一种与二花脸母猪产仔性状相关的SNP标记及其引物.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510116386.7 (22)申请日 2015.03.17 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104651527 A (43)申请公布日 2015.05.27 (73)专利权人 南京农业大学 地址 211225 江苏省南京市溧水区白马镇 国家农业科技园南京农业大学基地 (72)发明人 黄瑞华贺丽春李平华周波 马翔顾岳清 (74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 代理人 傅婷婷徐冬涛 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006。

2、.01) C12N 15/11(2006.01) 审查员 王胜佳 (54)发明名称 一种与二花脸母猪产仔性状相关的SNP标记 及其引物 (57)摘要 本发明属于分子生物学技术领域， 涉及一种 与二花脸母猪产仔性状相关的SNP标记及其引 物。 所述SNP标记位于猪7号染色体上的成对两亲 性螺旋蛋白SIN3A基因的核苷酸序列上， 所述SNP 标记的位点为国际猪基因组10.2版本参考序列 猪7号染色体上g.62920973核苷酸位点， 且具有 为G/A多态性， 所述SNP标记与二花脸母猪窝产总 仔数极显著相关。 一种用于检测所述的SNP标记 的引物对， 上游引物为： SEQIDNO： 2， 下游引物。

3、 为： SEQIDNO： 3。 本发明提供的SNP标记与二花 脸母猪的产仔性能相关， 可以通过鉴定该SNP标 记来筛选高产的二花脸母猪品系， 所得的二花脸 母猪高产品系具有重要的经济效益与社会价值。 权利要求书1页 说明书5页 序列表3页 附图1页 CN 104651527 B 2017.01.04 CN 104651527 B 1.一种与二花脸母猪产仔性状相关的SNP标记， 其特征在于所述SNP标记位于猪7号染 色体上的成对两亲性螺旋蛋白SIN3A基因的核苷酸序列上， 所述SNP标记的位点为国际猪基 因组10.2版本参考序列猪7号染色体上g.62920973核苷酸位点， 且具有为G/A多态性。

4、， 所述 SNP标记与二花脸母猪窝产总仔数极显著相关。 2.一种基于权利要求1所述的SNP开发分子标记的方法， 其特征在于以含有权利要求1 所述的SNP标记的核苷酸序列为基础序列， 设计引物对， 以二花脸母猪基因组DNA为模板进 行PCR扩增， 使权利要求1所述的SNP标记转化为分子标记。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于所述的引物对序列为上游引物： SEQIDNO： 2， 下游引物： SEQIDNO： 3； 所述的分子标记序列如SEQIDNO： 1所示， 所述的SNP位点位于 第983位， 存在G/A多态性。 4.按照权利要求2或3所述的方法得到的分子标记。 5.根据权利要求4所述。

5、的分子标记， 其特征在于分子标记序列如SEQIDNO： 1所示， 所 述的SNP位点位于第983位， 存在G/A多态性。 6.一种用于检测权利要求1所述的SNP标记的引物对， 其特征在于上游引物为： SEQID NO： 2， 下游引物为： SEQIDNO： 3。 7.一种检测权利要求1所述的SNP标记的方法， 其特征在于包含PCR扩增二花脸母猪基 因组中含有权利要求1所述的SNP标记的一段序列， 对扩增产物进行测序， 判读该位点的G/A 多态性。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于包括以下步骤： （1） 取一头二花脸母猪的耳组织样品并提取总DNA； （2） 用已提取的二花脸母猪基因组D。

6、NA为模板， 使用权利要求6所述的引物对进行PCR扩 增； （3） 扩增产物进行测序， 分析测序结果， 判读在SEQIDNO： 1第983位的G/A多态性。 9.权利要求6所述的引物对在检测二花脸母猪g.62920973核苷酸位点的基因型筛选高 产二花脸母猪品系中的应用； 其中g.62920973位点具有GG基因型的二花脸个体母猪窝总产 仔数显著高于具有AA基因型的二花脸个体母猪窝总产仔数。 10.一种筛选高产二花脸母猪品系的方法， 其特征在于包括检测国际猪基因组10.2版 本参考序列猪7号染色体上g.62920973核苷酸位点的基因型， g.62920973位点具有GG基因 型的二花脸个体母。

7、猪窝总产仔数显著高于具有AA基因型的二花脸个体母猪窝总产仔数； 选 育g.62920973核苷酸位点的GG型个体作为种猪。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104651527 B 2 一种与二花脸母猪产仔性状相关的SNP标记及其引物 技术领域 0001 本发明属于分子生物学技术领域， 涉及一种与二花脸母猪产仔性状相关的SNP标 记及其引物。 背景技术 0002 母猪产仔数是反映猪场生产水平和经济效应的重要指标， 并直接影响我国节粮、 减排、 高效养猪业的可持续发展。 2014年12月底我国能繁母猪存栏数约为4300万头， 如果母 猪平均每胎多产仔1头， 按每年每头母猪产2胎计算， 则每年可为。

8、整个行业多提供约9000万 头猪， 这对我国的养猪业可起到很大的促进作用。 随着我国经济持续快速的发展， 人们生活 水平逐渐提高， 对猪肉的需求量也越来越大， 因此， 人们也越来越关注如何提高猪的产仔数 性能。 产仔数为复杂多基因控制的经济性状， 遗传力低， 通过传统的选育方法提高猪产仔数 收效甚微， 所以开发和利用新的分子选育标记来提高猪的繁殖性能倍受重视。 0003 二花脸是位于我国太湖流域的国家级畜禽遗传资源保护品种， 是我国劳动人民千 百年来选育的产仔性能极其优秀的地方猪种资源。 多年以来虽然国内已有大量的研究机构 利用二花脸来鉴别二花脸猪种高繁殖力的遗传机理， 但限于研究方法、 手段。

9、、 材料及繁殖性 状本身复杂性等众多因素的制约， 二花脸猪种高繁殖力遗传机制并没有得到充分的揭示和 有效的利用。 0004 另外， 值得注意的是， 国外通过对梅山猪繁殖机理系统研究后， 已将其高繁殖力性 能转移到一些瘦肉型猪种中， 使这些猪种繁殖性能明显提高。 如近年来我国大型种猪企业 热衷从法国或丹麦引进的猪种普遍繁殖力很高， 导致我国地方猪高产优势产生削弱风险， 对地方猪种质资源的安全产生了重要威胁， 而这是国人不得不面对并亟需寻求对策的现 实。 当然幸运的是基于保持我国二花脸猪原产地的猪种优势之考虑， 当初国家采取了对二 花脸猪不准出口的强制措施， 使产仔数最高的这一猪种未流出海外。 因。

10、此， 通过鉴别二花脸 猪品种内产仔数变异的基因和标记， 进一步提升二花脸猪的产仔性能， 对培育具有我国自 主知识产权的高产商品猪新品系具有重要意义。 0005 从国际猪QTL数据库网站(http:/www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/SS/ index)知， 目前在猪除10、 11号染色体及性染色体上没有定位到影响总产仔数的QTL， 其它 常染色体上都已定位到影响总产仔数的QTL， 但大部分是利用微卫星标记定位的QTL， 置信 区间多在10-20cM， 无法确定真正的主效基因及其关键变异位点， 因此难以直接应用于种猪 选育改良。 发明内容 0006 本发明的目。

11、的在于针对现有技术不足， 产仔数的低遗传力， 提供与母猪窝总产仔 数相关的SNP标记。 0007 本发明的另一个目的在于提供用于检测上述SNP标记的引物和检测方法。 0008 本发明的另一个目的在于提供上述SNP标记的用途。 说明书 1/5 页 3 CN 104651527 B 3 0009 一种与二花脸母猪产仔性状相关的SNP标记， 所述SNP标记位于猪7号染色体上的 成对两亲性螺旋蛋白SIN3A基因的核苷酸序列上， 所述SNP标记的位点为国际猪基因组10.2 版本参考序列猪7号染色体上g.62920973核苷酸位点， 且具有为G/A多态性， 所述SNP标记与 二花脸母猪窝产总仔数极显著相关。

12、。 0010 g.62920973位点具有GG基因型的二花脸个体母猪窝总产仔数显著高于具有AA基 因型的二花脸个体母猪窝总产仔数。 0011 一种基于本发明所述的SNP开发分子标记的方法， 以含有本发明所述的SNP标记的 核苷酸序列为基础序列， 设计引物对， 以二花脸母猪基因组DNA为模板进行PCR扩增， 使本发 明所述的SNP标记转化为分子标记。 0012 其中， 所述的引物对序列为上游引物： SEQIDNO： 2， 下游引物： SEQIDNO： 3； 所述 的分子标记序列如SEQIDNO： 1所示， 所述的SNP位点位于第983位， 存在G/A多态性。 0013 按照本发明上述方法得到的分。

13、子标记。 0014 所述的分子标记优选序列如SEQIDNO： 1所示， 所述的SNP位点位于第983位， 存在 G/A多态性。 0015 一种用于检测所述的SNP标记的引物对， 上游引物为： SEQIDNO： 2， 下游引物为： SEQIDNO： 3。 0016 一种检测本发明所述的SNP标记的方法， 包含PCR扩增二花脸母猪基因组中含有本 发明所述的SNP标记的一段序列， 对扩增产物进行测序， 判读该位点的G/A多态性。 0017 所述的检测本发明所述的SNP标记的方法， 优选包括以下步骤： 0018 (1)取一头二花脸母猪的耳组织样品并提取总DNA； 0019 (2)用已提取的二花脸母猪基。

14、因组DNA为模板， 使用所述的引物进行PCR扩增； 0020 (3)扩增产物进行测序， 分析测序结果， 判读在SEQIDNO： 1第983位的G/A多态性。 0021 其中， 步骤(2)所述的PCR优选扩增反应体系为： DNA模板2.5 L、 SEQIDNO： 2和SEQ IDNO： 3所示的引物各1.25 L、 PCRMix试剂25 L、 双蒸水20 L； 其中所述DNA模板浓度为 30ng/ L， 所述引物的浓度为10mol/L， 所述PCRMix试剂为南京欧科生物技术有限公司的 P394961L型号试剂； PCR扩增的反应程序为： 预变性962min； 变性9620s； 退火6030s，。

15、 延伸7245s， 35个循环； 延伸7210min。 0022 本发明所述的SNP标记、 所述的分子标记、 所述的引物在筛选高产二花脸母猪品系 中的应用。 0023 一种筛选高产二花脸母猪品系的方法， 包括检测二花脸母猪g.62920973核苷酸位 点的基因型， 选育g.62920973核苷酸位点的GG型个体作为种猪。 0024 有益效果： 0025 本发明提供的SNP标记与二花脸母猪的产仔性能相关， 因此， 可以通过鉴定该SNP 标记来筛选高产的二花脸母猪品系， 所得的二花脸母猪高产品系具有重要的经济效益与社 会价值。 附图说明 0026 图1为高产与相对低产二花脸群体间染色体上SNP标记。

16、Fst值的分布情况。 其中， 猪 的18条常染色体及X染色体信息标识于X轴。 说明书 2/5 页 4 CN 104651527 B 4 0027 图2为使用本发明的引物扩增SIN3A基因的电泳图。 0028 图3为SIN3A基因的突变位点不同基因型的DNA测序结果峰图。 具体实施方式 0029 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 在不背离本发明精神 和本质的情况下， 对本发明方法、 步骤或条件所作的修改或替换， 均属于本发明的范围。 0030 实施例1 0031 1、 实验动物来源 0032 江苏常州焦溪二花脸猪专业合作社。 0033 计算207头二花脸母猪的育种值， 计算。

17、模型为 0034 Y(窝产总仔数)parity(胎次)+farm(场)+year(年度)+season(季节)+age(母猪 分娩年龄)+sire(与配公猪)+permanenteffect(母猪的永久效应)+additiveeffect(个 体的加性效应)+e(残差)， 0035 其中包括固定效应-胎次、 母猪分娩的场/年/季， 协变量-母猪分娩的年龄， 随机效 应-与配公猪， 永久效应-母猪， 个体加性遗传值。 选择育种值较高的23个个体与育种值较低 的25个个体。 0036 2、 提取基因组DNA 0037 采集48头母猪的耳组织样品， 放置于装有70酒精的离心管内， -20冰箱保存备 。

18、用。 0038 使用传统酚/氯仿法提取耳组织基因组DNA， 所需试剂包括： 0039 裂解液实验室配备 0040 蛋白酶K(德国MERCK生物科技有限公司) 0041 Tris饱和酚(北京索莱宝生物科技有限公司) 0042 Tris饱和酚： 氯仿： 异戊醇(25： 24： 1)(北京索莱宝生物科技有限公司) 0043 氯仿(江苏永华精细化学品有限公司) 0044 无水乙醇(广东光华科技股份有限公司) 0045 3M乙酸钠(北京索莱宝生物科技有限公司) 0046 具体步骤如下所述： 0047 (1)取黄豆大小组织样， 尽量剪碎放入2ml离心管中； 0048 (2)加入裂解液(自己配备)800 L。

19、， 及蛋白酶K30 L(0mg/ml)； 0049 (3)样品置于55恒温箱中孵育过夜， 至管中无组织块为止； 0050 (4)加入Tris饱和酚800 L， 轻微混匀10min， 412000r/min离心12min； 0051 (5)取650 L上清加Tris饱和酚： 氯仿： 异戊醇(25： 24： 1)800 L， 混摇10min， 4 12000r/min离心12min； 0052 (6)取550 L上清， 加氯仿800 L， 混摇10min， 412000r/min离心12min； 以下步骤 换1.5ml的离心管 0053 (7)取450 L上清， 加无水乙醇800 L， 3M乙酸钠。

20、40 L， 混摇6min， 41000r/min离心 8min； 0054 (8)弃上清留下DNA沉淀团， 加入1000 L70乙醇(自己配备)， 混摇5min， 4 说明书 3/5 页 5 CN 104651527 B 5 1000r/min离心5min， 弃上清(如需要可重复一次)； 0055 (9)将离心管放入通风橱， 吹干至管内无小滴； 0056 (10)样品加100 L超纯水， 轻微吹打至DNA溶解， 经过Nanodrop-100分光光度计检 测质量与浓度后将浓度同一稀释到50ng/ L于-20下保存备用。 0057 3、 猪全基因组6万个(60K)SNP基因型检测 0058 上述个。

21、体的DNA在IlluminaBeadstation平台上根据公司标准流程进行猪全基因 组60KSNP(Illumina， 美国)基因型判定。 利用PLINK(1.9)对所有样本60K芯片数据进行质 量控制， 剔除检出率低于0.95、 家系孟德尔错误率高于0.05的个体； 最小等位基因频率小于 0.05的SNP标记。 0059 4、 高产和相对低产群体Fst值的计算 0060 使用Powermarker软件包对对分型个体的60KSNP标记型数据进行处理， 计算得到 两个群体的每一个SNP位点遗传分化系数Fst值。 结果显示， 7号染色体存在一个较高的点， 该SNP标记极有可能与总产仔数性状相关(。

22、图1)。 0061 实施例2 0062 本实施例为实施例1中得到的SNP位点g.62920973G/A在二花脸母猪群体内的验 证。 0063 1、 提取二花脸母猪基因组DNA 0064 采集具有准确窝总产仔数记录的132头纯种二花脸母猪的耳组织样品， 放置于装 有70酒精的离心管内， -20冰箱保存备用。 利用上述方法提取耳组织基因组DNA， 经过质 量、 浓度检测后将浓度稀释到30ng/ L于-20下保存备用。 0065 2、 目的片段PCR扩增与测序 0066 用已提取的DNA为模板， 根据所设计的引物， 进行PCR扩增： 取DNA模板2.5 L、 SEQ IDNO： 2和SEQIDNO：。

23、 3所示的引物各1.25 L、 PCRMix试剂25 L、 双蒸水20 L； 设置PCR扩增 体系： 预变性962min； 变形9620s； 退火6030s； 延伸7245s； 35个循环； 然后延伸 10min。 0067 PCR产物在1.2琼脂糖凝胶中电泳检测， 扩增的目的片段大小为900bp， 电泳图见 图2， 将剩余的扩增产物进行测序， 测序结果用DNAman软件与GenBank中猪的相关基因片段 序列比对、 分析， 判读g.62920973G/A的基因型， 然后利用SAS软件进行基因型对表型的影响 效应分析。 分析模型为Yijklmu+Gj+Bk+Pl+eijklm 0068 其中：。

24、 Yijkm为猪的产仔数； Gj代表第j个SNP的基因型固定效应； Bk是第k个批次固定 效应； Pl是胎次的随机效应， 不同胎次的产仔数记录作为重复数据处理； eijklm为残差。 0069 显著性的P值经过10000次的随机抽样校正。 0070 表1给出了g.62920973G/A突变位点在纯种二花脸群体中对窝总产仔数的影响效 应。 由表1可知， 纯种二花脸猪中， g.62920973G/A位点的GG基因型个体与AA型个体相比较： 窝总产仔数平均增加1.28头。 由此可见， 在二花脸猪种中， 继代选育g.62920973G/A位点的 GG型个体， 均可逐步提高二花脸母猪的窝总产仔数， 达到提高二花脸母猪繁殖性能的目的。 0071 表1、 g.62920973G/ASNP位点与二花脸母猪窝总产仔数的关联分析 说明书 4/5 页 6 CN 104651527 B 6 0072 说明书 5/5 页 7 CN 104651527 B 7 0001 序列表 1/3 页 8 CN 104651527 B 8 0002 序列表 2/3 页 9 CN 104651527 B 9 0003 序列表 3/3 页 10 CN 104651527 B 10 图1 图2 图3 说明书附图 1/1 页 11 CN 104651527 B 11 。