发光聚合物的纳米颗粒以及其制备方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101885913 B (45)授权公告日 2012.09.26 CN 101885913 B *CN101885913B* (21)申请号 200910180478.6 (22)申请日 2009.10.16 10-2009-0041898 2009.05.13 KR C08L 77/00(2006.01) C08L 71/02(2006.01) C08K 5/103(2006.01) C08G 69/38(2006.01) C08J 3/16(2006.01) C09K 11/06(2006.01) A61K 49/00(2006.01) G01N 21/64(20。

2、06.01) (73)专利权人 韩国科学技术研究院 地址 韩国首尔 (72)发明人 金世勋 权翊赞 金光明 崔贵元 林昌根 (74)专利代理机构 北京康信知识产权代理有限 责任公司 11240 代理人 吴贵明 张英 CN 1298903 A,2001.06.13, 权利要求 1-6. WO 2004/108902 A2,2004.12.16, 实施例 7. CN 1891720 A,2007.01.10, 权利要求 1-11. Yingliang Liu et al.Conjugated polymers containing phenothiazine moieties in the mai。

3、n chain.POLYMERS FOR ADVANCED TECHNOLOGIES .2006, 第 17 卷 ( 第 6 期 ),468-473. Jian Liao, Qing Wang. Ruthenium-Catalyzed Knoevenagel Condensation: A New Route toward Cyano-Substituted Poly(p-phenylenevinylene) s.Macromolecules .2004, 第 37 卷 ( 第 18 期 ),7061-7063. (54) 发明名称 发光聚合物的纳米颗粒以及其制备方法 (57) 摘要 本发明披。

4、露了发光聚合物的纳米颗粒及其制 备方法， 所述纳米颗粒包含氰基取代的聚 ( 芳撑 亚乙烯基 ) 聚合物的纳米颗粒 ； 生物相容性表面 活性剂， 其吸附于聚合物纳米颗粒的表面， 所述方 法包括 ： (1) 均匀混合由通式 OHC-Ar1-CHO 表示的 二醛单体、 由通式 NC-Ar2-CN 表示的二氰化物单 体、 和液体表面活性剂 ； (2) 将水加入至所得的混 合物中以制备水相中的胶束分散体 ； 以及 (3) 将 聚合催化剂加入水相中的胶束分散体中， 接着在 室温和大气压下使所得的混合物实施胶体聚合。 用生物相容性表面活性剂来稳定本发明的发光聚 合物的纳米颗粒， 以致它可以形成稳定的水相中 。

5、的分散体， 并具有适合于生物分子标记或细胞或 体内成像的颗粒大小和荧光效率 ； 因而， 它可以 用作细胞或体内发光造影剂。 (30)优先权数据 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 孙捷 权利要求书 2 页 说明书 8 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 2 页 说明书 8 页 附图 4 页 1/2 页 2 1. 一种发光聚合物的纳米颗粒， 包含由以下化学式 1 表示的氰基取代的聚 ( 芳撑亚乙 烯基 ) 聚合物的纳米颗粒 ； 以及吸附于所述聚合物的所述纳米颗粒的表面的生物相容性表 面活性剂 ： 化学式 1 ： 其中 n 是 10 。

6、至 10,000 的整数， Ar1和 Ar2是芳基基团， 独立地选自由苯基、 联苯基、 三 联苯基、 萘基、 蒽基、 芴基、 二苯基芴基、 咔唑基、 苯硫基、 呋喃基或嘌呤基、 吡咯基、 喹啉基、 喹喔啉基、 噁二唑基、 二苯基噁二唑基、 吲哚基以及吲唑基组成的组， 上述基团是未取代的 或由直链的或支链的 C1-10烷基、 烷氧基或硫代烷氧基基团取代。 2.根据权利要求1所述的纳米颗粒， 其中， 由化学式1表示的氰基取代的聚(芳撑亚乙 烯基)聚合物的纳米颗粒与所述生物相容性表面活性剂的比率按重量计为17至112。 3. 根据权利要求 1 所述的纳米颗粒， 其中， 所述表面活性剂是液体表面活性剂。

7、。 4. 根 据 权 利 要 求 1 所 述 的 纳 米 颗 粒，其 中，所 述 表 面 活 性 剂 选 自 由 以及组成的组。 5. 根据权利要求 1 所述的纳米颗粒， 具有 5nm 至 500nm 范围的粒径。 6. 根据权利要求 1 所述的纳米颗粒， 具有 300nm 至 800nm 范围的吸收波长。 7. 根据权利要求 1 所述的纳米颗粒， 具有 400nm 至 900nm 范围的发光波长。 8. 根据权利要求 1 所述的纳米颗粒， 其中， Ar1是选自由以下化学式 2 表示的基团中的 一种 ： 化学式 2 ： 9. 根据权利要求 1 所述的纳米颗粒， 其中， Ar2是苯基。 10. 。

8、根据权利要求 7 所述的纳米颗粒， 具有 450nm 至 900nm 的发光波长， 并用作用于细 胞成像的荧光造影剂。 11. 根据权利要求 7 所述的纳米颗粒， 具有 530nm 至 900nm 的发光波长， 并用作用于体 权 利 要 求 书 CN 101885913 B 2 2/2 页 3 内成像的荧光造影剂。 12. 根据权利要求 7 所述的纳米颗粒， 具有 10nm 至 50nm 的粒径和 600nm 至 900nm 的发 光波长， 并用作用于荧光检测哨兵淋巴结的造影剂。 13. 一种用于制备根据权利要求 1 所述的发光聚合物的纳米颗粒的方法， 包括 ： (1) 均匀混合由通式 OHC。

9、-Ar1-CHO 表示的单体、 由通式 NC-Ar2-CN 表示的单体、 和液体 表面活性剂 ； 其中， 所述 Ar1是芳基， 选自由苯基、 芴基和噻吩基组成的组， 并且是未取代的或由直链 的或支链的 C1-10烷基、 烷氧基或硫代烷氧基基团取代， 以及 其中， 所述 Ar2是芳基， 选自由苯基、 芴基和噻吩基组成的组， 并且是未取代的或由直链 的或支链的 C1-10烷基、 烷氧基或硫代烷氧基基团取代 ； (2) 将水加入至所得的混合物中以制备水相中的胶束分体散 ； 以及 (3) 将聚合催化剂加入至所述水相中的胶束分体散， 接着在室温和大气压下使所述获 得的混合物实施胶体聚合， 以获得所述发光。

10、聚合物的所述纳米颗粒， 其中所述纳米颗粒的 表面用所述表面活性剂加以稳定。 14. 根据权利要求 13 所述的方法， 进一步包括将在步骤 (3) 中获得的所述发光聚合物 的所述纳米颗粒进行渗析， 以除去过量的表面活性剂、 催化剂和未反应单体。 15. 根据权利要求 13 所述的方法， 其中， 在步骤 (1) 中由通式 OHC-Ar1-CHO 表示的单体 和由通式 NC-Ar2-CN 表示的单体按 1 1 的摩尔比率使用， 且所述液体表面活性剂的用量 为按所述单体的总重量计的 20 至 100 倍。 16. 根据权利要求 13 所述的方法， 其中， 在步骤 (1) 中， 由通式 OHC-Ar1-。

11、CHO 表示的单 体和由通式 NC-Ar2-CN 表示的单体均匀溶解在不含有机溶剂的液体表面活性剂中。 17.根据权利要求13或14所述的方法， 其中， 所述聚合催化剂选自由四丁基氢氧化铵、 四甲基氢氧化铵和四乙基氢氧化铵组成的组。 18.根据权利要求13所述的方法， 其中， 在步骤(3)中获得的所述发光聚合物的所述纳 米颗粒的粒径在 5nm 至 500nm 范围内。 19.根据权利要求13所述的方法， 其中， 在步骤(3)中获得的所述发光聚合物的所述纳 米颗粒的吸收波长在 300nm 至 800nm 范围内。 20.根据权利要求13所述的方法， 其中， 在步骤(3)中获得的所述发光聚合物的所。

12、述纳 米颗粒的发光波长在 400nm 至 900nm 范围内。 权 利 要 求 书 CN 101885913 B 3 1/8 页 4 发光聚合物的纳米颗粒以及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及发光聚合物的纳米颗粒及其制备方法。更具体地说， 本发明涉及发光 聚合物的纳米颗粒， 其具有适合用作生物分子标记、 或用于细胞或体内应用的粒径、 发光性 能以及水相中的分散体， 所以可以用作光学成像造影剂， 并涉及该纳米颗粒的制备方法。 背景技术 0002 在生命科学中， 基于荧光的技术已广泛用于定义各种基本的生命现象， 从分子生 物学到疾病诊断。尤其是， 基于荧光的技术使用各种实验参数， 其包括激。

13、发光波长、 荧光波 长、 荧光寿命或荧光各向异性、 以及荧光强度， 从而使得可以多路传输来自多个靶的信号， 并提供纳米级的分辨率以及单分子水平的灵敏度。 0003 荧光相关的光物理现象对周围环境的变化是敏感的， 并且存在各种分子可控现象 如荧光的消光或增加、 能量转移的产生等， 其来自同质或异质材料之间的相互作用。 这样的 性能已用来开发智能型造影剂， 用于研究生物分子之间的相互作用、 以及疾病的早期诊断。 0004 已用作免疫标记、 或用于细胞或活体的造影剂的荧光材料包括有机荧光分子 D1 ： Kim et al.， Prog.Polym.Sci.32 ： 1031-1053(2007)、 。

14、荧光蛋白 D2 ： Zhang et al.， Nat. Rev.Mol.Cell.Bio.3 ： 906-918(2002)、 以及无机量子点 D3 ： Seydack et al.， Biosens. Bioelectron.20 ： 2454-2469(2005)， D4 ： Gao et al.， Nat.Biotechnol.22 ： 969-976(2004)， 以及 D5 ： Michalet et al.， Science 307 ： 538-544(2005)。 0005 基于荧光的分子检测和成像的性能取决于荧光标记材料或造影剂的光学特性， 尤 其是荧光强度和光学稳定性。 限。

15、定信号检测的灵敏度限度的荧光强度是由荧光材料的荧光 效率和吸收系数的乘积来确定。 尤其是， 激发光的吸收系数应较高， 以将荧光材料施用于细 胞或活体， 其中由于光的散射或吸收和自身荧光干扰严重使得激发光的密度较低。 0006 有机荧光分子或包含有机荧光分子的纳米颗粒的激发光的吸收系数取决于分子 的化学结构。有机荧光分子如荧光素、 若丹明、 花青 ( 菁蓝 ) 等， 如在 D6 ： Resch-Genger et al.， Nat.Method 5 ： 763-775(2008) 中所描述的， 具有 2.5x104至 2.5x105M-1cm-1的摩 尔吸收系数 ()， 其对于临床应用是不够的。。

16、此外， 有机荧光分子如香豆素、 若丹明等在 激发光的连续照射下具有相当低的光学稳定性， 如在 Eggeling et al.， Anal.Chem.70 ： 2651-2659(1998)(D7) 中所描述的。 0007 与此同时， 如在 D4、 5、 以及 6 中描述的， 无机量子点如 CdS、 CdSe、 CdTe、 InP、 PbS 等 具有5x105至5x106M-1cm-1的摩尔吸收系数()， 其是有机荧光分子的摩尔吸收系数的值的 二十倍， 并且是光学上稳定的。然而， 如在 Derfus et al.， Nano Lett.4 ： 11-18(2004)(D8) 中所描述的， 应用于。

17、细胞或体内应用有其局限性， 这是起因于由重金属成分引起的潜在毒 性问题。 0008 此外， ACS Nano 2 ： 2415-2423(2008)(D9) 披露了 - 共轭聚合物， 其在纳米颗粒 状态(直径约15nm)具有1x109M-1cm-1或更高的吸收系数()， 并在连续激发光照射下和有 机荧光染料相比具有 103倍或更高的改善的光学稳定性。然而， - 共轭聚合物如聚 2- 甲 说 明 书 CN 101885913 B 4 2/8 页 5 氧基 -5-(2- 乙基己氧基 )-1， 4- 亚苯基亚乙烯基 (MEH-PPV)、 聚 2， 5- 二 (3， 7- 二甲基辛 基 ) 亚苯基 -。

18、1， 4- 亚乙炔基 (PPE)、 聚 9， 9- 二辛基 -2， 7- 二亚乙烯基 - 亚芴基 -2- 甲 氧基 -5-(2- 乙基己氧基 )-1， 4- 亚苯基 交替共聚物 (PFPV)、 聚 (9， 9- 二辛基芴基 -2， 7-二基)-(1， 4-苯并2， 1， 3-噻二唑)共聚物(PFBT)等， 在溶液中呈现更高荧光效率 ()， 而在固相 ( 如纳米颗粒、 薄膜等 ) 中荧光效率则通常显著降低。 0009 此外， GREENHAM et al.， Nature 365 ： 628-630(1993)(D10) 和 GREENHAM et al.， Chem.Phys.Lett.241。

19、 ： 89-96(1995)(D11) 披露了氰基取代的聚 ( 亚苯基亚乙烯基 ) 类。这 些材料是在它们的结构中具有氰基亚乙烯基基团的 - 共轭聚合物， 已报道其在固体薄膜 中呈现0.35或更高的荧光效率()。 然而， D10和D11仅将具有氰基亚乙烯基基团的-共 轭聚合物用来制备用于电子设备的薄膜， 而没有提示将该聚合物用作注入细胞或活体中的 生物分子标记、 或光学图像造影剂。 发明内容 0010 因此， 为了解决上述问题， 已设想了本文描述的各种特点。 0011 本发明的一个目的是提供发光聚合物的纳米颗粒， 其可以用作用于细胞或活体的 基于纯有机物质的发光造影剂， 其具有适合用作生物分子。

20、标记、 或应用于细胞或活体的粒 径、 发光性能以及水相中的分散体， 并与目前用于体内荧光检测和成像的现有技术的有机 荧光分子或无机量子点相比呈现显著改善的荧光强度， 同时并不包含任何对活体有毒的化 学元素， 如重金属或卤素等， 本发明还提供了其制备方法。 0012 可以通过提供发光聚合物的纳米颗粒及其制备方法来实现本发明的上述目的， 其 中上述纳米颗粒具有用生物相容性表面活性剂加以稳定的表面， 并具有适合于用作生物分 子标记或应用于细胞或活体的粒径、 发光性能以及水相中的分散体。 0013 因此， 本发明提供了发光聚合物的纳米颗粒， 其包含 ： 由以下化学式 1 表示的氰基 取代的聚 ( 芳撑。

21、亚乙烯基 ) 聚合物 ( 或聚 ( 亚芳基亚乙烯基 ) 聚合物 ) 的纳米颗粒 ； 以及 生物相容性表面活性剂， 其吸附于化学式 1 的聚合物的纳米颗粒的表面以稳定纳米颗粒的 表面。 0014 化学式 1 ： 0015 0016 其中 n 是 10 至 10,000 的整数 ； 且 Ar1和 Ar2是芳基基团， 独立地选自由苯基、 联苯 基、 三联苯基、 萘基、 蒽基、 芴基、 二苯基芴基、 咔唑基、 苯硫基、 呋喃基或嘌呤基、 吡咯基、 喹 啉基、 喹喔啉基、 噁二唑、 二苯基噁二唑、 吲哚基 ( 氮茚基 ) 以及吲唑基组成的组， 其是未取 代的或由直链的或支链的 C1-10烷基、 烷氧基或。

22、硫代烷氧基基团取代。 0017 本发明还提供了制备发光聚合物的纳米颗粒的方法， 包括 ： (1) 均匀混合由通式 OHC-Ar1-CHO(Ar1是芳基， 选自由苯基、 芴基和噻吩基组成的组， 其是未取代的或由直链的或 支链的 C1-10烷基、 烷氧基或硫代烷氧基基团取代 ) 表示的单体、 由通式 NC-Ar2-CN(Ar2是芳 基， 选自由苯基、 芴基和噻吩基组成的组， 其是未取代的或由直链的或支链的 C1-10烷基、 烷 说 明 书 CN 101885913 B 5 3/8 页 6 氧基或硫代烷氧基基团取代 ) 表示的单体、 以及液体表面活性剂 ； (2) 将水加入至所得的混 合物中以制备含。

23、水胶束分体散 ； 以及 (3) 将聚合催化剂加入至所得的含水胶束分体散， 接 着在室温和大气压下进行胶体聚合。 0018 根据以下本发明的详细描述并参照附图， 本发明的上述和其它目的、 特点、 方面以 及优点将变得更加显而易见。 附图说明 0019 图 1 是生物相容性共轭聚合物的纳米颗粒的制备方法的示意图， 其中通过根据本 发明的胶体聚合方法 ； 0020 图 2a 和 2b 示出根据本发明的发光聚合物 (1)CN-PFPV、 (2)CN-PBPV、 (3)CN-PPV 和 (4)CN-DOPPV 的纳米颗粒的吸收光谱 ( 图 2a) 和荧光光谱 ( 图 2b)， 以及图 2c 是在上述四 。

24、种类型的纳米颗粒的水相中的分散体的每一种被皮下注入小鼠以后在 365nm 紫外线灯下 在实验小鼠的体外用肉眼观察的荧光彩色照片 ； 0021 图 3 是在根据本发明的实施例 1 中制备的发光聚合物 (CN-DOPPV) 的纳米颗粒的 透射电子显微镜照片 ； 0022 图 4 示出在根据本发明的实施例 1 中制备的发光聚合物 (CN-DOPPV) 的纳米颗粒 的水相中的分散体的粒径分布， 借助于动态光散射法加以确定 ； 0023 图 5a 和 5b 是活癌细胞 (HeLa 细胞 )( 其中内在化了在根据本发明的实施例 1 中 制备的发光聚合物 CN-DOPPV( 图 5a) 和 CN-PPV( 。

25、图 5b) 的纳米颗粒 ) 的光学照片图像， 其 中 “DIC” 是明场图像作为差示干涉反差图像，“FL” 是荧光图像， 以及 “重叠” 是通过重叠 DIC 和 FL 所获得的图像。 0024 图 6 是当在根据本发明的实施例 1 中制备的发光聚合物 (CN-DOPPV) 的纳米颗粒 被注入时哨兵淋巴结作图 (mapping) 行为的体内近红外荧光照片图像 ； 以及 0025 图 7a 和 7b 是在根据本发明的实施例 1 中制备的发光聚合物 (CN-DOPPV) 的纳米 颗粒被注入以后， 在 365nm 紫外线灯下在体外 ( 图 7a) 和在手术期间 ( 图 7b) 用肉眼观察 到的哨兵淋巴。

26、结的荧光彩色照片。 具体实施方式 0026 为了将发光聚合物的纳米颗粒用作生物分子标记、 或用于细胞中或体内成像的发 光造影剂， 发射自纳米颗粒的光强度应满足临床应用的水平， 即现有技术的荧光造影剂水 平的102或103倍， 为此， 发光聚合物的纳米颗粒对于激发光的摩尔吸收系数()应至少为 1x108M-1cm-1， 荧光效率()应至少为0.2， 并且可以形成稳定的水相中的分散体。 本发明提 供了满足所有上述要求的发光聚合物的纳米颗粒。 0027 因此， 本发明涉及发光聚合物的纳米颗粒， 其包含 ： 由以下化学式 1 表示的氰基取 代的聚(芳撑亚乙烯基)类聚合物的纳米颗粒 ； 以及生物相容性表。

27、面活性剂， 其吸附于化学 式 1 的聚合物的纳米颗粒表面。 0028 化学式 1 ： 0029 说 明 书 CN 101885913 B 6 4/8 页 7 0030 其中 n 是 10 至 10,000 的整数 ； 且 Ar1和 Ar2是芳基基团， 该芳基基团独立地选 自由苯基、 联苯基、 三联苯基、 萘基、 蒽基、 芴基、 二苯基芴基、 咔唑基、 苯硫基、 呋喃基或嘌呤 基、 吡咯基、 喹啉基、 喹喔啉基、 噁二唑基、 二苯基噁二唑基、 吲哚基以及吲唑基组成的组， 这 些基团是未取代的或由直链的或支链的 C1-10烷基、 烷氧基或硫代烷氧基基团取代。 0031 在本发明中， 化学式 1 的。

28、氰基取代的聚 ( 芳撑亚乙烯基 ) 聚合物与生物相容性表 面活性剂之间的比率按重量计为 1 7 至 1 12。 0032 根据本发明的发光聚合物的纳米颗粒具有 5nm 至 500nm 的直径， 其适合于掺入细 胞和体内循环。 0033 根据本发明的发光聚合物的纳米颗粒具有 300nm 至 800nm 的吸收波长， 其适合于 传送到活体的组织。 0034 在激发光照射以后， 发射自发光聚合物的纳米颗粒的光的波长为 400nm 至 900nm， 其属于可见光和近红外区域。 0035 当根据本发明的纳米颗粒应用于体内荧光成像时， 发射光的波长优选为 600nm 至 900nm。如果发射光的波长短于 。

29、600nm， 它会与发射自荧光材料 ( 其固有地存在于活体内 ) 的荧光 ( 自身荧光 ) 的波长重叠， 其导致难以进行高灵敏度的检测。与此同时， 如果发射光 的波长长于 900nm， 则难以获得高发光效率， 尤其是， 它是不利的， 因为由体内存在的过量水 的吸收所引起的干扰会增加。 0036 生物相容性表面活性剂优选为液体表面活性剂。该表面活性剂在活体内环境中 为发光聚合物的纳米颗粒提供分散稳定性和生物相容性。合适的表面活性剂的实例包括 但不限于 Tween 类表面活性剂 ( 例如，20、60、80 等可获 自 CrodaInternational PLC)、 Triton 类 ( 例如，X。

30、-100 等， 可获自 DowChemical Company)、 Span 类 ( 例 如，20、60、80 等，可 获 自 Croda International PLC)。 0037 下文详细描述根据本发明的发光聚合物的纳米颗粒的制备方法。 0038 根据本发明的发光聚合物的纳米颗粒的制备方法采用了胶体聚合， 其中在通过生 物相容性表面活性剂形成的水相中的分散体均匀胶束中聚合单体， 同时形成聚合物的纳米 颗粒， 从而制备发光聚合物的所期望的纳米颗粒， 其具有 5nm 至 500nm 的直径， 并借助于生 物相容性表面活性剂以生态和生物友好方式(没有使用对人体有害的有机溶剂)使表面稳 定化。

31、。 0039 图 1 说明根据本发明的发光聚合物的纳米颗粒的制备过程。 0040 在步骤 (1) 中， 均匀混合由通式 OHC-Ar1-CHO 表示的二醛单体、 由通式 NC-Ar2-CN 表示的二氰化物单体和液体表面活性剂。所用的二醛单体和二氰化物单体的摩尔比率为 1 1， 并且按单体总重量计液体表面活性剂的用量为 20 至 100 倍。 0041 在步骤 (1) 中， 因为液体表面活性剂可以均匀地溶解用作单体的疏水性聚合单 体， 即， 二醛单体和二氰化物单体， 所以在本发明制备发光聚合物的纳米颗粒过程中没有必 要使用任何溶剂。 说 明 书 CN 101885913 B 7 5/8 页 8 。

32、0042 在步骤(2)中， 将水， 优选去离子水， 加入至在步骤(1)所得的混合物， 以形成含水 胶束分散体。优选使用去离子水， 因为可以在形成纳米颗粒时将离子和杂质的影响降低到 最小程度。 0043 在步骤 (3) 中， 添加聚合催化剂， 并在室温和大气压下进行胶体聚合， 以形成发光 聚合物的纳米颗粒， 其具有吸附有生物相容性表面活性剂的表面。聚合催化剂可以包括四 烷基氢氧化铵， 例如， 四丁基氢氧化铵 (TBAH)、 四甲基氢氧化铵、 四乙基氢氧化铵等。 0044 本发明的发光聚合物的纳米颗粒的制备方法可以进一步包括将在步骤 (3) 所得 的发光聚合物的纳米颗粒进行渗析， 用于除去过量的表。

33、面活性剂、 催化剂和未反应单体， 以 收集发光聚合物的纳米颗粒， 该纳米颗粒具有用吸附于其上的生物相容性表面活性剂加以 稳定的表面。 0045 在本发明中， 化学式 1 的发光聚合物的 Ar1和 Ar2是变化的， 借此可以调节发射自 发光聚合物的光的光吸收和波长范围， 以对应于可见光和近红外区域。 0046 图 2a 和 2b 表明， 本发明改变了单体的芳族结构， 从而制备发光聚合物的纳米颗 粒， 其具有 350nm 至 600nm 的吸收波长 ( 参见图 2a) 和 450nm 至 800nm 的荧光波长 ( 参见 图 2b)， 同时具有 5nm 至 300nm 的窄粒径分布 ( 通过动态光。

34、散射法测得 )。在图 2a 和 2b 中， 曲线 (1) 至 (4) 指示出了本发明的发光聚合物纳米颗粒， 其中 Ar2都是苯基， 而 Ar1选自由 以下化学式 2 表示的基团中的一种 ： 0047 化学式 2 ： 0048 0049 0050 图 3 是根据本发明的发光聚合物的纳米颗粒的透射电镜照片。 0051 如图 2 和 3 所示， 在本发明中， 可以制备这样的发光聚合物的纳米颗粒， 其具有各 种荧光波长同时具有恒定的粒径大小， 这是本发明区别于现有技术的无机量子点的特点， 其中无机量子点的吸收和荧光波长取决于它们的粒径大小。 0052 图 5 至 7 表明根据本发明的发光聚合物的纳米颗。

35、粒可用作图像造影剂， 这通过对 细胞和小动物进行的光学成像实验得到证实。如图 5 至 7 所示， 根据本发明的发光聚合物 的纳米颗粒具有与现有技术的荧光造影剂相比显著更高的荧光强度， 和适用于细胞成像和 哨兵淋巴结作图 (mapping) 的粒径。尤其是， 与用于检测哨兵淋巴结的现有技术的同位素 示踪物和蓝色染料相比， 根据本发明的发光聚合物的纳米颗粒可以快速到达淋巴结并停留 说 明 书 CN 101885913 B 8 6/8 页 9 在那里足够长的时间。因此， 如果根据本发明的发光聚合物的纳米颗粒和简单的荧光检测 器 ( 如在 JP 2001-299676A、 JP 2004-269439。

36、A 和 US 7,181,266B2 中所提出的 ) 一起使用， 则即使是非技术人员也可以快速、 准确并容易地检测哨兵淋巴结， 所以根据本发明的发光 聚合物的纳米颗粒可以实际用于癌症手术、 哨兵淋巴结活检(SLNB)。 此外， 不同于常规的淋 巴系闪烁造影术， 根据本发明的发光聚合物的纳米颗粒并不包括辐射， 处理简单， 且并不需 要对于哨兵淋巴结活检的大型设施， 其使得即使在小医院也可以借助于哨兵淋巴结活检将 发光聚合物的纳米颗粒用于肿瘤切除手术。 0053 实施例 0054 现将详细描述本发明的实施例， 其仅是说明性的， 而不是对本发明进行限制。 0055 实施例 1 ： 发光聚合物纳米颗粒。

37、的制备 0056 (1) 氰基取代的聚 2- 二辛氧基 -1， 4- 二亚乙烯基 - 亚苯基 -1， 4- 亚苯基 交替共聚物 (CN-DOPPV) 纳米颗粒的制备 0057 按照图 1 所示的方法制备化学式 1 的聚合物 (CN-DOPPV) 的纳米颗粒， 其中 Ar1是 被两个辛氧基基团取代的苯基， 而 Ar2是苯基， 其表面借助于表面活性剂加以稳定。它的详 细制备过程如下 ： 0058 将 25.8mg 的 2， 5- 二 ( 辛氧基 ) 对苯二甲醛 (Adrich) 和 10.3mg 对苯二甲基二腈 (TCI) 加入 1g 的80( 购买自 Sigma Co.)， 用热空气加热所得的混。

38、合物以均匀溶 解， 然后使其冷却至室温。将 5mL 去离子水 (Milli-Q， 18.2Mcm) 加入至 0.3g 所得的溶液 中以形成透明的胶束分散体的水溶液。将 0.2mL 的 1.0M 的四丁基氢氧化铵 (TBAH) 的甲醇 (Aldrich) 溶液加入至胶束分散体的水溶液， 然后在室温和大气压下进行胶体聚合。在 12 小时以后， 通过用去离子水的渗析 ( 纤维素酯， MW截取 300kDa) 纯化反应溶液两天， 以获得 6.7g 的 CN-DOPPV纳米颗粒的水分散体(在水相中的分散体)， 其表面用80加以 稳定。 0059 为了确定CN-DOPPV纳米颗粒的水分散体的组成， 分别测。

39、量在冷冻干燥3mL反应溶 液以后获得的 CN-DOPPV 纳米颗粒水分散体的总重量和在通过用乙醇洗涤而除去表面活性 剂以后纯 CN-DOPPV 纳米颗粒的重量。结果， 发现， 无表面活性剂的情况下， 可以 用过量80(40.4mg) 稳定 4.1mg( 聚合产率 89 ) 纯 CN-DOPPV 纳米颗粒。 0060 (2)氰基取代的聚9， 9-二辛基-2， 7-二苯基-二芴-4， 4-二基-1， 4-二 亚乙烯基 - 亚苯基 交替共聚物 (CN-PFPV)、 氰基取代的聚 4， 4 - 二亚乙烯基 - 二亚 苯基-1， 4-亚苯基交替共聚物(CN-PBPV)以及氰基取代的聚(1， 4-亚苯基亚。

40、乙烯基) (CN-PPV) 的纳米颗粒的制备 0061 以 与 实 施 例 1 的 (1) 中 描 述 的 相 同 方 式， 分 别 使 用 4， 4 -(9， 9- 二 辛 基 -9H- 芴 -2， 7- 二基 ) 二苯甲醛和对苯二甲基二腈、 4， 4 - 联苯基二甲醛和对苯二甲基 二腈、 以及对苯二甲醛和对苯二甲基二腈作为单体， 制备了 CN-PFPV、 CN-PBPV 以及 CN-PPV 纳米颗粒。 0062 实施例 2 ： 发光聚合物纳米颗粒的特性的评价 0063 (1) 发光聚合物纳米颗粒的颗粒特征的评价 0064 用透射电子显微镜 (CM30， FEI/Philips， 200kV。

41、) 观测在实施例 1 的 (1) 中制备的 CN-DOPPV 纳米颗粒 ( 其表面用表面活性剂加以稳定 ) 的形状和大小， 结果示在图 3 中。此 说 明 书 CN 101885913 B 9 7/8 页 10 外， 通过动态光散射法 (BI-9000AT 数字自相关仪， Brookhaven) 确定了在水相中的分散体 的颗粒大小分布， 结果示在图 4 中。CN-DOPPV 纳米颗粒由球形颗粒构成， 其平均粒径为约 34nm， 如图 3 所示， 而它们在水相中的分散体的平均粒径为 595nm， 如图 4 所示。 0065 (2) 发光聚合物纳米颗粒的光学特性的评价 0066 用去离子水将实施例。

42、 1 的 (1) 中制备的 CN-DOPPV 纳米颗粒的水相中的分散体 稀释 20 倍， 然后借助于 UV-vis. 光谱仪 (Agilent 8453) 和荧光分光光度计 (Hitachi F-7000) 确定吸收和荧光光谱， 其结果示在图 2a 和 2b 中。在图 2a 和 2b 中标明为 (4) 的曲 线是 CN-DOPPV 纳米颗粒的水相中的分散体的光学特性的结果。基于若丹明 B 的乙醇溶液 计算的 CN-DOPPV 纳米颗粒的相对荧光效率为 0.25。因此， 发现， 在本发明的实施例 1 中制 备的发光聚合物的纳米颗粒具有荧光效率， 其适合用作生物分子标记、 或用于细胞内成像 和体内。

43、成像的发光造影剂。 0067 以与针对 CN-DOPPV 纳米颗粒相同的方式评价 CN-PFPV、 CN-PBPV 以及 CN-PPV 纳米 颗粒的光学特性， 结果也提供在图 2a 和 2b 中。在图 2a 和 2b 中， 曲线 (1)、 (2) 以及 (3) 分 别对应于 CN-PFPV、 CN-PBPV 以及 CN-PPV。 0068 实施例 3 ： 发光聚合物纳米颗粒的体内荧光的观测 0069 将在实施例 1 中制备的 CN-DOPPV、 CN-PFPV、 CN-PBPV 以及 CN-PPV 纳米颗粒的水相 中的分散体各 50L 皮下注入实验小鼠， 对其照射 365nm 的手持紫外线灯 。

44、( 其具有 1-2mW/ cm2的辐射率 )。用肉眼观察到的荧光照片图像提供在图 2c 中。图 2c 表明， 从本发明的发 光聚合物的注射纳米颗粒斑点观察到强烈的荧光色。 0070 实施例 4 ： 借助于发光聚合物纳米颗粒的细胞成像和哨兵淋巴结的荧光检测 0071 (1) 细胞成像 0072 将在实施例 1 和 2 中制备的 CN-DOPPV 和 CN-PPV 纳米颗粒的水相中的分散体 各 100L 放入活癌细胞 (HeLa 细胞 ) 培养基， 然后其被掺入细胞三小时。用荧光显微镜 (AppliedPrecision， 装备有 60 x 油透镜 (oli 1ens)， Olympus) 观察掺。

45、入纳米颗粒的细胞 的光学图像。结果提供在图 5a 和 5b 中， 其表明， 在癌细胞的细胞质中观察到 CN-DOPPV( 图 5a) 和 CN-PPV( 图 5b) 纳米颗粒的强烈荧光。 0073 (2) 哨兵淋巴结的体内近红外荧光成像 0074 图 2a 和 2b 表明， 在实施例 1 中制备的 CN-DOPPV 纳米颗粒在 700nm 或更高的近红 外区呈现强烈荧光， 其适用于体内荧光成像。因此， 在 10L 的 CN-DOPPV 水相中的分散体 被皮下注入腹膜麻醉(peritoneal-anesthetized)雄性小鼠(BALB/c， 5周龄， Instituteof Medical 。

46、Science， Tokyo) 的前爪垫以后， 立即在 535nm 光照射下获得如图 6 所示的近红外 荧光图像， 其中利用装备有近红外区滤光片 (e700WA) 的成像装置 (Kodak Image Station 400MM)。注射以后， 立即通过体外荧光图像追踪 CN-DOPPV 纳米颗粒沿淋巴管的移动。如图 6 所示， CN-DOPPV 纳米颗粒在 1 分钟内快速达到腋哨兵淋巴结 (axillery sentinel lymph node)， 并在5分钟内高质量地获得非常强烈和鲜明的哨兵淋巴结图像。 CN-DOPPV纳米颗粒 停留在哨兵淋巴结 70 分钟以上， 没有观测到流向下游淋巴结。

47、。 0075 (3) 在体外和在分离表皮以后哨兵淋巴结的荧光彩色成像 0076 在完成实施例4的(2)的实验以后， 在365nm便携式紫外线灯(具有1-2mW/cm2的 照射 ) 下用普通数码相机获得荧光彩色照片图像， 如图 7a 和 7b 所示。图 7a 是体外获得的 说 明 书 CN 101885913 B 10 8/8 页 11 照片， 而图 7b 则是分离表皮以后获得的照片。图 7a 和 7b 表明， CN-DOPPV 纳米颗粒具有高 荧光强度， 以致在一般手持紫外线灯下用肉眼就可以观察纳米颗粒积聚的哨兵淋巴结， 而 无需专用成像设备， 如用于在实施例 4 的 (2) 的实验中。在分离。

48、表皮以后， 观察到更强烈的 荧光， 从而说明， 在操作期间可以快速和准确地确定哨兵淋巴结。 0077 如上所述， 本发明提供了本发明的发光聚合物的纳米颗粒， 其具有适合用作生物 分子标记或应用于细胞或活体的粒径、 发光性能和水中的分散相， 是纯的有机物质， 既不包 含卤素原子也不包含重金属， 并且呈现显著改善的荧光强度 ( 和现有技术的荧光造影剂相 比 )， 从而借助于少量注射就可以提供荧光图像。 0078 此外， 在本发明中， 可以以生态和生物友好的方式来制备发光聚合物的纳米颗粒 而不使用有机溶剂 ； 因此， 本发明的方法不存在现有技术的无机量子点的潜在毒性问题， 因 而它提供了发光聚合物的。

49、纳米颗粒用于实际临床应用的可能性。 在通过胶体聚合方法的发 光聚合物的纳米颗粒的制备方法中， 最终产物是由单体通过一步聚合反应直接获得。 因此， 和现有技术方法相比， 本发明的方法是简单和容易的， 即， 如在 D9 中描述的沉淀法， 该方法 包括溶解通过溶液聚合在有机溶剂中获得的发光聚合物， 接着在具有稀释浓度的水中沉淀 聚合物， 以获得聚合物的纳米颗粒。 另外， 本发明提供了以更高浓度大规模制备纳米颗粒的 稳定水相中的分散体的可能性。在该沉淀法中， 不能制备具有低溶解度的发光聚合物的纳 米颗粒， 因为在沉淀过程以前， 聚合物应被均匀溶解在有机溶剂中， 而在根据本发明的胶体 聚合方法中， 对于要获得的聚合物的溶解度没有限制， 因为纳米颗粒以最终产物的形式而 制备， 因而不需要在有机溶剂中的任何再溶解过程。 因此， 根据本发明的胶体聚合方法是有 利的， 因为只要保证单体在液体表面活性剂中的可溶性， 可以制备甚至具有低溶解度的发 光聚合物的纳米颗粒。 说 明 书 CN 101885913 B 11 1/4 页 12 图 1 图 2A 说 明 书 附 图 CN 101885913 B 12 2/4 页 13 图 2B 图 2C 图 3 说 明 书 附 图 CN 101885913 B 13 3/4 页 14 图 4 图 5A 图 5。