一种快速检测甘蔗属SPSB基因多态性的方法及应用.pdf

本发明公开一种快速检测甘蔗属蔗糖磷酸合成酶B基因多态性的方法。该方法是以甘蔗大茎野生种51NG3、甘蔗品种ROC22、甘蔗属热带种Badila、甘蔗属中国种光泽竹蔗、甘蔗属印度种Nagori或甘蔗属甘蔗细茎野生种印割1号全基因组DNA为模板，设计1对引物进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶检测，将大小为175bp片段的SPSB基因型命名为B1型，将大小为294bp片段的SPSB基因型命名为B2型，将大小为421bp片段的SPSB基因型命名为B3型。本发明为甘蔗糖分性状标记辅助选择提供了一种在DNA水平的鉴定方法，有利于甘蔗杂交后代中SPSB基因不同单倍型的跟踪，确定甘蔗糖分积累的有效SPSB基因型，对快速建立遗传优良的甘蔗种质具有重要意义。

1.一种快速检测甘蔗属SPSB基因多态性的方法，其特征在于，设计一对引物SPSB2177P1扩增含多态的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳检测，依据获得的电泳图谱条带类型判断SPSB基因多态类型，包括如下步骤：步骤(1)，模板的制备：提取被测样本的基因组DNA；步骤(2)，引物设计：所述的引物对SPSB2177P1为：上游引物：5’-TACATGGTTGGTTGTGGTGCT-3’；下游引物：5’-GTGTCTGACTTGACGGGTGGT-3’；步骤(3)，PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测；步骤(4)，基因型的判断；步骤(5)，SPSB基因多态结果鉴定。 2.根据权利要求1所述的快速检测甘蔗属SPSB基因多态性的方法，其特征在于，所述的模板为甘蔗属热带种Badila、甘蔗属中国种光泽竹蔗、甘蔗属印度种Nagori或甘蔗栽培种ROC22的基因组DNA。 3.根据权利要求1所述的快速检测甘蔗属SPSB基因多态性的方法，其特征在于，所述的PCR扩增体系为： 4.根据权利要求1所述的快速检测甘蔗属SPSB基因多态性的方法，其特征在于，所述的扩增程序为94℃预变性5min；35个循环94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s；72℃延伸7min。 5.根据权利要求1所述的快速检测甘蔗属SPSB基因多态性的方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶电泳检测的具体方法如下：配2.5％(w/v)琼脂糖凝胶，取5μL扩增的产物与2μL上样缓冲液混匀后上样，140V下电泳30min，紫外判断PCR结果。 6.根据权利要求1所述的快速检测甘蔗属SPSB基因多态性的方法，其特征在于，所述的基因型的判断的具体方法为：根据步骤(3)电泳检测的结果，当出现大小为175bp片段，为未插入性片段，则该SPSB基因型命名为B1型；当出现大小为294bp片段，为插入性片段，则该SPSB基因型命名为B2型；当出现大小为421bp片段，为插入性片段，则该SPSB基因型命名为B3型。 7.根据权利要求6所述的快速检测甘蔗属SPSB基因多态性的方法，其特征在于，所述的B1型与B2型的差别在于B2型插入了一段119bp的序列，该序列如SEQIDNO.5所示；B1型与B3型的差别在于B3型插入了一段246bp的序列，该序列如SEQIDNO.6所示。 8.根据权利要求6所述的快速检测甘蔗属SPSB基因多态性的方法，其特征在于，所述的B2型插入片段和B3型插入片段是不同的碱基序列，插入的位点相同，大小不同。 9.根据权利要求1所述的快速检测甘蔗属SPSB基因多态性的方法，其特征在于，所述的SPSB基因多态结果鉴定采用测序验证。

技术领域

本发明属于植物分子育种技术领域，具体涉及一种检测甘蔗属SPSB基因(J N584485)多态性的方法，及其在甘蔗糖分性状的标记辅助选择育种中快速建立 遗传优良的甘蔗种质的应用。

背景技术

甘蔗是复杂的异源多倍体植物，细胞核内含有多套染色体组，在甘蔗杂交 育种中主要以甘蔗属热带种(Saccharum.officinarumL.)，、甘蔗细茎野生种(又 称割手密)(SaccharumspontaneumL.)、甘蔗大茎野生种(Saccharumrobustu mB.)、甘蔗属中国种(SaccharumsinenseR.)和甘蔗属印度种(Saccharum barberiJ.)的种间杂交为主。因此杂交后代的性状分离严重，一个杂交花穗的 后代有成百上千后代类型，不能精确各单倍型在后代的传递方式。蔗糖磷酸合 成酶(SPS)是甘蔗蔗糖合成最关键的酶之一，鉴定和分离出不同多态性的SPS 基因对甘蔗的定向杂交与提高甘蔗蔗糖分具有重要的意义。目前，我国甘蔗育 种还基本上以传统的杂交为主，从不同的杂交组合中选出性状优良的，高产高 糖的品种。但这一方式耗费时间长，育成一个品种至少需要6年以上的时间， 而且在选配杂交组合时仅从表型性状来选择父母本，加上甘蔗开花条件的限制， 育成一个新品种的难度很大，因此如何从分子水平来指导甘蔗的品种选育成为 育种家们关注的焦点。

甘蔗是我国重要的糖料作物，提高单位面积内甘蔗产量是甘蔗育种家们一 直追求的目标。蔗糖磷酸合成酶是甘蔗蔗糖合成最密切的关键酶之一，共有4 个家族，分别为SPSA、SPSB、SPSC、SPSDⅢ和SPSDⅣ,它们是甘蔗体内光合产物向 蔗糖和淀粉分配的关键调控点，在该酶的作用下，不可逆性的催化六磷酸果糖 生成六磷酸蔗糖，此产物在蔗糖磷酸酯酶的作用下形成蔗糖，与蔗糖的合成呈 正相关，对甘蔗蔗糖含量的增加具有重要的作用。因此，分析SPS基因遗传变 异，特别是多态位点与甘蔗糖分性状的关联程度，对培育具有优良性状的甘蔗 新品种和提高育种速度具有重要的理论指导意义。

目前国内外在甘蔗SPSB基因的克隆和功能方面的研究较多，主要从mRNA 的角度来进行研究，但该基因的内含子区域并没有得到完整的克隆，其内含子 区域的多态性分析也未见报道。SPSB基因与SPSA、SPSC基因普遍存在3个磷 酸化位点，分别为14-3-3蛋白特异结合位点、光调控位点及渗透胁迫激活位点， 并在相应酶的作用下行使着不同的功能。

发明内容

本发明解决的问题在于利用甘蔗属不同种的基因组DNA来筛查SPSB基因 的多态性，寻找插入性较大的片段作为PCR检测的位点，从而提供一种快速检 测SPSB基因多态性的方法，并以此作为甘蔗多态性的标记，为不同SPSB基 因型的甘蔗杂交选育提供一定的指导。

本发明采用的技术方案如下：

一种快速检测甘蔗属SPSB基因多态性的方法，是设计一对引物SPSB217 7P1扩增含多态的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳检测，依据获得的电泳图谱条 带类型判断SPSB基因多态类型，

包括如下步骤：

步骤(1)，模板的制备：提取被测样本的基因组DNA；

步骤(2)，引物设计：所述的引物对SPSB2177P1为：

上游引物：5’-TACATGGTTGGTTGTGGTGCT-3’；

下游引物：5’-GTGTCTGACTTGACGGGTGGT-3’；

步骤(3)，PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测；

步骤(4)，基因型的判断；

步骤(5)，SPSB基因多态结果鉴定。

上述技术方案中，所述的模板为甘蔗属大茎野生种51NG3、甘蔗属甘蔗细茎 野生种(割手密)印割1号、甘蔗属热带种Badila、甘蔗属中国种光泽竹蔗、 甘蔗属印度种Nagori或甘蔗栽培种ROC22的基因组DNA。

上述技术方案中，所述的PCR扩增体系为：

上述技术方案中，所述的扩增程序为94℃预变性5min；35个循环94℃变 性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s；72℃延伸7min。

上述技术方案中，所述的琼脂糖凝胶电泳检测的具体方法如下：配2.5％(w /v)琼脂糖凝胶，取5μL扩增的产物与2μLLoadingbuffer混匀后上样，14 0V下电泳30min，紫外判断PCR条带大小，结果如图1所示。

上述技术方案中，所述的基因型判断的具体方法为：根据步骤(3)电泳检 测的结果，分别进行凝胶回收和克隆测序，验证图1中的片段序列正是SPSB 基因第一内含子序列，因此图1中出现的大小为175bp片段，为未插入性片段， 该SPSB基因型命名为B1型；图1中出现大小为294bp片段，为插入性片段， 该SPSB基因型命名为B2型；图1中出现大小为421bp片段，为插入性片段， 该SPSB基因型命名为B3型。在这三种基因型中，只有印割1号含有B2型的 多态性序列，能与其它几个种明显的区分开来。B1、B2和B3型基因序列测序 图见图2、图3、图4所示，三个图中前部和尾部的序列相同，仅中间含有插入 性序列。

上述技术方案中，所述的B1型与B2型的差别在于B2型插入了一段119bp 的序列，B1与B2型对比图如图5所示，该序列如SEQIDNO.5所示；B1与 B3型的差别在于B3型插入了一段246bp的序列，B1与B3型对比图如图6所 示，该序列如SEQIDNO.6所示。

上述技术方案中，所述的SPSB基因多态结果鉴定采用测序验证。

所述的SPSB基因多态结果鉴定能够明显的区分甘蔗属甘蔗细茎野生种(割 手密)印割1号与甘蔗属其它种，与其它种相比，印割1号多出一个B2型条带。

本发明的研究过程：

分别以甘蔗属大茎野生种51NG3、甘蔗属细茎野生种(割手密)印割1号、 甘蔗属热带种Badila、甘蔗属中国种光泽竹蔗、甘蔗属印度种Nagori和甘蔗栽 培种ROC22的基因组DNA为模板，参照高粱SPSB基因组DNA序列和甘蔗S PSB基因(JN584485)序列，以设计的SPSB2177为引物，上下游引物序列分别 在甘蔗SPSB基因第一外显子和第二外显子上，PCR扩增甘蔗SPSB基因部分 片段，扩增产物经浓度为1.5％(w/v)的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳的电压为14 0V，时间为30min，在紫外灯下多态性条带很难分离辨别，只显示唯一的条带， 通过凝胶回收、PMD-18T载体连接转化，所挑取测序的克隆数量为20个，经 测序筛选出SPSB基因在第一内含子615bp处有两条多态性插入片段，引物两 端序列与SPSB基因CDS序列完全相同，针对这一插入性片段的两端设计引物 SPSB2177P1，再以基因组DNA为模板进行PCR扩增，经浓度为2.5％(w/v) 的琼脂糖凝胶检测，检测的电压为140V，电泳时间为30min。将电泳的凝胶经 紫外检测，依据片段的大小分离多态性片段，将大小为175bp片段的SPSB基 因型命名为B1型(未插入性片段)，将大小为294bp片段的SPSB基因型命名 为B2型(插入性片段)，将大小为421bp片段的SPSB基因型命名为B3型(插 入性片段)两段序列经琼脂糖凝胶回收、载体连接和克隆测序验证，证明三段 序列是SPSB2177引物扩增的多态性片段序列。

所述的引物SPSB2177序列为：

上游引物：5’–AACTTCAACCCCTCGCACTACTT–3’

下游引物：5’–GTCCCCACTGTTCATCAATCTCC–3’

SPSB2177扩增程序：94℃预变性5min；35个循环94℃变性30s，62℃ 退火30s，72℃延伸2min；72℃延伸10min。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明中所利用PCR方法是一种简单快速检测基因多态性的有效技术，尤 其是在几十碱基差异以上的片段，都可从琼脂糖凝胶上检测出来，所涉及的引 物特异性强，准确度高，同时克服了费用昂贵，操作繁琐和假阳性的缺点。

由于SPSB基因功能涉及甘蔗蔗糖分性状，本发明提供的SPSB基因多态性 检测方法为甘蔗杂交后代不同基因型分离与甘蔗糖分性状关系的建立奠定了基 础，以便用于甘蔗糖分性状标记的辅助选择，快速建立遗传资源优良的甘蔗高 糖种质。

附图说明

图1为SPSB基因多态性检测的电泳图；

图2为B1型测序图；

图3为B2型测序图；

图4为B3型测序图；

图5为B1型与B2型插入性序列比对图；

图6为B1型与B3型插入性序列比对图；

其中，图2、图3和图4由于测序图较长，无法在连续表示，故分段截取后 附上；

图6中由于B3型插入性序列图较长，无法在连续表示，所以分段截取后附 上。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定 本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描 述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通过购买获得的常规产品。

通过以下实施例对本发明作进一步阐述，但本发明内容不限于所述范围。

本发明提供一种高效的甘蔗属SPSB基因B1、B2和B3型基因多态性检测 技术，包括以下步骤：

SPSB基因部分DNA序列的克隆及多态性的检测。

1、样本DNA的提取

本发明以甘蔗属细茎野生种(割手密)印割1号、甘蔗属热带种Badila、甘 蔗属中国种光泽竹蔗、甘蔗属印度种Nagori和甘蔗栽培种ROC22作为检测对 象，以全式金公司提供的EasyPurePlantGenomicDNAKit提取基因组DN A，最后用灭过菌的超纯水溶解，检测后4℃保存。用紫外光光度计测定DNA 样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD260/OD280的比值， 如果OD260/OD280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进 行纯化；如果比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。DNA检测完毕后， 取出一定量稀释至40ng/μL，以备PCR模板用。

2、引物设计

从NCBI上获得已公布的SPSB基因序列，GenBankID为JN584485，利 用Primer5.0软件在CDS区域设计引物，该引物能够扩增出包含SPSB基因的 部分内含子和外显子，引物设计的位点参照高粱SPSB基因组DNA序列。其引 物SPSB2177序列如下：

上游引物：5’–AACTTCAACCCCTCGCACTACTT–3’

下游引物：5’–GTCCCCACTGTTCATCAATCTCC–3’

3、PCR扩增

取已稀释的DNA1.5μL作为模板，PCR所用的试剂为全式金公司的Trans TaqDNAPolymeraseHighFidelity(HiFi)，反应体系为25μL，混匀后在P CR仪上进行扩增，PCR反应体系见表1所示。

表1

体系成分 体积(μL) 10×BufferⅠ(含Mg2+) 2.5 dNTP(2.5mM) 2 Taq HiFi聚合酶 0.5 上游引物(10μmol) 0.5 下游引物(10μmol) 0.5 GC enhance 2.5 DNA模板(40ng/μL) 1.5 ddH2O 15 总体积 25

PCR反应程序为：94℃预变性5min；35个循环94℃变性30s，62℃退火 30s，72℃延伸2min；72℃延伸10min。

扩增产物经浓度为1.5％(w/v)的琼脂糖凝胶回收，条带大小选用全式金公 司生产的MarkerI作为参照，通过T-easy载体连接转化后，挑取30个克隆进 行检测，然后将20个阳性克隆送到华大公司测序，经序列比对分析，筛选出不 同长度多态性片段。

(2)B1、B2和B3型基因的分型引物设计和PCR检测

1、引物设计

由于上述SPSB2177引物扩增的片段长度是2177bp，差异不明显的片段很 难在琼脂糖凝胶上得到区分，因此B1、B2和B3基因型的引物设计在插入性片 段的两侧进行设计，目的条带较小，差异性片段检测的灵敏度提高，且易于扩 增，其设计的引物SPSB2177P1序列为：

上游引物：5’–TACATGGTTGGTTGTGGTGCT–3’

下游引物：5’–GTGTCTGACTTGACGGGTGGT–3’

B1型表现为175bp条带，B2型表现294bp条带，B3型表现为421bp条带， B2型插入的片段序列如SEQIDNO.5所示，B3型插入的片段序列如SEQI DNO.6所示。

2、PCR检测

取已稀释的DNA1.5μL作为模板，PCR所用的试剂为全式金公司的Easy TaqDNAPolymerase，反应体系为25μL，混匀后在PCR仪上进行扩增，PC R反应体系见表2所示。

表2

体系成分 体积(μL) Buffer(含Mg2+) 2.5 dNTP(2.5mM) 2 EasyTaq DNA聚合酶 0.5 上游引物(10umol) 0.5 下游引物(10umol) 0.5 DNA模板(40ng/μL) 1.5 ddH2O 17.5 总体积 25

SPSB2177P1PCR反应程序为：94℃预变性5min；35个循环94℃变性3 0s，60℃退火30s，72℃延伸45s；72℃延伸7min。PCR产物在浓度为2.5 ％(w/v)的琼脂糖凝胶上140V电压电泳，条带大小选用全式金公司生产的Ma rkerI作为参照，利用BIO-RADGelDoc2000凝胶成像系统进行照相分析， 根据条带大小判断各多态性条带，421bp的条带定为B3型，294bp的条带定为 B2型，175bp的条带定位B1型，三条带分别进行凝胶回收后测序，结果显示 所测序列是预判基因序列。

实施例2

(1)甘蔗SPSB基因部分DNA序列的克隆及多态性的检测。

1、样本DNA的提取

以甘蔗属大茎野生种(SaccharumrobustumB.)51NG3作为检测对象，以全 式金公司提供的EasyPurePlantGenomicDNAKit提取基因组DNA，最后 用灭过菌的超纯水溶解，检测后-20℃保存。用紫外光光度计测定DNA样品在2 60nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD260/OD280的比值，如果OD 260/OD280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化； 如果比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。DNA检测完毕后，取出一定 量稀释至40ng/μL，以备PCR模板用。

2、引物设计

从NCBI上获得已公布的SPSB基因序列，GenBankID为JN584485，利 用Primer5.0软件在CDS区域设计引物，该引物能够扩增出包含SPSB基因的 部分内含子和外显子，引物设计的位点主要参照高粱SPSB基因组DNA序列。 其引物SPSB2177序列如下：

上游引物：5’–AACTTCAACCCCTCGCACTACTT–3’

下游引物：5’–GTCCCCACTGTTCATCAATCTCC–3’

3、PCR扩增

取已稀释的DNA1.5μL作为模板，PCR所用的试剂为全式金公司的Trans TaqDNAPolymeraseHighFidelity(HiFi)，反应体系为25μL，混匀后在P CR仪上进行扩增，PCR反应体系见表3所示。

表3

体系成分 体积(μL) 10×BufferⅠ(含Mg2+) 2.5 dNTP(2.5mM) 2 Taq HiFi聚合酶 0.5 上游引物(10μmol) 0.5 下游引物(10μmol) 0.5 GC enhance 2.5 DNA模板(40ng/μL) 1.5 ddH2O 15.5 总体积 25

PCR反应程序为：94℃预变性4min；34个循环94℃变性30s，62℃退火 30s，72℃延伸2min；72℃延伸7min。

扩增产物经浓度为1.5％(w/v)的琼脂糖凝胶回收，条带大小选用全式金公 司生产的MarkerI作为参照，通过T-easy载体连接转化后，挑取30个克隆进 行检测，然后将20个阳性克隆送到华大公司测序，经序列比对分析，筛选出不 同长度多态性片段。

(2)分型引物设计和PCR检测

1、引物设计

由于上述SPSB2177引物扩增的片段长度是2177bp，差异不明显的片段很 难在琼脂糖凝胶上得到区分，因此不同基因型的引物设计在插入性片段的两侧 进行设计，目的条带较小，差异性片段检测的灵敏度提高，且易于扩增，其设 计的引物SPSB2177P1序列为：

上游引物：5’–TACATGGTTGGTTGTGGTGCT–3’

下游引物：5’–GTGTCTGACTTGACGGGTGGT–3’

B1型表现为175bp条带，B3型表现421bp条带，插入的片段序列如SEQ IDNO.6所示。

2、PCR检测

取已稀释的DNA1.5μL作为模板，PCR所用的试剂为全式金公司的Easy TaqDNAPolymerase，反应体系为25μL，混匀后在PCR仪上进行扩增，P CR反应体系见表4所示。

表4

体系成分 体积(μL) Buffer(含Mg2+) 2.5 dNTP(2.5mM) 2 EasyTaq DNA聚合酶 0.5 上游引物(10umol) 0.5 下游引物(10umol) 0.5 DNA模板(40ng/μL) 1.5 ddH2O 17.5 总体积 25

SPSB2177P1PCR反应程序为：94℃预变性5min；35个循环94℃变性3 0s，60℃退火30s，72℃延伸45s；72℃延伸7min。PCR产物在浓度为2.5 ％(w/v)的琼脂糖凝胶上140V电压电泳30min，条带大小选用全式金公司生 产的MarkerI作为参照，利用BIO-RADGelDoc2000凝胶成像系统进行照 相分析，根据条带大小判断各多态性条带，421bp的条带命为B3型，175bp的 条带命为B1型，两个条带分别进行凝胶回收后测序，结果显示所测序列是预判 基因序列。

实施例3

(1)甘蔗SPSB基因部分DNA序列的克隆及多态性的检测。

1、样本DNA的提取

以甘蔗属大茎野生种(SaccharumrobustumB.)51NG3作为检测对象，以全 式金公司提供的EasyPurePlantGenomicDNAKit提取基因组DNA，最后 用灭过菌的超纯水溶解，检测后-20℃保存。用紫外分光光度计测定DNA样品 在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD260/OD280的比值，如果 OD260/OD280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯 化；如果比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。DNA检测完毕后，取出 一定量稀释至40ng/μL，以备PCR模板用。

2、引物设计

从NCBI上获得已公布的SPSB基因序列，GenBankID为JN584485，利 用Primer5.0软件在CDS区域设计引物，该引物能够扩增出包含SPSB基因的 部分内含子和外显子，引物设计的位点参照高粱SPSB基因组DNA序列。其引 物SPSB2177序列如下：

上游引物：5’–AACTTCAACCCCTCGCACTACTT–3’

下游引物：5’–GTCCCCACTGTTCATCAATCTCC–3’

3、PCR扩增

取已稀释的DNA1μL作为模板，PCR所用的试剂为全式金公司的TransT aqDNAPolymeraseHighFidelity(HiFi)，反应体系为25μL，混匀后在PC R仪上进行扩增，PCR反应体系见表5所示。

表5

体系成分 体积(μL) 10×Buffer Ⅰ(含Mg2+) 2.5 dNTP(2.5mM) 2 Taq HiFi聚合酶 0.5 上游引物(10μmol) 0.5 下游引物(10μmol) 0.5 GC enhance 2.5 DNA模板(40ng/μL) 1 ddH2O 15.5 总体积 25

PCR反应程序为：94℃预变性5min；32个循环94℃变性30s，62℃退火 30s，72℃延伸2min；72℃延伸7min。

扩增产物经浓度为1.5％(w/v)的琼脂糖凝胶回收，通过T-easy载体连接 转化后，挑取25个克隆进行检测，然后将20个阳性克隆送到华大公司测序(一 般测序样品少了很难发现这一不同长度的多态性片段)，经序列比对分析，筛选 出不同长度多态性片段。

(2)分型引物设计和PCR检测

1、引物设计

由于上述SPSB2177引物扩增的片段长度是2177bp，差异不明显的片段很 难在琼脂糖凝胶上得到区分，因此B1和B2基因型的引物设计在插入性片段的 两侧进行设计，目的条带较小，差异性片段检测的灵敏度提高，且易于扩增， 其设计的引物SPSB2177P1序列为：

上游引物：5’–TACATGGTTGGTTGTGGTGCT–3’

下游引物：5’–GTGTCTGACTTGACGGGTGGT–3’

B1型表现为175bp条带，B3型表现421bp条带，B3型插入的片段序列如 SEQIDNO.6所示。

2、PCR检测

取已稀释的DNA1.5μL作为模板，PCR所用的试剂为全式金公司的Easy TaqDNAPolymerase，反应体系为25μL，混匀后在PCR仪上进行扩增，P CR反应体系见表6所示。

表6

体系成分 体积(μL) Buffer(含Mg2+) 2.5 dNTP(2.5mM) 2 EasyTaq DNA聚合酶 0.5 上游引物(10umol) 0.5 下游引物(10umol) 0.5 DNA模板(40ng/μL) 1.5 ddH2O 17.5 总体积 25

SPSB2177P1PCR反应程序为：94℃预变性5min；35个循环94℃变性0 0s，60℃退火30s，72℃延伸45s；72℃延伸7min。PCR产物在浓度为2.5 ％(w/v)的琼脂糖凝胶上140V电压电泳，条带大小选用全式金公司生产的Ma rkerI作为参照，利用BIO-RADGelDoc2000凝胶成像系统进行照相分析， 根据条带大小判断各多态性条带，421bp的条带定位B3型，175bp的条带定位 B1型，两个条带分别进行凝胶回收后测序，结果显示所测序列是预判基因序列。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的 技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描 述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还 会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发 明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

本发明所述的B1型SPSB基因、B2型SPSB基因和B3型SPSB基因序列 如下，其余序列见表7。

B1型SPSB基因序列表，SEQIDNO.7：

GTGTCTGACTTGACGGGTGGTACAAGTACATGCTAGAACGACTGAACGAGATACATTTATATGAA CAACAGTGAAACACTGCAGATCAACTAAAGTTCCTTTTTAGATCATTAGATGTGACATCTCAGTTAAG TGTGCGGTTCTGAATACTGAAAGCACCACAACCAACCATGTA

B2型SPSB基因序列表，SEQIDNO.8：

GTGTCTGACTTGACGGGTGGTACAAGTACATGCTAGAACGACTGAACGAGATACATTTATATGAA CAACAGTGAAACACTGCAGATCAACTCACCCTGTTCGTTTCGCTGGATTATTGTGGCTGAAAGTACTG TTCGCTGGTTTGTTGTGAGAGAAAAACACTGCTGGATGGCTGCTGATTCTGCTGATCCACCGAAACGA ACAGGGTGTAAAGTTCCTTTTTAGATCATTAGATGTGACATCTCAGTTAAGTGTGCGGTTCTGAATTAT GAAAGCACCACAACCAACCATGTA

B3型SPSB基因序列表，SEQIDNO.9：

GTGTCTGACTTGACGGGTGGTACAAGTACATGCTAGAACGACTGAACGAGATACATTTATATGAA CAACAGTGAAACACTGCAGATCAACTAAGGCCTCGTTTAGTTTTCCTCAAAATTCCAAGTTTTTTCAC TCTCTCTCCATCACATCAATTTTTAGCCGCTTGCATGGAGTATTAAATGTAGGTAAAAAAATAACTAATT ACACAGTTTAGTTGGAAATCACGAGATGCATCTTTTAAGCCTAGTTGGTCCATGATTGGACAATATTTA CCAAATATAAGACGAAAGTGGGACTATTCATCGGGTTGAAATTTTTTTCAATCTAAACCAGGCCTAAA GTTCCTTTTTAGATCATTAGATGTGACATCTCAGTTAAGTGTGCGGTTCTGAATTATGAAAGCACCACA ACCAACCATGTA

表7序列