技术领域
本发明涉及一种用于检测禽流感病毒、特别是H7N9亚型核苷酸片段 的引物和探针序列，以及包含所述引物和探针序列的试剂盒。
背景技术
流感病毒可分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型。其中，甲型流感依据 流感病毒血凝素蛋白（HA）的不同可分为1-16种亚型，根据病毒神经氨酸 酶蛋白（NA）的不同可分为1-9种亚型，HA的不同亚型可以与NA的不同 亚型相互组合形成不同的流感病毒。禽类，特别是水禽，是所有这些流感病 毒的自然宿主。这种病毒的生物学特点、致病力、传播力，到目前还没有依 据进行分析判断。
H7N9型禽流感病毒是2008年从西班牙东北部加泰罗尼亚的小水鸭中 首次被分离出来的，后来在中欧、北美等许多国家也相继被发现，属于流感 病毒的一种。H7N9禽流感自2013年3月在上海、安徽两地爆发以来，至 2013年4月21日，我国共报告102例确诊病例，死亡20例，12人康复， 其余70人正在各定点医疗单位接受救治，涉及了上海、江苏、安徽、浙江 等省市。针对疫情的不断蔓延，国家卫生和计划生育委员会迅速出台了人感 染H7N9禽流感诊疗方案，相关省市卫生主管部门也纷纷启动疫情防控应急 预案，力争将疫情控制到最小范围，最大限度地减轻疫情危害。
目前常见的病毒分离和血清学诊断方法，操作繁琐、耗时、敏感性低、 特异性差，不适宜作为病毒的早期诊断。随着分子生物学技术的发展，普通 PCR方法已经广泛应用于临床诊断，但该技术需要对PCR产物进行后处理， 极易导致PCR产物污染，同时有一定的非特异性扩增。在普通PCR技术的 基础上发展了荧光PCR技术，该技术为在扩增反应体系中加入一对特异性 引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR检测 仪来检测靶核苷酸序列的技术。除了具有普通PCR的优点外，它还具有以 下优点：（1）特异性更强，灵敏度更高。由于多使用了一条可与模板互补配 对的荧光探针，提高了特异性，并且由自动化仪器收集荧光信号，避免了人 工判断的主观性，又可进一步提高灵敏度；（2）全封闭反应，在线式实时监 测荧光，无须PCR产物的后处理，避免污染，保证了结果的可靠性；（3） 数据分析选在核酸扩增的对数期，摈弃普通PCR方法的受多因素干扰的终 点分析法，使得定量更准确可靠；（4）可实现单管双检或多检，还可设计针 对性内标，监控抽提效率及排除抑制剂干扰；（5）不接触有毒试剂，操作安 全；（6）有利于规模化、自动化及联网管理；（7）适用范围更广，理论上可 检测任何病毒的核酸。
目前针对禽流感病毒，还需要开发新的灵敏度高的荧光PCR检测引物、 探针以及相应的检测产品。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测禽流感病毒核苷酸片段的引物和探 针序列。
本发明的另一个目的是提供一种用于以荧光RT-PCR检测样品中禽流感 病毒的试剂盒。
基于上述目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一对核苷酸序列，其可用作检测禽流感病毒的引物 对，所述引物对由上游引物和下游引物组成，上游引物（本文中又称为 “H7N9-2-2.2-F”）包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，下游引物（本文 中又称为“H7N9-2-2.2-R”）包含SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列：
SEQ ID NO.1ATCAAACCACATGAGAAAGGCA；
SEQ ID NO.2TCATGTTCTTTGTCCTTGGAATCT。
优选地，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引 物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
另一方面，本发明提供一个核苷酸序列，其可用作检测禽流感病毒的探 针，所述探针（本文中又称为“H7N9-2-2.2-B”）包含SEQ ID NO.3所示的 核苷酸序列：
SEQ ID NO.3TAGCACCTGCTTCCAAGTCAGGAGATAA。
优选地，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
并且，所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团为BHQ1 或TAMRA，优选BHQ1；所述探针的5’端标记有荧光报告基团，所述荧光 报告基团为FAM或ROX，优选FAM。
此外，上述引物对和探针用于检测禽流感病毒，所述禽流感病毒优选为 甲型，进一步优选H7N9亚型。
采用上述引物对和探针检测禽流感病毒的检测原理是利用上述一对特 异性引物和一个特异性荧光探针，采用耐热DNA聚合酶（Taq酶）、反转录 酶、四种核苷酸单体（dNTP）等成分，并应用RT-PCR技术实现待测定禽流 感病毒靶核苷酸序列的核酸片段扩增。其中，所使用的探针为两端分别标记 荧光报告基团（R）和荧光淬灭基团（Q）的寡核苷酸。在探针完整时，报 告基团发射的荧光信号被淬灭基团所吸收，而在PCR扩增过程中，Taq酶的 5’端外切酶活性将特异性结合在靶核苷酸片段上的荧光探针酶切降解，使荧 光报告基团游离于反应体系中。由于脱离了荧光淬灭基团的屏蔽作用，该荧 光报告基团的荧光信号就可以由仪器检测到，并且荧光信号量的变化与扩增 产物量成正比，从而判定待测样本中靶核苷酸序列的存在。
另一方面，本发明还提供用于以荧光RT-PCR检测样品中禽流感病毒的 试剂盒。该试剂盒可以用于以荧光RT-PCR反应快速、灵敏地检测样品中是 否存在禽流感病毒，即检测样品是否感染了禽流感病毒。
具体而言，本发明的试剂盒包括：
（1）本发明提供的上文所述的引物对；
（2）本发明提供的上文所述的探针。
优选地，所述试剂盒还包括：
（3）dNTPs（含dUTP）；
（4）PCR反应缓冲液
（5）Mg2+；
（6）Taq酶；
（7）反转录酶。
进一步优选地，所述试剂盒还包括：
（8）禽流感病毒RNA提取液，为Trizol Reagent总RNA提取试剂；根 据本发明的具体实施方式，采用的是购自Invitrogen的Trizol Reagent总RNA 提取试剂；
（9）阴性质控品，为水，优选为DEPC水；和
（10）阳性质控品，为灭活毒株，优选为H7N9灭活毒株。
在采用本发明提供的试剂盒进行禽流感病毒检测时，RT-PCR扩增的反 应体系以25μl计包含：
（1）所述引物对的上游引物和下游引物各0.2μmol/L；
（2）所述探针0.1μmol/L；
（3）dNTPs（含dUTP）0.2mmol/L；
（4）PCR反应缓冲液，终浓度1×；
（5）Mg2+2.5mmol/L；
（6）Taq酶2U；
（7）反转录酶4U；
（8）水，优选为DEPC水，在加入RNA模板后补至25μl。
本文提供的上述试剂盒用于检测禽流感病毒，所述禽流感病毒优选为甲 型，进一步优选H7N9亚型。
在检测时，所述RT-PCR的反应条件为：
50℃20分钟；然后是：95℃3分钟，1个循环；95℃5秒，60℃40 秒，40个循环。
本文提供的试剂盒可以检测的样品为来自禽类或哺乳动物的咽喉拭子、 泄殖腔拭子、组织样本、血清或血浆。例如人咽喉拭子、泄殖腔拭子，禽咽 喉拭子、泄殖腔拭子、冷冻禽肉组织渗出液、鸡胚尿囊液等样本。
本文提供的试剂盒的检测原理是，利用上述一对特异性引物和一个特异 性荧光探针，在包含反转录酶、耐热DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸以 及镁离子等RT-PCR反应缓冲液中，扩增待检测样品中的禽流感病毒，通过 多种市售荧光PCR扩增仪实现靶核苷酸的循环扩增，从而快速、灵敏地检 测样品中的禽流感病毒。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：
（1）本发明分别对所有已知的禽流感病毒H7N9亚型基因组序列进行 比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段进行引物和探针的设计，避免 了假阴性结果的产生。
（2）本发明提供的引物和探针的检测灵敏度可达1000个拷贝/ml，说 明其具有良好的灵敏度。
（3）本发明提供的引物和探针对于不含有禽流感病毒H7N9亚型的检 测样本均无扩增信号，说明其具有良好的特异性。
（4）由于本发明采用荧光RT-PCR技术作为检测方法，整个反应均在 封闭的反应管内进行，避免了其他核酸检测方法如PCR－电泳等易于形成气 溶胶污染而造成假阳性结果。并且，由于对RT-PCR产物进行实时监测，大 大节省了监测时间，节约了人力物力。
（5）本发明提供的包含上述引物和探针的试剂盒，可以用于快速、高 通量检测禽流感病毒，大大缩短检测周期，为疾病的治疗和疫情的控制提供 保证。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1显示了实施例2中检测禽流感病毒H7N9亚型阳性样品的灵敏度的 荧光PCR扩增图。
图2显示了实施例3中利用本发明试剂盒检测的阳性样本的荧光 RT-PCR扩增图。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些 实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施 例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1引物和探针设计以及反应体系的建立和优化
1.引物和探针设计：
通过分别对所有已知的禽流感病毒H7N9亚型基因组序列进行比较分 析，选择无二级结构且高度保守的区段，设计多对引物和探针，引物长度一 般为20个碱基左右，引物间和引物内无互补序列。最优引物、探针序列组 合如下：
上游引物H7N9-2-2.2-F：ATCAAACCACATGAGAAAGGCA
下游引物H7N9-2-2.2-R：TCATGTTCTTTGTCCTTGGAATCT
探针H7N9-2-2.2-B：TAGCACCTGCTTCCAAGTCAGGAGATAA
2.反应体系的建立和优化：
靶区域模板以如下方法获得：利用灭活的禽流感病毒H7N9亚型毒株 （中国生物制品检定所提供）作为待检样品，用酚氯仿的提取方法提取病毒 基因组核酸，分装后储存于－20℃备用。
2.1引物浓度的优化在反应体系中，将禽流感病毒H7N9亚型的引物 浓度分别从0.1μmol/L至0.8μmol/L作倍比连续稀释后进行检测，通过试验 结果的分析比较，确定最佳引物终浓度为0.2μmol/L。
2.2镁离子浓度的优化在反应体系中其它条件不变的前提下，将 MgCl2的浓度从1mmol/L至2.5mmol/L以0.5mmol/L递增，经过多次重复实 验选定2.5mmol/L为试剂盒反应体系中的镁离子浓度。
2.3Taq DNA聚合酶（Taq酶）用量的优化通过比较Taq酶用量（以 单位Unit计）的优化实验结果，选定2U作为试剂盒反应体系中Taq酶的用 量。
2.4反转录酶用量的优化通过比较反转录酶用量（以单位Unit计）的 优化实验结果，选定4U作为试剂盒反应体系中反转录酶的用量。
2.5dNTPs浓度的优化通过使用不同浓度的dNTPs进行检测，综合评 估后选0.2mmol/L作为试剂盒反应体系中dNTPs的使用量。
2.6探针浓度的优化在反应体系中，将禽流感病毒H7N9亚型的探针 浓度分别从0.05μmol/L至0.2μmol/L作倍比连续稀释后进行检测，通过试验 结果的分析比较，确定最佳探针终浓度为0.1μmol/L。
利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的荧光 RT-PCR反应体系为25μl体系，所需各组分及相应浓度见表1。
表1优化后的RT-PCR反应体系
组分 终浓度 10×PCR反应缓冲液 1× Mg2＋浓度 2.5mmol/L dNTPs（含dUTP） 0.2mmol/L Taq酶 2U 反转录酶 4U 引物（上游） 0.2μmol/L 引物（下游） 0.2μmol/L 探针 0.1μmol/L 在加入模板后，补水至 25μl
注：a.在荧光RT-PCR反应体积不同时，各试剂应按比例调整。
b.使用的仪器不同，应将反应参数作适当调整。
3.仪器检测通道的选择：在进行荧光RT-PCR反应时，应对所用仪器 中反应管荧光信号的收集进行设置，选择的荧光检测通道与探针所标记的荧 光报告基团一致。具体设置方法因仪器而异，应参照仪器使用说明书。
4.RT-PCR条件选择如下：
50℃反转录20分钟；然后是：95℃3分钟，1个循环；95℃5秒，60℃ 40秒，40个循环。
实施例2检测H7N9亚型流感病毒的拷贝数的灵敏度实验
将浓度为106个拷贝/ml的中国生物制品检定所提供的H7N9灭活毒株， 按10倍梯度稀释到105个拷贝/ml、104个拷贝/ml、103个拷贝/ml、102个拷 贝/ml，采用实施例1中1-4步骤设计的引物、探针以及建立的反应体系和仪 器、扩增条件，进行荧光RT-PCR检测。
结果表明，在103个拷贝/ml时，CT值为25，其它各项指标也符合检测 要求。因此，本发明通过优化引物和探针，提高了检测的灵敏度，其灵敏度 可以达到103个拷贝/ml。结果见图1。
实施例3检测H7N9亚型流感病毒的特异性实验
本实验例证明，采用本发明提供的试剂或试剂盒，在建立的条件下可以 检测各种阳性样本里的病毒，并且阴性样本无检测结果。
1.样本：
检测样本120人份，其中包括经中国疾病预防控制中心推荐方法确定为 禽流感病毒H7N9阳性的样本31例，为阳性样本；另89例为阴性样本。这 120例样本为咽喉拭子。样本处理：在装有拭子的离心管中加入500μl PBS 或生理盐水，剧烈振荡30sec。尽量挤出液体移到离心管中6000rpm离心 20sec，取上清备用。
阴性对照：DEPC水；
阳性对照：H7N9灭活毒株，由中国生物制品检定所提供。
2.检验条件
试剂：本发明提供的试剂盒，为禽流感病毒H7N9型核酸检测试剂盒（荧 光RT-PCR法），由深圳太太基因工程有限公司提供，包括：
（1）上游引物H7N9-2-2.2-F和下游引物H7N9-2-2.2-R；
（2）探针H7N9-2-2.2-B；
（3）dNTPs（含dUTP）；
（4）10×PCR反应缓冲液；
（5）Mg2+；
（6）Taq酶；
（7）反转录酶；和
（8）禽流感病毒H7N9RNA提取液，为Trizol Reagent总RNA提取试 剂（购自Invitrogen）。
仪器：AB7500荧光定量仪，由浙江省疾病预防控制中心提供。
3.模板RNA的提取
（1）取1.5ml经灭菌的无RNA酶污染的离心管，作好标记。首先各加 入600μl H7N9RNA提取液，然后分别加入相应编号的经前处理的检测样本 以及阴、阳性对照各200μl，吸打混匀；再加入200μl氯仿，振荡混匀；静 置5min，12,000rpm离心10min；
（2）分别吸取各管中的上层液相转移至新的1.5ml无RNA酶污染的离 心管中，加入400μl-20℃预冷的异丙醇，作好标记，颠倒混匀；静置5min， 12,000rpm离心10min；
（3）轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入700μl75%乙醇， 颠倒洗涤；12,000rpm离心5min；轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾 干液体；
（4）4,000rpm离心10sec，用微量加样器尽量将残余液体吸干，室温干 燥1-5min；
（5）加入15μl DEPC水，轻弹混匀，溶解管壁上RNA，保存于-18℃ 以下备用。
4.检测程序
荧光RT-PCR反应体系为25μl体系，所需各组分及相应浓度见表2。
表2RT-PCR反应体系
组分 终浓度 10×PCR反应缓冲液 1× Mg2＋ 2.5mmol/L dNTPs（含dUTP） 0.2mmol/L Taq酶 2U 反转录酶 4U 引物H7N9-2-2.2-F 0.2μmol/L 引物H7N9-2-2.2-R 0.2μmol/L 探针H7N9-2-2.2-B 0.1μmol/L 模板（步骤3提取） 2μl 补DEPC水至 25μl
在AB7500荧光定量仪上进行检测。RT-PCR条件为：50℃反转录20 分钟；然后是：95℃3分钟，1个循环；95℃5秒，60℃40秒（收集荧光 FAM），40个循环。
5.检测结果
120份禽流感病毒H7N9实时荧光RT-PCR检测试剂盒的检测结果见下 表3。其中阳性样本的荧光RT-PCR扩增图见图2。
表3
本发明提供的检测试剂盒（荧光RT-PCR法）在中心禽流感病毒H7N9 阳性中的检出率：31/31=100%；
本发明提供的检测试剂盒（荧光RT-PCR法）在中心禽流感病毒H7N9 阴性中的检出率：89/89=100%；
本发明提供的检测试剂盒（荧光RT-PCR法）在中心禽流感病毒H7N9 检出符合率：31+89/120=100%。
对中心禽流感病毒H7N9检测标本的结果表明：31份禽流感病毒H7N9 阳性标本中，本发明提供的检测试剂盒（荧光RT-PCR法）检测出31例， 89分阴性标本中，检测出89例，符合率100%。说明太太基因生物工程有 限公司生产的禽流感病毒H7N9型核酸检测试剂盒（荧光RT-PCR法）检测 结果同经中国疾病预防控制中心推荐方法确定的结果一致，结果准确可信， 符合临床检测的要求。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可 以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本 发明所附权利要求的范围。