液a（1%DTT，50mM/L Tris-HCl,6M/L尿素，30%甘油，2.5%SDS）中，置于摇床上平衡15min后，转入平衡缓冲液b（2.5%碘乙酰胺,50mM/L Tris-HCl,6M/L尿素， 30%甘油，2.5%SDS）中平衡15min。将平衡好的胶条转移到第二向垂直板胶（16%分离胶，4%浓缩胶）的上端，用1%的琼脂糖密封，使用电泳液（pH为8.8）恒定电流25mA 下进行SDS-PAGE凝胶电泳4小时。

所述16%分离胶中含16%丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺、0.37M/L Tris、0.1%SDS、0.1% TEMED和0.07%过硫酸胺；

所述4%浓缩胶中含4%丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺，0.1M/L Tris,0.1%SDS， 0.3%TEMED和0.05%过硫酸胺；

所述电泳液中含0.3%Tris、1.44g/L甘氨酸和0.1%SDS。

3、凝胶染色和脱色

电泳完成后，取下凝胶，置于固定液中固定40min；将固定好的凝胶置于考马斯亮蓝R250染色液中，室温染色45min以上；倒出染色液，加入脱色液脱色30分钟后更换脱色液，继续脱色2小时左右，其间更换数次脱色液，至凝胶背景合适，蛋白点鲜明为止。固定、染色以及脱色过程均在脱色摇床上晃动进行。

所述固定液中含40%乙醇和10%乙酸。

所述考马斯亮蓝R250染色液中含0.116%考马斯亮蓝R250,25%乙醇和8%乙酸。

所述脱色液中含25%乙醇和8%乙酸。

4、蛋白质凝胶的扫描及图像分析

将步骤3处理后的凝胶用UMAX Power Look2100XL扫描仪(Maxium Tech,Taipei, China)直接扫描，扫描参数设置为256阶灰度、300dpi透射扫描，图像保存为TIF格式。扫描后的图像用ImageMaster 2D Platinum软件（Amersham Bioscience）进行分析，将处理和对照的凝胶（每个处理三张凝胶）用软件转换成*.mel的文件，输入到软件界面。调整最佳的对比度。检测点的参数设定为Smooth5，Min Area 50和Saliency 2，进行点的检测，统计每张凝胶中的蛋白点个数。将检测到的蛋白点标记、挖胶，进行实施例3的质谱分析。

实施例3、蛋白点的质谱分析

将实施例1获得的总蛋白质Ⅰ经实施例2电泳及分析获得的蛋白点（共900个）分别进行质谱分析，共鉴定到363个蛋白点，其中使用MALDI TOF MS鉴定到126个蛋白点,使用MALDI-TOF/TOF鉴定到172个蛋白点，使用LC-MS/MS鉴定到65个蛋白点，具体方法如下：

1、胶内酶解

将含目的蛋白点的凝胶块切成1mm2左右的小块，加脱色液（50%乙腈，50mM NH4HCO3） 800μl，40℃脱色2小时，中间更换一次脱色液。吸去脱色液，用200μl HPLC水冲洗，震荡1min，之后吸去HPLC水，再加200μl HPLC水冲洗，震荡1min。吸去HPLC水，将胶块真空干燥后，加入15—20μl胰蛋白酶工作液（0.1U/μl,Promega，货号:V5280），4℃ 放置0.5小时，以使干胶块充分吸胀。37℃酶解16小时，获得酶解液保存于-20℃下备用。

2、质谱鉴定

将步骤1获得的酶解液与饱和的基质溶液（溶质为α-氰基-4-羟基肉桂酸，溶剂为1％三氟乙酸和50%乙腈）均匀混合，在点样板上共结晶后用MALDI-TOF-MS质谱仪 (Shimadzu Biotech,Kyoto,Japan)或MALDI-TOF/TOF质谱仪(UltrafleXtreme, Bruker Daltonics,Billerica,MA,USA)或LC-MS/MS质谱仪(Waters Ltd.,Manchester, UK)进行串联质谱分析，具体操作按照说明书进行。图4为酶解其中一个蛋白点，经 MALDI-TOF/TOF质谱仪分析，获得的VPSGTTYYVVNPDNNENLR肽段的二级质谱图，数据库检索匹配情况良好，其中y离子系列可以全部检出。

3、蛋白质数据库检索

将经步骤2质谱分析后得到肽质量指纹图谱（peptide mass fingerprinting,PMF）数据，利用Mascot软件（Matrix Science Ltd.,London,UK）在NCBI数据库中进行检索鉴定蛋白。对于检索的结果，软件提供一个可信度分值（MOWSE Score），当检索到的蛋白分值大于该值时结果是可信的（即在p﹤0.05水平显著）。当出现多个大于标准可信度分值的结果时候，选取得分最大的结果，同时参考其匹配肽段的序列覆盖率（sequence coverage）以及分子量、等电点等参数来加以确定。

图5为图4所做质谱蛋白点经Mascot软件比对后的结果，图5结果表明，该蛋白点是大豆中β-伴球蛋白的α亚单位，共比对到11个肽段，其中唯一（unique）的肽段有7个，得分（Score）为1095分，远远高于其可信度分值48分的标准。

在前人关于成熟大豆种子蛋白质组学研究的相关报道中，Mooney等 (Phytochemistry2004,65,1733-1744)使用酚法提取大豆种子蛋白，使用肽质量指纹图谱法鉴定了44个蛋白点；Barbosa等(Anal.Bioanal.Chem.2012，402:299–314) 通过醋酸铵沉淀法提取蛋白，使用MALDI-TOF-MS和Q-TOF-MS/MS质谱法鉴定了192 个蛋白点；Natarajan等(Anal.Biochem.2009,394,259-268)使用30%异丙醇富集低丰度蛋白，使用MALDI-TOF-MS和LC-MS/MS质谱法鉴定了107个蛋白点；Krishnan 等（Proteomics2009,9,3174-88)使用10mM钙离子沉淀去除成熟大豆种子中87%的高丰度储藏蛋白，使用MALDI-TOF-MS质谱法鉴定了196个蛋白点。而使用本发明方法提取蛋白，经胶内酶解和MALDI-TOF/TOF质谱分析，共鉴定到大豆种子中363个表达蛋白，远远高于现已报道的其他方法。