技术领域
本发明涉及一种蛋白质的分离纯化方法，尤其涉及一种重金属胁迫下 水稻总蛋白的分离方法。
背景技术
重金属污染问题日益严重，目前我国污水灌溉及废弃物等对农田已造 成大面积的土壤污染。汞是植物的非必需元素，是一种对生态环境和人类 健康等有着巨大危害的环境污染物质，经过生物富集和食物链放大后将产 生更加严重的后果(Rodriguez et al.，2003；Zhang and Wong，2007)。水稻作 为主要农作物，在世界上一百二十个国家和地区广泛栽培种植，全球一半 以上的人口以稻米为主食，但全球水稻平均亩产仅为二百公斤左右(中国 新闻网，2009)。重金属污染的研究受到了人们的高度重视，粮食安全也 成为当下全球共同关注的问题。
在长期的进化过程中，植物亦会相应产生多种抵抗重金属毒害的防御 机制，在感受各种环境因子的信号后，基因表达便会发生变化，从而引起 大量的蛋白质在种类和表达量上的变化(Baker，1987；Clemens，2001；Hall， 2002)。生物与非生物胁迫下响应的基因与蛋白质的鉴定是了解植物对特 定逆境下的适应机制及分子响应机制的最基本和最有利的工具，特别是突 变体的蛋白质组是目前的热点(Ahsan et al.，2007)。近年来，水稻蛋白质 组学的研究逐渐掀起热潮，已经与拟南芥的研究水平相持平(Agrawal et al.， 2009)，有关环境胁迫下的水稻蛋白质组研究也在不断地开展，现有的报 道主要集中在氧化胁迫，盐胁迫，磷、镉、铝胁迫等方面(Yan et al.，2005； Chitteti and Peng，2007；Takuya et al.，2007；Sang et al.，2008；Manju et al.， 2009)。Yan等(2005)利用蛋白质组研究发现了水稻根6个新的盐胁迫 响应蛋白：UDP葡萄焦磷酸化酶、根的谷氨酰胺合成酶、推测的新生肽结 合蛋白复合物的α亚基、细胞色素C氧化酶6b-1亚基、推测的剪接因子 类似蛋白和推测的肌动蛋白结合蛋白。Ashan等(2007)利用水稻根蛋白 质组研究发现抗氧化相关蛋白和胁迫响应相关蛋白的诱导是铜胁迫下水 稻自身建立的一个新的自我平衡。同时也通过砷胁迫下水稻根的比较蛋白 质组学，开展了砷对水稻的伤害及水稻在代谢和防御机制上变化的研究， 提出谷胱甘肽对于砷的解毒起到了关键作用(Ashan et al.，2008)。
水稻是蛋白质组学研究的模式植物，有很多学者对水稻蛋白的提取及 电泳条件进行了多项优化，但主要集中在水稻叶片上，而关于汞胁迫下水 稻根蛋白的提取则没有相关报道。众所周知，Hg2+处理水稻后其体内氧化 水平和代谢水平将会发生明显变化，而且不同生长时期或不同器官的材料 也存在差异，根中也本身就含有很多的次生代谢物质(如酚类物质)，对 蛋白的提取、溶解和电泳分离会产生很大的影响(Canova et al.，2004)。
发明内容
本发明提供了一种重金属胁迫下水稻总蛋白的双向凝胶电泳分离方 法，该方法通过对提取方法的优化，消除了杂质成分对凝胶电泳的影响， 同时对双向凝胶电泳的参数进行优化，以得到清晰的图谱。
一种重金属胁迫下水稻总蛋白的分离方法，包括：
(a)提取水稻根蛋白粗品，用乙醚和乙醇的混合溶液洗涤，冷冻干 燥后溶于裂解液，水浴加热0.5～2小时，离心，取上清液用丙酮沉淀，离 心分离沉淀，冷冻干燥；
(b)将沉淀溶于增溶液中，用6～8倍体积的冷丙酮于-20～-15℃沉 淀，离心分离沉淀，重复该步骤2～4次后，将沉淀冷冻干燥；
(c)将步骤(b)获得的沉淀溶于增溶液中，利用双向凝胶电泳分离。
所述的乙醚和乙醇的体积比为0.5～2。
所述的步骤(a)洗涤次数为2～4次。
所述的水浴加热温度为36～36.5℃。
所述的裂解液配方为：
5～7M尿素，1～3M硫脲，3～4％CHAPS，1％Pharmalyte pH3-10， 3～5％PVP，35mM Tris，1～2％2-ME。
尿素和硫脲可以增加蛋白的溶解度，但是温度不能过高，否则尿素的 降解会引起蛋白的氨基甲酰化而改变蛋白质的等电点，而且在36.5℃的水 浴中不时震荡，可以使蛋白充分溶解。
所述的增溶液配方为：
3～4％CHAPS，1％Pharmalyte pH3-10，0.5～1.5％DTT。
DTT是运用较多的还原剂，可以将蛋白质的二硫键还原成巯基有助于 蛋白的折叠。通过含有DTT的冷丙酮，可以有效地去除各种杂质，在最 后沉淀蛋白的过程上中加入6～8倍体积的冷丙酮还可以降低样品中盐离 子浓度的影响，有利于第一向IEF，起到浓缩样品的作用。
所述的双向凝胶电泳所用胶条长度为18cm，pH为4～7。
本发明方法通过增加尿素和硫脲等不同强度的表面去垢剂和多种离 液剂，再通过添加PVP和乙醇乙醚的洗涤来去除其它杂质，最后还通过 分步溶解来获得更纯的蛋白，同时降低蛋白样品的复杂性，得到了高纯度 的水稻根总蛋白。
本发明对双向凝胶电泳的胶条进行了优化，如采用150μg蛋白上样 量，通过延长等电聚焦时间，施加低电压，并设置多次增压的条件，使蛋 白(特别是大分子量蛋白)充分进入胶内并能够很好地进行等电聚焦，同 时在胶染色过程中采用同一批同一厂家的药品，设定准确的染色时间，配 置新鲜的显色液并事先于4℃下预冷来解决，从而降低染色的背景，延缓 显色时间以防止过染，从而保证图谱质量。
附图说明
图1为本发明水稻总蛋白双向凝胶电泳图。
具体实施方式
实施例1试剂配方
30％聚丙烯酰胺贮液
丙烯酰胺 150g
甲叉双丙烯酰胺 4g
双蒸水 定容至500ml
0.45μm的滤膜过滤后，棕色瓶4℃冰箱保存。
1.5M Tris碱pH8.8
Tris碱 90.75g
双蒸水 400ml
用1M HCl调pH至8.8，加双蒸水定容至500ml。4℃冰箱保存。 10％SDS
SDS 10g
双蒸水 定容至100ml
混匀后，室温保存。
10％AP(过硫酸铵)
AP 0.1g
双蒸水 1ml
溶解后，4℃冰箱保存，最好现用现配。
10×电泳缓冲液
(1×buffer＝25mM Tris，192mM glycine，0.1％SDS，pH8.3)
Tris碱 30g
甘氨酸 144g
SDS 10g
双蒸水 定容至1L。
水化上样缓冲液
8M尿素 4.805g
4％CHAPS 0.4g
65mM DTT 0.098g
0.2％(v/v)Bio-Lyte(4/7) 50μl
0.002％溴酚蓝 10μl(1％溴酚蓝)
双蒸水 定容至10ml
分装成10小管，每小管500μl，-20℃冰箱保存。
胶条平衡缓冲液母液
6M尿素 36g
2％SDS 2g
0.375M pH8.8 Tris-HCl 25ml(1.5M pH8.8 Tris-HCl)
20％甘油 20ml
双蒸水 定容至100ml
分装成10管，每管10ml，-20℃冰箱保存。
胶条平衡缓冲液I(现配)
胶条平衡缓冲液母液 10ml
DTT 0.2g
胶条平衡缓冲液II(现配)
胶条平衡缓冲液母液 10ml
碘乙酰胺 0.25g
低熔点琼脂糖封胶液
0.5％低熔点琼脂糖 0.5g
25mMTris 0.303g
192mM甘氨酸 1.44g
0.1％SDS 1ml(10％SDS)
0.001％溴酚蓝 100μl(1％溴酚蓝)
双蒸水 定容至100ml
加热溶解至澄清，4℃保存。
12％的丙烯酰胺凝胶(300ml)
双蒸水 100ml
30％聚丙烯酰胺贮液 120ml
1.5M Tris碱(pH8.8) 75ml
10％SDS 3ml
10％AP 1.5ml
TEMED 100μl。
实施例2试验材料与水稻培养
以水稻中花11(Oryza sativaL.subsp.Japonica)为材料，挑选饱满健 康的水稻种子，用1％的稀硝酸处理12h破休眠后，用蒸馏水洗净。再用 0.5％的NaClO溶液消毒15min，用蒸馏水洗净后置于铺有湿滤纸的培养皿 中露白(均在30℃条件下)。3天后转播于网格中水培一周(pH 5.0-5.6)， 再用1/2水稻营养液培养一周后用全营养液培养，待长至6叶期用HgCl2处理。
实施例3水稻根总蛋白的提取
采用改良的三氯乙酸(TCA)-丙酮沉淀法，具体步骤如下：
(1)取2.0-3.0g水稻材料于液氮中研磨充分(研钵可事先放于-20℃ 冰箱预冷，然后再用液氮预冷)，直至成白色粉末状。
(2)先加入25ml-20℃预冷的TCA提取液(10％TCA，0.07％DTT)， 充分混合后(可用枪头捣匀粉末并冲下壁上的样品)，放于-20℃冰箱中沉 淀2h。
(3)在4℃下以20000×g离心15min，弃上清，取沉淀。
(4)再加入20ml-20℃预冷的样品洗涤液(含0.07％DTT的丙酮)， 充分混合后(可用榫头将粉末捣碎)，放在-20℃冰箱中2h。
(5)在4℃下20000×g离心15min，弃上清，取沉淀。
(6)重复步骤(4)和(5)两遍。
(7)去掉上清后，用parafilm封口以防样品喷出，并用针在膜上扎 几个小洞，冷冻干燥。
(8)将提取的水稻根蛋白粗品放于-80℃，或直接进行下一步的提取 实验。
(9)取前期提取出来的水稻根蛋白粗品，用25ml体积比为1∶1的乙 醚：乙醇洗涤两次，每次15min，再在冷冻干燥机中冷冻干燥。加入适量 的样品裂解液以刚好成匀浆即可(7M尿素，2M硫脲，4％CHAPS，1％ Pharmalyte pH3-10，5％PVP，35mM Tris，2％2-ME)。
(10)将加有裂解液的蛋白样品于36.5℃(不能高于37℃)水浴1h， 期间不时振荡。
(11)室温下12000×g离心15min，取上清。
(12)将上清于室温下12000×g离心15min，取上清。
(13)再加1ml冷丙酮，于-20℃沉淀2h，在4℃下12000×g离心15 min，弃上清，取沉淀。
(14)将所得沉淀进行冷冻干燥处理。
(15)冷冻干燥充分后，加足量体积的增溶液(4％CHAPS，1％ Pharmalyte pH3-10，1％DTT)溶解沉淀。
(16)并在溶解液中加6倍体积的冷丙酮于-20℃沉淀2h，4℃下 12000×g离心15min，取沉淀。必要时(如果盐离子浓度比较高)重复此 步。
(17)将所得沉淀进行冷冻干燥处理。
(18)所得沉淀用适量(加入量以恰好溶解为准，不宜过大)增溶液 进一步溶解。
(19)室温下12000×g离心15min，取上清。
(20)用Bradford法对所得的蛋白样品进行精确定量。
(21)蛋白样品放于-70℃，或直接用于电泳。
实施例4双向凝胶电泳
4.1第一向IEF
(1)从冰箱中取出-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液(8M尿素， 4％CHAPS，65mMDTT，0.2％V/V IPG buffer 4-7，0.002％溴酚蓝)置室温 溶解。
(2)取一定量的蛋白样品与水化上样缓冲液均匀混合，在离心机上 离至无气泡。
(3)蛋白上样量(7cm胶条最终确定的蛋白上样量为70μg，18cm 胶条的蛋白上样量为150μg)
(4)从冰箱取出-20℃冷冻保存的IPG预制胶条(18cm，pH 4-7)， 于室温放置10min。
(5)沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。距槽 两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯(不要产生气泡， 否则影响到胶条中蛋白质的分布。)
(6)当所有的蛋白质样品都加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻 轻去除预制IPG胶条上的保护层，从酸性端一侧开始剥。
(7)分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或 水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极(标有+)对应于聚焦盘的正极(槽 的尖端)。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑 料支撑膜上，不能让胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊 子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。
(8)沿着胶条，缓慢的让矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上， 使每根胶条上覆盖2-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。
(9)对好正、负极，盖上盖子。设置好程序进行等电聚焦，参考下 表：
18cm胶条的等电聚焦程序
(10)聚焦结束的胶条立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否 则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。
4.2第二向SDS-PAGE电泳(以18cm pH4-7IPG胶条为例)
(1)配制12％的聚丙烯酰胺凝胶，将溶液分别注入玻璃板夹层中， 上部留1cm的空间，用双蒸水封面，保持胶面平整。聚合5h以上，一般 凝胶与上方液体分层后，表明凝胶已基本聚合。
(2)待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的双蒸水并冲洗。
(3)将等电聚焦好的胶条从等电聚焦仪中取出(或从-20℃冰箱中取 出胶条，于室温放置10min，使其化冻)。
(4)配制胶条平衡缓冲液I。
(5)在桌上放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤 纸上。将另一份厚滤纸用双蒸水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条 上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的 纵条纹。
(6)将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，加入5ml胶条平衡 缓冲液I，将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃12min。
(7)配制胶条平衡缓冲液II。
(8)第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡 缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋 白或损坏凝胶表面)。再加入胶条平衡缓冲液II，继续在水平摇床上缓慢摇 晃12min。
(9)用滤纸吸去SDS-PAGE凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理 好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部 对着自己。
(10)将低熔点琼脂糖封胶液进行加热溶解。
(11)加10×电泳缓冲液，并赶去缓冲液表面的气泡。
(12)第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡 缓冲液II，并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋 白或损坏凝胶表面)。
(13)将IPG胶条从样品水化盘中移出，用钝平头镊子夹住胶条的一 端使胶面完全浸没在10×电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在凝胶的 长玻璃板上。其余胶条同样操作。
(14)将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面 对着自己。在凝胶的上方加入足够量的低熔点琼脂糖封胶液。
(15)用平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶 胶面完全接触，而不要产生任何气泡。
(16)放置10min，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。
(17)将凝胶转移至电泳槽中。
(18)往电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用低电压(60V)， 待样品完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电压(150V，1h； 280V，5h)，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。
(19)用撬板工具轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号。
4.3染色
采用与质谱兼容的银染(Yan et al，2000)，具体步骤如下：
(1)固定：在固定液中(25ml醋酸，100ml甲醇，加水至250ml) 固定2次，每次至少15min，也可固定过夜。
(2)敏化：在敏化液(0.79g Na2S2O3·5H2O，17g NaAC，75ml甲醇， 加水至250ml)中敏化30min。
(3)漂洗：250ml双蒸水漂洗3遍，每次5min。
(4)银染：在AgNO3溶液(0.625g AgNO3溶于250ml水中)中浸 泡20min。
(5)漂洗：250ml双蒸水洗2遍，每次1min。
(6)显色：用4℃预冷的显色液(6.25g Na2CO3，100μl 37％甲醛， 加水至250ml)显色，共2次，第1次待溶液变黄色后倒掉。
(7)终止：终止液(3.65g EDTA溶于250ml水中)浸泡10min。
(8)漂洗：双蒸水250ml洗2遍，每次10min。
4.4凝胶扫描和图像分析
银染后的胶用UMAX Power Look 2100XL(Maxium Tech.，Taipei， China)扫描仪扫描，采用透射模式，分辨率为600dpi，图像保存为TIFF 格式。
水稻根总蛋白通过改良的TCA-丙酮沉淀法提取后，先通过pH3-10的 IPG胶条分离，发现蛋白点主要集中在pH4-7，为了使大部分蛋白更好地 得到分离，本发明采用了pH为4-7的胶条。
通过50μg，100μg，150μg，200μg，250μg，300μg的上样梯度预备实 验，发现上样量太小，则水稻根总蛋白不能够很好并完整地呈现；上样量 太大，则会由于离子干扰等因素的影响，聚焦时不能达到额定最大电压， 从而不能够充分完成聚焦。通过比较分析，选用上样量为150μg的设计， 通过2-DE分离后，不同等电点和不同分子量的蛋白可以得到很好的呈现 与分离，并且聚焦也很充分。
通过银染，不同的蛋白点在二维上清晰地分布在2-DE凝胶上，表达 图谱如图1所示。通过仪器扫描和软件分析后，可以检测到700个以上蛋 白点。