技术领域
本发明涉及抗肿瘤药物表阿霉素的前体表柔红霉素的制备方法，具 体而言，涉及采用微生物发酵法制备高纯度表柔红霉素的方法。
背景技术
柔红霉素以及以其为原料合成的阿霉素(doxorubin)、表阿霉素 (epirubicin)是目前临床上十分重要的抗肿瘤蒽环类抗生素。表阿霉素 的心脏毒性和骨髓毒性比阿霉素更低，而抗肿瘤的效果相当或更高。表 柔红霉素(4’-epi-daunorubicin)是工业生产表阿霉素的重要前体，其与 柔红霉素的差别仅在于分子中脱氧糖C4位羟基构型不同。由化学合成法 从柔红霉素到表柔红霉素需要经过多步条件要求苛刻的反应过程，并会 造成环境污染。如果采用微生物发酵方法直接生产表柔红霉素将会大大 节约成本，提高效率。目前现有技术可以采用微生物发酵方法直接生产 表柔红霉素，但发酵产物的产量较低。
文献Production of the antitumor drug epirubicin and its precursor by a genetically engineered strain of Streptomyces peucetius公开了一种分离表 柔红霉素的方法，具体如下：1)将表柔红霉素的发酵液高速离心后取菌 丝体，将其用甲醇浸泡4h以上后抽提；2)将甲醇抽提液减压浓缩，将 pH调至4.5后加入乙酸乙酯萃取除杂；3)萃取后将水相调至8.2，再用 二氯甲烷甲醇混合液(80∶20)将表柔从水相中萃取出来；4)用0.02N 盐酸水溶液将表柔从混合液中萃取到水相，并用碱化剂碳酸钠将pH调至 5.0使表柔析出，收集析出液，并用丙酮水(20∶80)溶解；5)表柔的 丙酮水溶液上反向硅胶柱(Lichroprep RP-8)，上柱后用pH＝3的丙酮水 (25∶75)将其洗脱下来，得到纯度为97％的表柔红霉素。
该方法步骤烦琐，且必须使用硅胶为介质的反向层析填料来完成分 离纯化工艺。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种步骤简单、适合大规模工业生 产、具有很好的商业价值的提取微生物发酵产生的表柔红霉素的方法。 尤为重要的是，本发明方法所得的表柔红霉素的最终纯度将提高到97％ 以上。
本发明所述的制备表柔红霉素的方法包括以下步骤：
a)预处理后的表柔红霉素发酵液上大孔弱酸树脂，用添加盐酸的丙 酮或甲醇水溶液进行洗脱；
b)将表柔红霉素洗脱液蒸干后溶于水中，然后用氯仿进行萃取；
c)表柔红霉素萃取液上非极性吸附树脂，再用丙酮水溶液进行洗脱， 制得表柔红霉素。
本发明中，表柔红霉素发酵液的预处理过程按照下列步骤进行：取 表柔红霉素发酵液，将其pH值调至3-5，离心，取菌丝体，用丙酮或甲 醇水溶液抽提，蒸干抽提液，用蒸馏水溶解，抽滤，即得所述预处理后 的表柔红霉素发酵液。
根据本发明，将所述预处理后的表柔红霉素发酵液的pH值调整为 5-8，优选调整为7.0。
根据本发明的一个优选的实施方式，表柔红霉素发酵液的预处理过 程按照下列步骤进行：表柔红霉素发酵液调pH为3.0，静置一段时间后 高速离心取菌丝体，用1.5倍体积的丙酮抽提菌丝体中表柔红霉素，抽 滤除去菌丝体，即得预处理后的表柔红霉素发酵液。
上述表柔红霉素发酵液的预处理步骤可以对发酵液进行初步纯化， 得到纯度为5％左右的表柔红霉素发酵液。但是，该预处理步骤不是必须 的，也可以直接对表柔红霉素发酵液进行以下处理。
表柔红霉素发酵液中的杂质非常多。发明人通过筛选各种树脂，发 现当表柔红霉素水溶液经过大孔弱酸吸附树脂时，很多极性杂质吸附不 上去，而表柔红霉素能够很好的被交换吸附上去。本发明所述大孔弱酸 树脂的型号可以包括CD40和D152。
根据上述方法的步骤a)，所述第一种有机溶剂选自丙酮或甲醇，优 选第一种有机溶剂为丙酮。所述丙酮的浓度可以是20-80％，该浓度越高 越好，但考虑到成本问题，优选50％的丙酮，当用50％的酸性丙酮水洗 脱液洗脱时表柔红霉素被完全洗下，而很多非极性的杂质保留在树脂上， 从而提高了表柔红霉素的纯度。
根据本发明一个优选的实施方式，a)步骤中所添加HCl的浓度可以 为0.01-0.1N，优选0.05N。
通过步骤a)，可以得到纯度为20％左右的表柔红霉素洗脱液。
根据上述方法的步骤b)，所用氯仿的体积优选为和表柔红霉素水溶 液的体积相等，且氯仿的浓度优选为100％。水相和氯仿相的比例没有严 格的限定，但每一相的比例不能少于两相体积之和的30％。
该步骤的主要作用是除去了大部分的水溶性杂质，使得表柔红霉素 的纯度有较大的提高。同时，它也除去了一些极性低的杂质。
优选所述b)步骤采用调节pH的方法进行萃取和反萃取。具体而言， 先将所述pH调至8-9，将表柔红霉素萃取到氯仿有机溶剂相中，再将pH 调至3-5，将表柔红霉素反萃取到水相。
根据本发明一个优选的实施方式，根据b)步骤将表柔红霉素洗脱液 蒸干溶于水后，用氯仿-水体系进行萃取，当调节pH为8-9时，表柔红 霉素主要在氯仿相，而当调节pH在3-5时，表柔红霉素主要在在水相， 因此采用调节pH的方法先将表柔红霉素萃取到氯仿相中，再反萃取到水 相，从而除去杂质。
通过步骤b)，可以得到纯度为71％左右的表柔红霉素萃取液。
根据上述方法的步骤c)，所述非极性吸附树脂为反相吸附树脂，优 选的型号是微球1号。
根据本发明一个优选的实施方式，将步骤b)得到的表柔红霉素萃取 液上反相层析柱，用1∶1的丙酮水溶液进行洗脱，分步接收，收集纯度 较高的部分。该步骤的主要作用是通过反向层析得到纯度较高的表柔红 霉素，采用1∶1的丙酮水溶液洗脱时表柔红霉素与杂质有很好的分离度。
通过步骤c)，可以得到纯度为97％左右的表柔红霉素。
因此，本发明制备表柔红霉素的方法的总收率在20％以上，最高可 达45％以上；最终表柔红霉素的纯度为94％以上，最高可达97％以上。
与前述文献的工艺相比，本方法步骤及设备简单，却同样能达到文 献工艺的纯度，因而更加适合工业化生产。
具体实施方式
本发明表柔红霉素发酵条件如下：
本发明实施例1-10采用以下菌种：Streptomyces peucetius，保藏号为 ATCC 29050，购自美国微生物保藏中心。实施例11-14采用其他类似菌 种。
培养配方：
斜面：高氏培养基
种子培养基(g/L)：淀粉20，酵母浸膏20，葡萄糖20，
麸皮20，MgSO4.7H2O1；
种子培养条件：28℃，220rpm，36h
接种量：10％
发酵培养基(g/L)：黄豆饼粉60，葡萄糖10，麸皮20，K2HPO4.3H2O 0.5，(NH4)2SO42，豆粕10-15，MgSO4.7H2O 0.5，淀粉酶1。
发酵培养条件：28℃，220rpm，6天
表柔红霉素的HPLC检测条件：
色谱柱：agilent C184.6*250mm；
检测波长：254nm；
流动相：0.2％H3PO4∶MeOH＝45∶55；
流速：0.800ml/min
柱温：40℃
实施例1-2考察不同来源的发酵液对分离工艺的影响
实施例1
表柔红霉素发酵液的预处理过程：
取发酵液1000ml，其纯度为1.6％，单位为24ug/ml，将发酵液pH 调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，用1倍的丙酮浸取 其中的表柔红霉素，过滤除去菌丝体，再将丙酮蒸干后用水溶解表柔红 霉素，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为3.2％。
表柔红霉素的制备方法：
装一根高约20cm，直径约为4cm的大孔弱酸离子交换柱，将表柔红 霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，表柔红霉素完全被吸附在柱上， 再用1∶1的丙酮水(0.01MHCl)洗脱柱子，收集全部洗脱液，其纯度 为23.2％。
将表柔红霉素洗脱液中丙酮蒸去，调节水溶液pH为8.0，加入等体 积氯仿充分混匀，静置30分钟，弃去水相。再在氯仿相中加入等体积蒸 馏水，调pH为3.0，充分混匀，静置30分钟，弃去氯仿相。检测发现纯 度为69.8％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的微球一号层析柱，将表柔红霉素 的水溶液以2ml/min的流速过柱，再用1∶1的丙酮水洗脱柱子，分步收 集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为97.3％。以上几步的总收 率约为48％。
实施例2
表柔红霉素发酵液的预处理过程：
取发酵液1000ml，其纯度为2.2％，单位为21ug/ml，将发酵液pH 调为5.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，用2倍的丙酮浸取 其中的表柔红霉素，过滤除去菌丝体，再将丙酮蒸干后用水溶解表柔红 霉素，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为3.5％。
表柔红霉素的制备方法：
装一根高约20cm，直径约为4cm的D152交换柱，将表柔红霉素的 水溶液以2ml/min的流速过柱，表柔红霉素完全被吸附在柱上，再用1∶ 1的丙酮水(0.05MHCl)洗脱柱子，收集全部洗脱液，其纯度为26.4％。
将表柔红霉素洗脱液中丙酮蒸去，调节水溶液pH为9.0，加入等体 积氯仿充分混匀，静置30分钟，弃去水相。再在氯仿相中加入等体积蒸 馏水，调pH为5.0，充分混匀，静置30分钟，弃去氯仿相。检测发现纯 度为72.1％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的微球一号层析柱，将表柔红霉素 的水溶液以2ml/min的流速过柱，再用1∶1的丙酮水洗脱柱子，分步收 集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为96.9％。以上几步的总收 率约为53％。
实施例3-5考察不同的抽提溶剂对分离工艺的影响
实施例3
表柔红霉素发酵液的预处理过程：
取发酵液1000ml，其纯度为1.8％，单位为19ug/ml，将发酵液pH 调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，用3倍的甲醇浸取 其中的表柔红霉素，过滤除去菌丝体，再将甲醇蒸干后用水溶解表柔红 霉素，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为3.5％。
表柔红霉素的制备方法：
装一根高约20cm，直径约为4cm的D152离子交换柱，将表柔红霉 素的水溶液以2ml/min的流速过柱，表柔红霉素完全被吸附在柱上，再 用1∶1的丙酮水(0.1MHCl)洗脱柱子，收集全部洗脱液，其纯度为24.8 ％。
将表柔红霉素洗脱液中丙酮蒸去，调节水溶液pH为9.0，加入等体 积氯仿充分混匀，静置30分钟，弃去水相。再在氯仿相中加入等体积蒸 馏水，调pH为3.0，充分混匀，静置30分钟，弃去氯仿相。检测发现纯 度为68.7％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的反向吸附层析柱，将表柔红霉素 的水溶液以2ml/min的流速过柱，再用1∶1的丙酮水洗脱柱子，分步收 集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为95.9％。以上几步的总收 率约为49％。
实施例4
表柔红霉素发酵液的预处理过程：
取发酵液1000ml，其纯度为1.3％，单位为22ug/ml，将发酵液pH 调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，用2倍的丙酮浸取 其中的表柔红霉素，过滤除去菌丝体，再将丙酮蒸干后用水溶解表柔红 霉素，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为2.9％。
表柔红霉素的制备方法：
装一根高约20cm，直径约为4cm的D152离子交换柱，将表柔红霉 素的水溶液以2ml/min的流速过柱，表柔红霉素完全被吸附在柱上，再 用1∶1的丙酮水(0.01MHCl)洗脱柱子，收集全部洗脱液，其纯度为 19.5％。
将表柔红霉素洗脱液中丙酮蒸去，调节水溶液pH为9.0，加入等体 积氯仿充分混匀，静置30分钟，弃去水相。再在氯仿相中加入等体积蒸 馏水，调pH为4.0，充分混匀，静置30分钟，弃去氯仿相。检测发现纯 度为67.5％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的微球一号层析柱，将表柔红霉素 的水溶液以2ml/min的流速过柱，再用1∶1的丙酮水洗脱柱子，分步收 集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为97.2％。以上几步的总收 率约为50％。
实施例5
表柔红霉素发酵液的预处理过程：
取发酵液1000ml，其纯度为2.1％，单位为26ug/ml，将发酵液pH 调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，用1.5倍的甲醇浸取 其中的表柔红霉素，过滤除去菌丝体，再将乙醇蒸干后用水溶解表柔红 霉素，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为3.7％。
表柔红霉素的制备方法：
装一根高约20cm，直径约为4cm的D152离子交换柱，将表柔红霉 素的水溶液以2ml/min的流速过柱，表柔红霉素完全被吸附在柱上，再 用3∶1的丙酮水(0.01MHCl)洗脱柱子，收集全部洗脱液，其纯度为 26.4％。
将表柔红霉素洗脱液中丙酮蒸去，调节水溶液pH为9.0，加入等体 积氯仿充分混匀，静置30分钟，弃去水相。再在氯仿相中加入等体积蒸 馏水，调pH为3.0，充分混匀，静置30分钟，弃去氯仿相。检测发现纯 度为69.8％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的微球一号层析柱，将表柔红霉素 的水溶液以2ml/min的流速过柱，再用1∶1的丙酮水洗脱柱子，分步收 集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为96.8％。以上几步的总收 率约为49％。
实施例6-7考察不同大孔弱酸吸附树脂对分离的影响
实施例6
表柔红霉素发酵液的预处理过程：
取发酵液1000ml，其纯度为2.0％，单位为17ug/ml，将发酵液pH 调为4.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，用2倍的丙酮浸取 其中的表柔红霉素，过滤除去菌丝体，再将丙酮蒸干后用水溶解表柔红 霉素，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为3.5％。
表柔红霉素的制备方法：
装一根高约20cm，直径约为4cm的CD40离子交换柱，将表柔红霉 素的水溶液以2ml/min的流速过柱，表柔红霉素完全被吸附在柱上，再 用1∶1的丙酮水(0.01MHCl)洗脱柱子，收集全部洗脱液，其纯度为 28.6％。
将表柔红霉素洗脱液中丙酮蒸去，调节水溶液pH为9.0，加入等体 积氯仿充分混匀，静置30分钟，弃去水相。再在氯仿相中加入等体积蒸 馏水，调pH为3.0，充分混匀，静置30分钟，弃去氯仿相。检测发现纯 度为70.2％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的微球一号层析柱，将表柔红霉素 的水溶液以2ml/min的流速过柱，再用1∶1的丙酮水洗脱柱子，分步收 集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为97.3％。以上几步的总收 率约为51％。
实施例7
表柔红霉素发酵液的预处理过程：
取发酵液1000ml，其纯度为2.5％，单位为20ug/ml，将发酵液pH 调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，用1.5倍的丙酮浸取 其中的表柔红霉素，过滤除去菌丝体，再将丙酮蒸干后用水溶解表柔红 霉素，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为3.9％。
表柔红霉素的制备方法：
装一根高约20cm，直径约为4cm的D152大孔弱酸离子交换柱，将 表柔红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，表柔红霉素全部被吸附在 柱上，再用1∶1的丙酮水(0.01MHCl)洗脱柱子，收集全部洗脱液， 其纯度为21.5％。
将表柔红霉素洗脱液中丙酮蒸去，调节水溶液pH为9.0，加入等体 积氯仿充分混匀，静置30分钟，弃去水相。再在氯仿相中加入等体积蒸 馏水，调pH为3.0，充分混匀，静置30分钟，弃去氯仿相。检测发现纯 度为67.5％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的反向吸附层析柱，将表柔红霉素 的水溶液以2ml/min的流速过柱，再用1∶1的丙酮水洗脱柱子，分步收 集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为96.4％。以上几步的总收 率约为45％。
实施例8、9考察不同的吸附树脂对分离的影响
实施例8
表柔红霉素发酵液的预处理过程：
取发酵液1000ml，其纯度为1.8％，单位为16ug/ml，将发酵液pH 调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，用2倍的丙酮浸取 其中的表柔红霉素，过滤除去菌丝体，再将丙酮蒸干后用水溶解表柔红 霉素，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为3.5％。
表柔红霉素的制备方法：
装一根高约20cm，直径约为4cm的CD40弱酸离子交换柱，将表柔 红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，表柔红霉素完全被吸附在柱上， 再用1∶1的丙酮水(0.01MHCl)洗脱柱子，收集全部洗脱液，其纯度 为25.4％。
将表柔红霉素洗脱液中丙酮蒸去，调节水溶液pH为9.0，加入等体 积氯仿充分混匀，静置30分钟，弃去水相。再在氯仿相中加入等体积蒸 馏水，调pH为3.0，充分混匀，静置30分钟，弃去氯仿相。检测发现纯 度为72.1％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的反相吸附树脂1400，将表柔红 霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，再用1∶1的丙酮水洗脱柱子，分 步收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为94.8％。以上几步的 总收率约为52％。
实施例9
表柔红霉素发酵液的预处理过程：
取发酵液1000ml，其纯度为1.7％，单位为18ug/ml，将发酵液pH 调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，用2.5倍的丙酮浸取 其中的表柔红霉素，过滤除去菌丝体，再将丙酮蒸干后用水溶解表柔红 霉素，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为3.9％。
表柔红霉素的制备方法：
装一根高约20cm，直径约为4cm的D152离子交换柱，将表柔红霉 素的水溶液以2ml/min的流速过柱，表柔红霉素完全被吸附在柱上，再 用1∶1的丙酮水(0.01MHCl)洗脱柱子，收集全部洗脱液，其纯度为 27.3％。
将表柔红霉素洗脱液中丙酮蒸去，调节水溶液pH为9.0，加入等体 积氯仿充分混匀，静置30分钟，弃去水相。再在氯仿相中加入等体积蒸 馏水，调pH为3.0，充分混匀，静置30分钟，弃去氯仿相。检测发现纯 度为72.5％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的反相吸附YPRII，将表柔红霉素 的水溶液以2ml/min的流速过柱，再用1∶1的丙酮水洗脱柱子，分步收 集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为95.0％。以上几步的总收 率约为47％。
实施例10
表柔红霉素发酵液的预处理过程：
取发酵液1000ml，其纯度为1.9％，单位为23ug/ml，将发酵液pH 调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，用1.5倍的丙酮浸取 其中的表柔红霉素，过滤除去菌丝体，再将丙酮蒸干后用水溶解表柔红 霉素，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为3.5％。
表柔红霉素的制备方法：
装一根高约20cm，直径约为4cm的D152离子交换柱，将表柔红霉 素的水溶液以2ml/min的流速过柱，表柔红霉素完全被吸附在柱上，再 用1∶1的丙酮水(0.05MHCl)洗脱柱子，收集全部洗脱液，其纯度为 25.4％。
将表柔红霉素洗脱液中丙酮蒸去，调节水溶液pH为9.0，加入等体 积氯仿充分混匀，静置30分钟，弃去水相。再在氯仿相中加入等体积蒸 馏水，调pH为3.0，充分混匀，静置30分钟，弃去氯仿相。检测发现纯 度为68.8％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的反相吸附树脂微球一号，将表柔 红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，再用1∶1的丙酮水洗脱柱子， 分步收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为97.9％。以上几步 的总收率约为48％。
实施例11-14比较不同菌种来源的发酵液的分离效果
实施例11
采用天蓝淡红链霉菌ATCC29050进行发酵培养，取发酵液1000ml， 其纯度为2.1％，单位为21ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间， 高速离心后弃去上清液，用1.5倍的丙酮浸取其中的表柔红霉素，过滤 除去菌丝体，再将丙酮蒸干后用水溶解表柔红霉素，同样过滤除去其中 的不溶物，检测其纯度为3.7％。
表柔红霉素的制备方法：
装一根高约20cm，直径约为4cm的D152离子交换柱，将表柔红霉 素的水溶液以2ml/min的流速过柱，表柔红霉素完全被吸附在柱上，再 用1∶1的丙酮水(0.05MHCl)洗脱柱子，收集全部洗脱液，其纯度为 27.3％。
将表柔红霉素洗脱液中丙酮蒸去，调节水溶液pH为9.0，加入等体 积氯仿充分混匀，静置30分钟，弃去水相。再在氯仿相中加入等体积蒸 馏水，调pH为3.0，充分混匀，静置30分钟，弃去氯仿相。检测发现纯 度为71.2％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的反相吸附树脂微球一号，将表柔 红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，再用1∶1的丙酮水洗脱柱子， 分步收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为96.9％。以上几步 的总收率约为47％。
实施例12
采用天蓝淡红链霉菌mYG1118进行发酵培养。该菌株由上海医工院 保藏，是以表柔红霉素产生菌mHJ-02-30-1为原始菌株，构建含有两个 aveBVI表达单元的整合型质粒，并将其转入mHJ-02-30-1中，使菌株内 aveBVI的表达单元数由1个增加到3个，由于增加aveBIV基因表达单元 数可以提高表柔红霉素的产量，其发酵单位比mHJ-02-30-1提高了1倍。
取天蓝淡红链霉菌mYG1118的发酵液1000ml，其纯度为3.3％，单 位为64ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去 上清液，用1.5倍的丙酮浸取其中的表柔红霉素，过滤除去菌丝体，再 将丙酮蒸干后用水溶解表柔红霉素，同样过滤除去其中的不溶物，检测 其纯度为4.3％。
表柔红霉素的制备方法：
装一根高约20cm，直径约为4cm的D152离子交换柱，将表柔红霉 素的水溶液以2ml/min的流速过柱，表柔红霉素完全被吸附在柱上，再 用1∶1的丙酮水(0.05MHCl)洗脱柱子，收集全部洗脱液，其纯度为 31.2％。
将表柔红霉素洗脱液中丙酮蒸去，调节水溶液pH为9.0，加入等体 积氯仿充分混匀，静置30分钟，弃去水相。再在氯仿相中加入等体积蒸 馏水，调pH为3.0，充分混匀，静置30分钟，弃去氯仿相。检测发现纯 度为74.1％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的反相吸附树脂微球一号，将表柔 红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，再用1∶1的丙酮水洗脱柱子， 分步收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为97.6％。以上几步 的总收率约为48％。
实施例13
采用天蓝淡红链霉菌mHJ-02-30-1进行发酵培养。该菌株由上海医 工院保藏，是以柔红霉素产生菌SIPI-1482(医工院保藏，可购买得到) 为原始菌株构建的基因工程菌，具体操作为将红霉素启动子和aveBIV基 因插入柔红糖胺的生物合成基因dnmV内部，置换dnmV基因中间199bp 的碱基，保持剩下的dnmV基因的两端的碱基和编码氨基酸不变，从而 最大限度的减少中断dnmV和插入aveBIV基因对上下游基因的影响，其 发酵单位稳定在35mg/L。
取天蓝淡红链霉菌mHJ-02-30-1的发酵液1000ml，其纯度为2.9％， 单位为34ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃 去上清液，用1.5倍的丙酮浸取其中的表柔红霉素，过滤除去菌丝体， 再将丙酮蒸干后用水溶解表柔红霉素，同样过滤除去其中的不溶物，检 测其纯度为4.1％。
表柔红霉素的制备方法：
装一根高约20cm，直径约为4cm的D152离子交换柱，将表柔红霉 素的水溶液以2ml/min的流速过柱，表柔红霉素完全被吸附在柱上，再 用1∶1的丙酮水(0.05MHCl)洗脱柱子，收集全部洗脱液，其纯度为 29.4％。
将表柔红霉素洗脱液中丙酮蒸去，调节水溶液pH为9.0，加入等体 积氯仿充分混匀，静置30分钟，弃去水相。再在氯仿相中加入等体积蒸 馏水，调pH为3.0，充分混匀，静置30分钟，弃去氯仿相。检测发现纯 度为69.8％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的反相吸附树脂微球一号，将表柔 红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，再用1∶1的丙酮水洗脱柱子， 分步收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为97.1％。以上几步 的总收率约为46％。
实施例14
采用天蓝淡红链霉菌mYG1116E进行发酵培养。该菌株由上海医工 院保藏，是以表柔红霉素产生菌mHJ-02-30-1为原始菌株，通过同源重 组双交换的方法对其旁路代谢的dnrU基因进行敲除得到的工程菌，其发 酵单位比mHJ-02-30-1提高了约40％。
取天蓝淡红链霉菌mYG1116E的发酵液1000ml，其纯度为3.4％， 单位为52ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃 去上清液，用1.5倍的丙酮浸取其中的表柔红霉素，过滤除去菌丝体， 再将丙酮蒸干后用水溶解表柔红霉素，同样过滤除去其中的不溶物，检 测其纯度为3.9％。
表柔红霉素的制备方法：
装一根高约20cm，直径约为4cm的D152离子交换柱，将表柔红霉 素的水溶液以2ml/min的流速过柱，表柔红霉素完全被吸附在柱上，再 用1∶1的丙酮水(0.05MHCl)洗脱柱子，收集全部洗脱液，其纯度为 27.9％。
将表柔红霉素洗脱液中丙酮蒸去，调节水溶液pH为9.0，加入等体 积氯仿充分混匀，静置30分钟，弃去水相。再在氯仿相中加入等体积蒸 馏水，调pH为3.0，充分混匀，静置30分钟，弃去氯仿相。检测发现纯 度为65.1％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的反相吸附树脂微球一号，将表柔 红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，再用1∶1的丙酮水洗脱柱子， 分步收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为94.1％。以上几步 的总收率约为49％。