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1、(10)授权公告号 CN 101880636 B (45)授权公告日 2012.07.11 CN 101880636 B *CN101880636B* (21)申请号 201010192303.X (22)申请日 2010.06.04 CGMCC No.2757 2008.11.21 C12N 1/18(2006.01) C12N 13/00(2006.01) C12N 15/01(2006.01) C12P 7/06(2006.01) C12R 1/865(2006.01) (73)专利权人 天津大学 地址 300072 天津市南开区卫津路 92 号 (72)发明人 元英进 李炳志 白云海 。
2、查健 王昕 (74)专利代理机构 天津市北洋有限责任专利代 理事务所 12201 代理人 陆艺 CN 101434913 A,2009.05.20, 全文 . 郭亭等 . 工业用糖蜜酿酒酵母菌株耐受性分 析研究 .微生物学通报 .2008, 第 35 卷 ( 第 2 期 ),188-192. Ying-Jin Yuan.Comparative lipidomics of four strains of Saccharomyces cerevisiae reveals different responses to furfural,phenol,and acetic acid.Journal o。
3、f agricultural and food chemistry .2008, 第 57 卷 ( 第 1 期 ),99-108. (54) 发明名称 酿酒酵母的耐受多种抑制剂的菌株 (57) 摘要 本发明公开了一种酿酒酵母的耐受多种抑 制剂的菌株， 其命名为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)YYJ003， 保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为 CGMCC NO.2757。 本发明一种酿酒酵母的耐受多种抑制剂 的菌株可以在含有稀酸预处理产生的抑制剂的培 养基中正常生长并实现高效的乙醇生产。本发明 的菌株突破了限制稀酸预处理法生产纤维素乙醇 。
4、的一个瓶颈问题。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 于婷 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 5 页 1/1 页 2 1. 一种酿酒酵母的耐受多种抑制剂的菌株， 其命名为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)YYJ003， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为 CGMCCNO.2757。 权 利 要 求 书 CN 101880636 B 2 1/5 页 3 酿酒酵母的耐受多种抑制剂的菌株 技术领域 。
5、0001 本发明涉及一种酿酒酵母， 特别是涉及一种酿酒酵母耐受多种抑制剂的菌株。 背景技术 0002 在纤维素乙醇生产工艺中， 酸法预处理由于其成本低廉和可操作性强， 受到多数 机构的青睐， 被认为是最容易实现工业化的预处理方法， 如稀酸预处理和蒸汽爆破预处理。 然而， 由于这些化学预处理的条件一般都是高温高压， 所以会导致一些抑制性物质的产生， 如呋喃类、 弱酸类、 酚类等。这些抑制性物质对后续发酵微生物有非常强烈的抑制作用， 严 重影响纤维素水解液的乙醇发酵产率和速率。 已有实验证明这些抑制剂抑制多种发酵微生 物， 包括大肠杆菌、 运动发酵单胞菌、 树干毕赤酵母和酿酒酵母等， 其中， 酿酒。
6、酵母是其中耐 受能力最强的菌种之一。 另外， 酿酒酵母是在乙醇发酵中应用最广泛的菌株， 酿酒酵母的优 势包括 ： (1) 葡萄糖的转化速率快， (2) 产物专一性高， (3) 对工业生产环境具有稳健性等。 0003 能够耐受纤维素水解液中的抑制剂的菌株的筛选和构建是纤维素乙醇生产研究 中的一个重要问题。 早期有研究表明， 这些抑制剂主要抑制微生物的生长， 而对发酵能力的 影响比对生长的影响小的多。 人们希望获得能耐受多种抑制剂的酿酒酵母菌株来实现纤维 素乙醇生产中的原位脱毒和高效发酵， 因为脱毒步骤会明显增加纤维素乙醇的生产成本， 降低纤维素乙醇的市场竞争力。 发明内容 0004 本发明的目的。
7、是克服现有技术中的不足， 提供一种酿酒酵母的耐受多种抑制剂的 菌株。 0005 本发明的技术方案概述如下 ： 0006 一种酿酒酵母的耐受多种抑制剂的菌株， 其命名为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)YYJ003， 简称YYJ003， 已于2008年11月21日送交并保藏于北京市的中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为 CGMCC NO.2757。 0007 该菌株在含有多种纤维素乙醇生产中产生的抑制剂的培养基中正常生长。 0008 所述抑制剂为糠醛、 苯酚和乙酸。 0009 所述抑制剂糠醛的含量为 1.3g/L， 苯酚的含量为 0.5g/L， 乙。
8、酸的含量为 5.3g/L。 0010 在纤维素乙醇生产工艺中， 稀酸预处理法被认为是最有潜力的纤维素预处理方 法， 但由于抑制剂的产生及其对微生物的毒害作用而使该方法的广泛应用受到限制。本发 明一种酿酒酵母的耐受多种抑制剂的菌株可以在含有稀酸预处理产生的抑制剂的培养基 中正常生长并实现高效的乙醇生产。 本发明的菌株突破了限制稀酸预处理法生产纤维素乙 醇的一个瓶颈问题。 附图说明 0011 图 1 是 YYJ003 菌株的菌落形态 ； 说 明 书 CN 101880636 B 3 2/5 页 4 0012 图 2 是 YYJ003 菌株的细胞形态 ； 0013 图 3 是在摇瓶上 YYJ003 。
9、菌株与原始 S 菌株在混合抑制剂下的生长曲线 ； 0014 图 4 是 YYJ003 菌株与原始 S 菌株在含混合抑制剂的低糖培养基中的发酵生长曲 线 ； 0015 图 5 是 YYJ003 菌株与原始 S 菌株在含混合抑制剂的低糖培养基中的糖耗和乙醇 曲线 ； 0016 图 6 是 YYJ003 菌株与原始 S 菌株在含混合抑制剂的低糖培养基中的糠醛转化曲 线 ； 0017 图 7 是 YYJ003 菌株与原始 S 菌株在含混合抑制剂的高糖培养基中的发酵生长曲 线 ； 0018 图 8 是 YYJ003 菌株与原始 S 菌株在含混合抑制剂的高糖培养基中的糖耗和乙醇 曲线 ； 0019 图 9。
10、 是 YYJ003 菌株与原始 S 菌株在含混合抑制剂的高糖培养基中的糠醛转化曲 线。 具体实施方式 0020 为了充分公开本发明的一种酿酒酵母的耐受多种抑制剂的菌株， 结合实施例加以 说明， 但并不表示对本发明的限制。 0021 实施例 1 0022 YYJ003 菌株的分离 0023 本发明的一株酿酒酵母的耐受多种抑制剂的新菌株 YYJ003 菌株是在对工业酿酒 酵母(Saccharomyces cerevisiae)进行紫外线诱变后通过多种抑制剂耐受驯化得到的。 紫 外线诱变策略是 ： 将原始 S 菌株的培养液 (YEPD 培养基 ： 葡萄糖 20g/L， 酵母粉 10g/L， 蛋白 胨。
11、20g/L)进行稀释后铺于含抑制剂的筛选培养基(添加抑制剂的YEPD培养基)， 将铺好的 平板距离 15W 紫外灯下 30cm 处照射 60 秒， 放于 30培养箱中避光培养 3 天。菌株驯化步 骤是 ： 将筛选培养基上长出的菌落转接到含有抑制剂的液体筛选选择培养基中培养， 培养 条件为 30， 180rpm。当培养至稳定期后， 按 OD600 0.1 接种至另一个新的有抑制剂的液 体选择培养基中继续进行培养。在菌株转接至新培养基中时， 逐渐增加抑制剂浓度到抑制 剂含量达到真实纤维素稀酸水解液中的量。从驯化后的培养液中分离得到菌株 YYJ003， 其 菌落形态如图 1 所示， 其细胞形态如图 。
12、2 所示。 0024 实施例 2 0025 在摇瓶上比较 YYJ003 菌株与原始菌株的生长 0026 1、 试验材料 ： 菌株 YYJ003 由本实验室筛选并保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心， 保藏号为 CGMCC NO.2757 ； 原始菌株 Saccharomyces cerevisiae 购 自湖北安琪酵母有限公司， 简称 S 菌株。 0027 2、 试验方法 ： 0028 种子培养基 ： 0029 YYJ003菌株 ： 葡萄糖20g/L， 酵母粉10g/L， 蛋白胨20g/L， 糠醛1.3g/L， 苯酚0.5g/ L， 乙酸 5.3g/L， 121灭菌 20min。。
13、原始菌株 ： 萄糖 20g/L， 酵母粉 10g/L， 蛋白胨 20g/L， 说 明 书 CN 101880636 B 4 3/5 页 5 121灭菌 20min。 0030 发酵培养基 ： 0031 葡萄糖 20g/L， 酵母粉 10g/L， 蛋白胨 20g/L， 121灭菌 20min。发酵前加入抑制剂 使其 终浓度达到糠醛 1.3g/L， 苯酚 0.5g/L， 乙酸 5.3g/L。 0032 将 YYJ003 菌株和原始菌株分别接种于 100mL 种子培养基中， 在 30、 180rpm 培养 12-14h， 均以初始菌体浓度 OD600 0.1 接种于有 100mL 发酵培养基的 25。
14、0mL 锥形瓶中， 于 30、 180rpm 条件下培养， 使用 722 型分光光度计测定菌体生长曲线。 0033 3、 试验结果 ： 0034 如图 3 所示， YYJ003 菌株在经过 23h 后开始进入对数生长期， 表现出快速生长， 到 48h 时， 生长十分明显， 并逐渐向稳定期转入， 约 80h， 生长进入稳定期。而原始菌株， 在整个 发酵过程中均未表现出明显的生长趋势， 直至 118 小时， 菌体仍未度过停滞期。由此可知， YYJ003 菌株在含有抑制剂的条件下， 表现出十分明显的生长优势， 与原始菌株相比， 其更能 适应含有抑制剂的环境。 0035 4、 结论 ： 0036 在含。
15、有抑制剂(浓度如上所述)条件下， 原始菌株没有表现出明显的生长趋势， 而 YYJ003 却能适应抑制剂环境， 实现在抑制剂存在下的生长。 0037 实施例 3 0038 2葡萄糖培养基发酵罐中比较 YYJ003 菌株与原始菌株的发酵性能 0039 1、 试验材料 ： 同实施例 2。 0040 2、 试验方法 ： 0041 种子、 发酵培养基的制备同实施例 2。 0042 将 YYJ003 菌株和原始菌株分别接种于 100mL 种子培养基中， 在 30、 180rpm 培养 12-14h， 均以初始菌体浓度 OD600 0.1 接种于有 3L 发酵培养基的 5L 发酵管中， 于 30、 300r。
16、pm 条件下培养， 测定菌体生长曲线、 葡萄糖浓度、 乙醇浓度和糠醛浓度。 0043 3、 分析方法 ： 0044 菌体浓度以 722 型分光光度计测定其在 600nm 处吸光值表征。葡萄糖浓度、 乙醇 浓度用高效液相色谱 (Waters1515) 测定， 色谱柱为 Aminex HPX-87H， 柱温 ： 65， 检测器 ： Waters 示差检测器 2421， 流动相为 5mM 硫酸溶液， 流速 0.6mL/min， 进样量为 10L。糠醛 浓度也用高效液相测定， 色谱柱为 C18 柱， 柱温 ： 室温， 检测器 ： 兰博紫外检测器， 检测波长 为 254nm， 流动相为甲醇水 6 4， 。
17、流速 0.6mL/min， 进样量为 10L。 0045 4、 计算方法 ： 0046 乙醇含量 (g/L) ( 样品峰面积 标准溶液浓度 )/ 标准溶液峰面积 100 ； 0047 乙醇产率 (g/g) 测得乙醇含量 /( 消耗糖的量 0.51) 0048 葡萄糖和糠醛含量计算同乙醇含量。 0049 5、 试验结果 0050 由图 4 所示， 在发酵罐中进行发酵时， 与原始菌株相比， YYJ003 表现十分好的发酵 特性。经过约 10h， YYJ003 便进入了对数生长期， 并表现出较快的生长速度， 至 22h 左右， 生 长进入稳定期， 发酵过程基本结束。 而原始菌株则不同， 在发酵罐中经。
18、过约50h， 其才表现出 一定生长趋势， 而且生长速度并不快， 并未完全进入对数生长期。到 120h 时， 菌体生 长速 说 明 书 CN 101880636 B 5 4/5 页 6 度加快， 表现出明显的对数生长状态。直至 135h 左右， 其生长进入稳定期， 发酵过程逐渐结 束。 0051 由图5可知， YYJ003对葡萄糖的利用能力明显强于原始菌株S。 经过约20h， YYJ003 可将培养液中葡萄糖完全消耗。与之相对应的， 乙醇产生速率也明显快于原始菌株 S， 其最 终乙醇产量为 9.33g/L， 达到理论产量的 91.5。而原始菌株经过 110h 左右对葡萄糖的利 用仅为 35， 至。
19、 140h 左右， 培养基中葡萄糖完全被消耗完。最终乙醇产量为 7.81g/L， 为 YYJ003 菌株的 83.7。这充分体现出 YYJ003 在利用葡萄糖发酵乙醇方面的优势， 其发酵 性能明显优于原始菌株 S。 0052 由图 6 可以看出， 在对糠醛的代谢能力上， 耐受菌株 YYJ003 与原始菌株 S 也有很 大差异。YYJ003 对糠醛的代谢速度明显快于原始菌株 S， 经过 16h 左右， 便能将初始培养基 中加入的糠醛全部消耗， 而原始菌需要约 140h。 0053 6、 结论 0054 耐受菌株 YYJ003 能够以较快的速度代谢发酵抑制剂糠醛， 且在有抑制剂 ( 浓度 如上所述。
20、 ) 存在的培养基中表现出较好的发酵特性， 对葡萄糖的利用能力明显优于原始菌 株， 乙醇产率较高， 达到 91.5。 0055 实施例 4 0056 10葡萄糖培养基发酵罐中比较 YYJ003 菌株与原始菌株的发酵性能 0057 1、 试验材料 ： 同实施例 2。 0058 2、 试验方法 ： 0059 种子培养基的制备同实施例 2。 0060 发酵培养基的制备 ： 葡萄糖 100g/L， 酵母粉 10g/L， 蛋白胨 20g/L， 糠醛 1.3g/L， 苯 酚 0.5g/L， 乙酸 5.3g/L， 121灭菌 20min。 0061 将 YYJ003 菌株和原始菌株分别接种于 100mL 各。
21、自的种子培养基中， YYJ003 菌株 在 30、 180rpm 培养 24h， 原始菌株 S 在同样条件下培养 12-14h， 均以初始 OD600 1.0 接 种于 3L 发酵培养基， 于 30、 300rpm 条件下培养， 测定菌体生长曲线， 葡萄糖浓度， 乙醇浓 度和糠醛浓度。 0062 3、 分析方法 ： 0063 同实施例 3。 0064 4、 计算方法 ： 0065 同实施例 3。 0066 5、 试验结果 0067 由图 7 所示， 在发酵罐中进行高糖、 高密度接种发酵时， 与原始菌株相比， YYJ003 表现良好的发酵特性。从发酵初期， 菌体 YYJ003 便表现出较强的生长。
22、能力， 几乎不经过延 迟期， 便可达到对数生长阶段， 并表现出较快的生长速度。至 17h 左右， 生长进入稳定期， 发 酵过程基本结束。而原始菌株 S 则不同， 在发酵罐中经过约 45h 的延迟期， 才表现出一定生 长趋势， 并逐渐进入对数生长阶段。在对数生长期中， 其生长速度仍比 YYJ003 慢， 直至 90h 左右， 其生长逐渐进入稳定期， 最高菌体密度仅为 YYJ003 的 60左右。 0068 由图8可知， YYJ003对葡萄糖的利用能力明显强于原始菌株S。 经过约17h， YYJ003 可将培养液中葡萄糖完全消耗。与之相对应的， 乙醇产生速率也明显快于原始菌株 S， 其最 说 明 。
23、书 CN 101880636 B 6 5/5 页 7 终乙醇产量为 47.33g/L， 达到理论产量的 92.8。而原始菌株需要经过约 93h 才能将全部 葡萄糖代谢完， 最终乙醇产量 47.25g/L， 略低于菌株 YYJ003。 0069 由图 9 可以看出， 在对糠醛的代谢能力上， 耐受菌株 YYJ003 与原始菌株 S 也有很 大差异。YYJ003 对糠醛的代谢速度明显快于原始菌株 S， 经过 6h 左右， 便能将初始培养基 中加入的糠醛全部消耗， 而原始菌需要约 40h。 0070 6、 结论 0071 耐受菌株 YYJ003 能够以较快的速度代谢发酵抑制剂糠醛， 表现出其对抑制剂的。
24、 不敏感性， 在有抑制剂 ( 浓度如上所述 ) 存在的培养基中表现出较好的发酵特性。耐受菌 株最终乙醇产量为理论值的 92.8， 原始菌株最终乙醇产量略低于耐受菌株， 并且其发酵 时间为耐受菌株的 5.5 倍， 比较可知 YYJ003 在高糖、 高密度接种条件下有十分优越的发酵 性能。 0072 实验证明， 在摇瓶水平上， 混合抑制剂 ( 糠醛的含量为 1.3g/L， 苯酚的含量为 0.5g/L， 乙酸的含量为5.3g/L ； 如无特殊说明抑制剂浓度均与此一致)对低接种密度(OD600 0.1) 下的 YYJ003 菌株的生长没有受到明显的抑制作用。最终菌体密度达到 OD600 2.0 以上。。
25、 0073 在发酵罐水平上， YYJ003 菌株在低接种密度 (OD600 0.1) 下在 24 小时内完成发 酵含混合抑制剂 2葡萄糖的培养基， 细胞的生长基本没有受到抑制。YYJ003 菌株在 16 小 时内完全转化了培养基中的糠醛。乙醇产量达到理论产量的 91.5。 0074 在发酵罐水平上， YYJ003 菌株在接种密度为 OD600 1.0 下在 17 小时内完成发酵 含混合抑制剂 10葡萄糖的培养基， 细胞的生长基本没有受到抑制。YYJ003 菌株在 6 小时 内完全转化了培养基中的糠醛。其最终乙醇浓度为 47.33g/L， 达到理论产量的 92.8。 0075 本发明的菌株能在含。
26、有多种抑制剂的培养基中生长， 结果显示本发明的菌株的发 酵速率在原有基础上有很大的提高， 在含有混合抑制剂的 2葡萄糖和 10葡萄糖培养基 中的发酵时间分别是原始菌株的 1/7 和 1/4。 0076 YYJ003 菌株在发酵罐中发酵含有抑制剂的培养基， 发酵条件为 ： 300rpm， 30， 不 通气。发酵时间与糖浓度相关。培养基的组成为 ： 葡萄糖为 10 200g/L， 酵母粉为 1.5 20g/L， 蛋白胨为 2 40g/L。接种密度为 OD600 0.1 2.0。 说 明 书 CN 101880636 B 7 1/5 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 101880636 B 8 2/5 页 9 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 101880636 B 9 3/5 页 10 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 101880636 B 10 4/5 页 11 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 101880636 B 11 5/5 页 12 图 8 图 9 说 明 书 附 图 CN 101880636 B 12 。