技术领域
本发明涉及一株木糖氧化无色杆菌菌株及其应用。
背景技术
牛仔布印染废水含大量靛蓝，致使色度较高，且靛蓝的可生化性差，很难用微生物直接处理含靛蓝的印染废水。应用漆酶脱色靛蓝处理印染废水，与目前采用物理的光氧化法或投化学试剂沉降靛蓝的方法处理相比，具有无二次污染、可重复使用、成本低的优点，且目前牛仔布印染厂废水中不仅仅含有靛蓝一种染料，还有大量的硫化黑染料，如果采用漆酶脱色靛蓝，硫化黑就很容易沉淀回收，否则，仅用化学试剂沉淀印染废水就把两种染料沉淀在一起，还需进一步处理此废弃物。
应用漆酶脱色含靛蓝的印染废水，脱色后BOD显著升高，COD基本不变，仍然较高，不能达标排放。脱色产物中含有吲哚醌和邻氨基苯甲酸，目前应用漆酶脱色靛蓝仍处于研究阶段，脱色后产物吲哚醌和邻氨基苯甲酸的微生物降解方法报道较少。
发明内容
本发明的目的是提供一株木糖氧化无色杆菌菌株及其应用。
本发明提供的菌株为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4，其保藏登记号为CGMCC №.3632。
木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4已于2010年02月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC№.3632。
本发明提供的应用为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC№.3632在降解吲哚醌、或者吲哚醌和邻氨基苯甲酸中的应用。
所述应用中，所述降解吲哚醌的方法，是将木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC №.3632接种到含吲哚醌的体系中培养。
所述应用中，所述降解吲哚醌和邻氨基苯甲酸的方法，是将木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC №.3632接种到含吲哚醌和邻氨基苯甲酸的体系中培养。
所述应用中，所述木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC №.3632先经过28℃液体培养24-48h，将培养获得的发酵液以体积百分比为5％接种量接种到含吲哚醌的体系中。所述液体培养用的培养基为由牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L和水组成的培养基。
所述应用中，上述木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC №.3632在含吲哚醌的体系或含吲哚醌和邻氨基苯甲酸的体系中培养的温度为25℃-35℃，优选为28℃。
所述应用中，所述含吲哚醌的体系中吲哚醌的浓度为500mg/L以下，优选为100mg/L。所述含吲哚醌和邻氨基苯甲酸的体系中，所述吲哚醌和邻氨基苯甲酸的体系中，吲哚醌和邻氨基苯甲酸的浓度均为500mg/L以下，优选为100mg/L。
实验证明，木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC №.3632能够快速高效地降解吲哚醌和邻氨基苯甲酸，可用于生物法处理靛蓝经漆酶脱色后的印染废水。木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC №.3632既可以降解吲哚醌，也可以降解邻氨基苯甲酸，可以用于单独含有吲哚醌或邻氨基苯甲酸的体系中，也可以用于它们的混合体系中，降解吲哚醌或邻氨基苯甲酸。
附图说明
图1为28℃，180rpm摇床条件下木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4CGMCC №.3632菌株对100mg/L吲哚醌的降解曲线。
图2为28℃，180rpm摇床条件下木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4CGMCC №.3632菌株对100mg/L吲哚醌和100mg/L邻氨基苯甲酸混合物的降解曲线。
图3为28℃，180rpm摇床条件下木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4CGMCC №.3632菌株对50-150mg/L邻氨基苯甲酸的降解曲线。
图4为28℃，180rpm摇床条件下木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4CGMCC №.3632菌株对200-500mg/L邻氨基苯甲酸的降解曲线。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1、木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC №.3632的分离、纯化及鉴定。
2009年5月，应用无菌水将牛仔布印染废水处理池的活性污泥(采自浙江省海宁市某牛仔布印染厂)进行稀释，涂固体培养基(1L固体培养基含牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15g，其余为水)平板，分离到18株菌，采用平板划线的方法纯化菌株。将分离纯化后的18株菌分别用接种环接入液体培养基(1L培养基含牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，其余为水)进行液体培养，培养温度为28℃，180rpm培养24-48h后，以5％(体积百分含量)接种量加入到吲哚醌或邻氨基苯甲酸水溶液中，液相色谱测定结果显示N4菌株能够快速高效地降解吲哚醌和邻氨基苯甲酸，可用于生物法处理靛蓝印染废水。
N4菌株生理生化实验结果如表1所示；16S rRNA基因序列如序列表中序列1所示。根据细胞显微形态、生理生化数据和16S rRNA基因序列数据，将菌株N4鉴定为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)，并于2010年02月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC №.3632。
表1、理化实验结果
实施例2、木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC №.3632对吲哚醌降解的效果验证试验
一、对100 mg/L吲哚醌的降解效果验证试验
木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC №.3632的培养基：
固体培养基(1L)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15g，其余为水。
液体培养基(1L)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，其余为水。
将木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC №.3632接种到液体培养基中，28℃，180印m条件下培养24-48h，至培养液的OD600为0.6，然后在非无菌环境中，将培养液按照体积百分比为5％的量接种到100 mg/L吲哚醌的水溶液中，对照组加入按照体积百分比为5％的蒸馏水，28℃，180rpm培养，于不同时间取样离心，上清液用0.22um微孔滤膜过滤，应用高效液相色谱仪(采用美国Agilent公司Agilem 1200高效液相色谱仪进行分析，色谱柱为C18柱(4.6×150mm)，流动相：V(甲醇)∶V(水)=60∶40，流速1 mL/min，检测器为UV-可见检测器，检测波长为254nm，进样量为10μL)检测吲哚醌的含量。吲哚醌是以初始含量为100％，降解过程中其它检测含量值为与初始含量的比值换算的百分含量为相对含量。新物质是以降解过程中最高含量为100％，其它检测含量值为与最高含量的比值换算的百分含量为相对含量。
结果表明，在N4菌株的作用下，吲哚醌水溶液的黄色逐渐减退。液相色谱显示，在N4菌株的作用下，吲哚醌峰逐渐变小，直至消失，而对照组在实验前后吲哚醌未有显著改变。
如图1所示，N4菌株在100 mg/L吲哚醌水溶液中180rpm震荡培养12h，对吲哚醌的降解率为94.42％±0.29，18h达到完全降解；N4菌株在降解吲哚醌的同时，产生一种新物质，此物质在18h相对含量达到最高，而后逐渐降低，48h时含量(8.05％)低于实验起始含量(24.12％)。同样实验条件下的对照组吲哚醌浓度在实验前后基本保持不变。
二、对不同浓度吲哚醌降解的效果验证试验
木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC №.3632对不同浓度吲哚醌的降解
将木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC №.3632接种于液体培养基中，在28℃，180rpm培养24-48h，离心后收集菌体，用缓冲溶液(1L水中含有1.5gK2HPO4，0.5gKH2PO4，0.2gMgSO4.7H2O，1.0gNaCl，1.0g(NH4)2SO4，其余为水)洗菌3次，用缓冲溶液重悬菌体获得OD600为0.6的菌悬液，将菌悬液按照体积百分比为5％的量分别接种到50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L或500mg/L的吲哚醌水溶液中，28℃，180rpm震荡，于不同时间取样离心，上清液用0.22um微孔滤膜过滤，应用高效液相色谱仪(采用美国Agilent公司Agilent 1200高效液相色谱仪进行分析，色谱柱为C18柱(4.6×150mm)，流动相：V(甲醇)∶V(水)＝60∶40，流速1mL/min，检测器为UV-可见检测器，检测波长为254nm，进样量为10μL)检测吲哚醌的含量。
结果表明，接入木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC №.3632后，50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L的吲哚醌分别在16h、24h、24h、36h、36h、72h、84h内达到完全降解；同时生成的新物质分别在16h、24h、24h、24h、36h、48h、60h达到最高，而后分别于32h、56h、56h、60h、72h、96h、96h低于实验起始含量。
实施例3、木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC №.3632对吲哚醌和邻氨基苯甲酸混合物降解的效果验证试验
木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC №.3632的培养基：
固体培养基(1L)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15g，其余为水。
液体培养基(1L)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，其余为水。
将木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC №.3632接种到液体培养基中，28℃，180rpm条件下培养24-48h，至培养液的OD600为0.6，然后在非无菌环境中，将发酵液按照体积百分比为5％的量接种到含有100mg/L吲哚醌和100mg/L邻氨基苯甲酸的混合体系中，对照组为在混合体系中加入体积百分比为5％的蒸馏水，28℃，180rpm培养，于不同时间取样离心，上清液用0.22um微孔滤膜过滤，应用高效液相色谱仪(采用美国Agilent公司Agilent 1200高效液相色谱仪进行分析，色谱柱为C18柱(4.6×150mm)，流动相：V(甲醇)∶V(水)＝60∶40，流速1mL/min，检测器为UV-可见检测器，检测波长为254nm，进样量为10μL)检测吲哚醌和邻氨基苯甲酸的含量。以初始含量为100％，降解过程中其它检测含量值为与初始含量的比值换算的百分含量为相对含量。
结果表明，在N4菌株的作用下，溶液的黄色逐渐减退。液相色谱结果显示，在N4菌株的作用下，吲哚醌峰逐渐变小，直至消失，邻氨基苯甲酸峰值呈现先上升后下降的趋势，可能是吲哚醌降解过程中产生的新物质对邻氨基苯甲酸峰值的影响，而对照组在实验前后吲哚醌和邻氨基苯甲酸峰值未有显著改变。
如图2所示，N4菌株在100mg/L吲哚醌和100mg/L邻氨基苯甲酸的混合体系中180rpm震荡培养42h内，菌体处于生长停滞期，42h-72h为对数生长期，在此期间的42h-66h邻氨基苯甲酸含量迅速降低。培养60h，N4菌株对吲哚醌的降解率达到100％，对邻氨基苯甲酸的降解率达到53.26％；培养66h，N4菌株对吲哚醌的降解率为100％，对邻氨基苯甲酸的降解率为93.72％。
实施例4、木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC №.3632对邻氨基苯甲酸降解的效果验证试验
木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC №.3632的培养基：
固体培养基(1L)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15g，其余为水。
液体培养基(1L)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，其余为水。
一、木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC №.3632对100mg/L邻氨基苯甲酸溶液的降解
将木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC №.3632接种到液体培养基中，28℃，180rpm条件下培养24-48h，至培养液的OD600为0.6，然后在非无菌环境中，将培养液按照体积百分比为5％的量接种到100mg/L邻氨基苯甲酸的水溶液中，对照组加入按照体积百分比为5％的蒸馏水，28℃180rpm震荡培养，于不同时间取样离心，上清液用0.22um微孔滤膜过滤，应用高效液相色谱仪(采用美国Agilent公司Agilent 1200高效液相色谱仪进行分析，色谱柱为C18柱(4.6×150mm)，流动相：V(甲醇)∶V(水)＝60∶40，流速1mL/min，检测器为UV-可见检测器，检测波长为254nm，进样量为10μL)检测邻氨基苯甲酸的含量。
液相色谱结果表明，在N4菌株的作用下，邻氨基苯甲酸峰值逐渐变小，而对照组在实验前后邻氨基苯甲酸峰值未有显著改变。
N4菌株在100mg/L邻氨基苯甲酸水溶液中180rpm震荡培养12h，邻氨基苯甲酸浓度为68.01±9.66mg/L，24h邻氨基苯甲酸浓度为3.74±0.05mg/L。同样实验条件下的对照组邻氨基苯甲酸浓度在实验前后基本保持不变。
二、木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC №.3632在不同温度条件下对邻氨基苯甲酸的降解
将木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC №.3632接种到液体培养基中，在28℃，180rpm培养24-48h，至培养液的OD600为0.6，然后在非无菌环境中，将培养液按照体积百分比为5％的量接种到100mg/L的邻氨基苯甲酸水溶液中，分别在室温情况下(10℃-20℃)、25℃、30℃、35℃或40℃条件下，180rpm震荡，于不同时间取样离心，上清液用0.22um微孔滤膜过滤，应用高效液相色谱仪(采用美国Agilent公司Agilent 1200高效液相色谱仪进行分析，色谱柱为C18柱(4.6×150mm)，流动相：V(甲醇)∶V(水)＝60∶40，流速1mL/min，检测器为UV-可见检测器，检测波长为254nm，进样量为10μL)检测邻氨基苯甲酸的含量。
结果表明木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC №.3632在10℃-40℃均能降解邻氨基苯甲酸，最适宜温度范围为25℃-35℃，24h降解率均在85％以上；温度波动幅度较大的室温情况下(10℃-20℃)，24h降解率为28.43％，72h降解率为89.18％；40℃条件下24h降解率为22.61％，48h降解率为92.26％。
三、木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC №.3632对不同浓度邻氨基苯甲酸的降解
将木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC №.3632接种在液体培养基中，在28℃，180rpm培养24-48h，至培养液的OD600为0.6，然后在非无菌环境中，将培养液按照体积百分比为5％的量分别接种到50mg/L、75mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L或500mg/L的邻氨基苯甲酸水溶液中，28℃，180rpm震荡，于不同时间取样离心，上清液用0.22um微孔滤膜过滤，应用高效液相色谱仪(采用美国Agilent公司Agilent 1200高效液相色谱仪进行分析，色谱柱为C18柱(4.6×150mm)，流动相：V(甲醇)∶V(水)＝60∶40，流速1mL/min，检测器为UV-可见检测器，检测波长为254nm，进样量为10μL)检测邻氨基苯甲酸的含量。
结果如图3和图4所示，该菌株对50mg/L、75mg/L、100mg/L和150mg/L的邻氨基苯甲酸水溶液16h的降解率分别为61.19％、49.73％、46.49％和8.09％，24h的降解率分别为94.05％、95.06％、96.27％和18.69％，对150mg/L的邻氨基苯甲酸水溶液32h的降解率为93％；对200mg/L的邻氨基苯甲酸水溶液1d的降解率为4.64％，2d的降解率为97.92％；对300mg/L、400mg/L的邻氨基苯甲酸水溶液前3d未见降解，在第4d一天内完全降解；对500mg/L的邻氨基苯甲酸水溶液，则前4d未见降解，而在第5d一天内完全降解。