一种寡核苷酸芯片探针的设计方法和HIV寡核苷酸探针及其质量控制方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 101979537 A (43)申请公布日 2011.02.23 CN 101979537 A *CN101979537A* (21)申请号 201010506321.0 (22)申请日 2010.10.13 C12N 15/10(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 3/00(2006.01) (71)申请人 南方医科大学 地址 510515 广东省广州市白云区沙太南路 1023 号 (72)发明人 李凌 马文丽 郑文岭 (74)专利代理机构 广州市天河庐阳专利事务所 44244 代理人 胡济元 (54) 发明名称 一种寡核苷酸芯片探针。

2、的设计方法和 HIV 寡 核苷酸探针及其质量控制方法 (57) 摘要 本发明属于生物技术领域， 涉及包含核酸的 检测方法， 具体涉及一种寡核苷酸探针设计方法。 本发明所述的寡核苷酸探针设计方法包括以下步 骤 ： (1) 针对靶基因， 设计出长度为 50mer 的靶基 因寡核苷酸探针 ； (2) 设计出与靶基因同源性不 大于 40的长度为 10mer 的通用序列 ； (3) 将通 用序列分别连接在靶基因寡核苷酸探针的两端构 建出寡核苷酸探针。采用本发明所述的设计方法 构建的人免疫缺陷病毒寡核苷酸探针， 其序列为 SEQ ID NO ： 1。对本发明获得的通用序列的互补 序列进行荧光标记得到荧光标。

3、记的互补序列。荧 光标记的互补序列可以用来检测寡核苷酸芯片质 量， 具有灵敏度高的优点， 尤其适合临床病原体基 因的检测芯片设计。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 1 页 附图 1 页 CN 101979542 A1/1 页 2 1. 一种寡核苷酸探针的设计方法， 该方法包括以下步骤 ： (1) 设计靶基因寡核苷酸探针 ： 针对靶基因， 利用生物学软件 Oligo 6.0， 依据寡核苷 酸探针的设计原则设计出长度为 50mer 的靶基因寡核苷酸探针 ； (2) 设计通用序列 ： 利用生物学软件 Ol。

4、igo 6.0， 依据寡核苷酸探针的设计原则设计出 长度为 10mer 的通用序列 ； 所述通用序列与步骤 1 所获得的靶基因寡核苷酸探针的同源性 不大于 40 ； (3) 构建寡核苷酸探针 ： 将步骤 2 获得的通用序列分别连接在步骤 1 所获得的靶基因 寡核苷酸探针的两端， 构建新型寡核苷酸探针 ； 其中， 所述的寡核苷酸探针的设计原则是 ： Tm 值在 894 ； GC 含量为 40 60 ； 重复的单一碱基连续不超过 6 个 ； 探针分子最稳定二级结构配对碱基长度少于 6bp ； 探针内部发夹结构不超过 4 个。 2. 采用权利要求 1 所述的寡核苷酸探针的设计方法构建的一种人免疫缺陷。

5、病毒 寡核苷酸探针， 该探针由以下序列的人免疫缺陷病毒的靶基因寡核苷酸探针和序列为 5 -TATGACTCAG-3 的通用序列连接组成 ： ATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCT ； 其中， 所述的人免疫缺陷病毒的靶基因寡核苷酸探针的两头分别连接一段所述的通用 序列。 3. 一种人免疫缺陷病毒生物芯片质量的控制方法， 该方法包括以下步骤 ： 首先制备含 有权利要求 2 所述的人免疫缺陷病毒寡核苷酸探针的寡核苷酸芯片， 然后对权利要求 2 所 述的通用序列的互补序列进行荧光标记， 最后将荧光标记的互补序列与所制得的寡核苷酸 芯片杂交，。

6、 并用芯片扫描仪扫描寡核苷酸芯片， 分析芯片上各点的荧光强度， 计算荧光强度 大于3000的探针比例， 如果荧光强度大于3000的探针比例大于等于95， 则判断芯片质量 合格 ； 其中荧光标记的互补序列为 5 - 荧光分子 -ATACTGAGTC-3 。 4. 权利要求 3 所述的人免疫缺陷病毒生物芯片质量控制方法， 其特征是荧光分子是 Cy3-N- 羟基琥珀酰亚胺酯。 权 利 要 求 书 CN 101979537 A CN 101979542 A1/4 页 3 一种寡核苷酸芯片探针的设计方法和 HIV 寡核苷酸探针及 其质量控制方法 技术领域 0001 本发明涉及生物化学领域， 具体涉及包含。

7、核酸、 酶或微生物的测定或检验方法的 检测试剂。 背景技术 0002 寡核苷酸(oligo)生物芯片采用的寡核苷酸(oligo)探针通常大于10mer， 如用于 基因分型的 20mer 左右的单核苷酸多态性 (SNP) 探针， 以及目前较流行的长链 oligo 探针 (50、 60、 70mer)， 这种类型芯片可根据已知序列快速设计探针制备芯片， 且其检测的特异性 高， 因而目前在病原体的检测和分型以及基因表达谱研究等领域中具有广泛的应用前景。 0003 人免疫缺陷病毒寡核苷酸生物芯片的稳定性即芯片制备的质量控制是首要的关 键问题。基因芯片制备的质量控制包括基因芯片探针制备的质量控制， 支持。

8、物制备的质 量控制， 探针在支持物上固定的质量控制。其中前两者的质量控制采用常规方法即易于控 制， 而探针在支持物上固定的质控则有多种不同方法的选择。一种方法是利用荧光 DNA 染料， 二聚体的青色素核酸染料对核酸表现出很高的亲和力， 用这些染料对探针染色， 可以 根据荧光的强度来估计芯片的质量 ； 另一种较常用的方法是 ： 利用荧光分子 ( 如 Cy3 或 Cy5)标记的9mer随机引物与芯片杂交。 理论上， 随机引物中可能含有能与探针中某一段或 几段序列互补配对的组分， 这样就可以利用它们杂交后的荧光强度来评价芯片的质量 ； 但 是由于随机引物中能与探针杂交的组分相对较少或浓度低， 所以杂。

9、交的效率和敏感性可能 会低很多 ； 还有一种方法是芯片探针采用一种混合物， 混合物中包含靶基因探针和另一 种已荧光标记的特异寡核苷酸。 通过检测混合物中这段特异寡核苷酸的荧光信号来间接评 价靶基因探针的固定效率。但这种方法由于所有探针溶液中都要加荧光标记的寡核苷酸， 大大增加了芯片的成本。由于传统的寡核苷酸探针设计仅针对待检测的靶基因， 以上这些 方法， 都无法直接、 有效地评价芯片制备的质量。因此， 需要设计一种包含有质量控制信息 的新型人免疫缺陷病毒寡核苷酸探针， 并建立一种高效、 灵敏的人免疫缺陷病毒寡核苷酸 芯片质量控制方法。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是提供一种寡核。

10、苷酸探针的设计方法。 0005 本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种人免疫缺陷病毒寡核苷酸探针。 0006 本发明所要解决的再一个技术问题是提供一种人免疫缺陷病毒寡核苷酸芯片质 量控制的方法。 0007 本发明解决上述问题的技术方案具体是 ： 0008 一种寡核苷酸探针的设计方法， 该方法包括以下步骤 ： 0009 (1) 设计靶基因寡核苷酸探针 ： 针对靶基因， 利用生物学软件 Oligo 6.0 依据寡核 苷酸探针的设计原则设计出长度为 50mer 的靶基因寡核苷酸探针 ； 说 明 书 CN 101979537 A CN 101979542 A2/4 页 4 0010 (2) 设计通用。

11、序列 ： 利用生物学软件 Oligo 6.0， 依据寡核苷酸探针的设计原则设 计出长度为 10mer 的通用序列 ； 所述通用序列与步骤 1 所获得的靶基因寡核苷酸探针同源 性不大于 40 ； 0011 (3) 构建寡核苷酸探针 ： 将步骤 2 所获得的通用序列分别连接在步骤 1 所获得的 靶基因寡核苷酸探针的两端构建出寡核苷酸探针 ； 0012 其中， 所述的寡核苷酸探针的设计原则是 ： Tm 值在 894 ； GC 含量为 40 60 ； 重复的单一碱基连续不超过 6 个 ； 探针分子最稳定二级结构配对碱基长 度少于 6bp ； 探针内部发夹结构不超过 4 个。 0013 采用上述的寡核苷。

12、酸探针的设计方法构建的一种人免疫缺陷病毒寡核苷酸探针， 该探针由以下序列的人免疫缺陷病毒的靶基因寡核苷酸探针和序列为 5 -TATGACTCAG-3 的通用序列连接组成 ： 0014 ATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCT ； 0015 其中， 所述的人免疫缺陷病毒的靶基因寡核苷酸探针的两头分别连接一段所述的 通用序列。 0016 本发明所述的人免疫缺陷病毒寡核苷酸探针可以由本领域常用的方法合成， 如， 利用 DNA 合成仪合成。 0017 一种人免疫缺陷病毒寡核苷酸芯片质量的控制方法， 该方法包括以下步 骤 ： 首先制备含有上述人。

13、免疫缺陷病毒寡核苷酸探针的寡核苷酸芯片， 然后对序列为 5 -TATGACTCAG-3 的通用序列的互补序列进行荧光标记， 最后将荧光标记的互补序列与所 制得的寡核苷酸芯片杂交， 用芯片扫描仪扫描寡核苷酸芯片， 分析芯片上各点的荧光强度， 计算荧光强度大于3000的探针比例， 如果荧光强度大于3000的探针比例大于等于95， 则 判断芯片质量合格。 0018 本发明所述的一种人免疫缺陷病毒寡核苷酸芯片质量的控制方法中， 荧光标记的 互补序列为 5 - 荧光分子 -ATACTGAGTC-3 。 0019 本发明所述的荧光分子可以是 Cy3、 Cy5、 生物素等， 最好是 Cy3。其中 Cy3 是。

14、 Cy3-N- 羟基琥珀酰亚胺酯。 0020 本发明所述的荧光标记的互补序列也可以由本领域常用的方法合成， 如， 利用 DNA 合成仪合成。 0021 采用本发明所述的寡核苷酸探针的设计方法可设计含有通用序列的各种具体基 因的寡核苷酸探针， 该探针与荧光标记的通用序列的互补序列杂交， 具有较高的敏感性和 效率， 可用于含有相应基因的寡核苷酸探针的生物芯片的质量控制。 0022 本发明的生物芯片质量控制方法与现有方法相比具有显著的优势。 由于设计的新 型寡核苷酸探针含有通用序列， 相同的低浓度条件下， 荧光标记的互补序列与本发明获得 的寡核苷酸探针进行杂交时显示出的效率及敏感性高于荧光标记的随机。

15、引物与本发明获 得的寡核苷酸探针进行杂交时显示出来的效率和敏感性。 本发明的芯片质量控制方法尤其 适合临床病原体基因的检测芯片设计。 0023 下面将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。 说 明 书 CN 101979537 A CN 101979542 A3/4 页 5 附图说明 0024 图 1 是 HIV 寡核苷酸芯片质量控制方法比较的杂交结果， 其中 A、 B、 C ： Cy3 标记 的互补序列 ； D、 E、 F ： Cy3 标记的 9mer 的随机引物 ； A、 D ： 10mol/L ； B、 E ： 1mol/L ； C、 F ： 0.1mol/L。 具体实施方式 0025 。

16、例 1 0026 本例采用本发明所述的寡核苷酸探针设计方法制备出一种人免疫缺陷病毒 (HIV-1) 寡核苷酸探针， 其制备的方法和过程如下所述 ： 0027 1、 首先， 从 GenBank 数据库获取人免疫缺陷病毒 (HIV-1)B 亚型 U26942 的 cDNA 全长序列， 通过 BLAST 分析获得 HIV 病毒的保守性序列， 用生物学软件 Oligo 6.0 分别对 BLAST检索所得的HIV-1B亚型U26942保守序列逐一进行分析， 依据寡核苷酸探针的设计原 则设计出长度为 50mer 的 Oligo 探针， 其核苷酸序列为 0028 ATAGTATGGGCAAGCAGGGAGC。

17、TAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCT ； 0029 2、 然后， 利用生物学软件 Oligo 6.0， 依据寡核苷酸探针的设计原则设计出长度为 10mer 的通用序列 ： 5 -TATGACTCAG-3 ， 其中通用序列与 HIV 靶基因探针同源性为 40。 0030 3、 最后， 在该 HIV 靶基因探针两端加上上述通用序列， 得到人免疫缺陷病毒寡核 苷酸探针， 再用 Oligo 6.0 软件分析探针的参数值。其序列为 SEQ ID NO ： 1， 探针的参数如 下 ： GC含量 ： 44.3 ； Tm 值 ： 88.7 ； 发夹结构 ： 3 个， 二聚体 ： 3 个 ；。

18、 符合探针设计的原则。 0031 上述步骤 1 和 2 中， 所述的寡核苷酸探针的设计原则为 ： Tm 值在 894； GC 含量为 40 60 ； 重复的单一碱基连续不超过 6 个 ； 探针分子最稳定二级结构配对 碱基长度少于 6bp ； 探针内部发夹结构不超过 4 个。 0032 上述步骤中， 利用 Oligo 6.0 软件和 BLAST 设计、 分析探针的操作过程如下 ： 0033 (1) 打开 Oligo 6.0 软件 ； 点击 file， new sequence， 输入序列 ； 0034 (2) 点击 Accept/discard 中的 Accept ； 0035 (3) 点击 C。

19、hange 中的 current oligo， 输入需要设计寡核苷酸链的长度50mer ； 0036 (4) 点 击 Analysis，分 别 选 择 duplex formation、 hairpin formation、 composition and Tm中的entire sequence， 保留Melting temperature窗口， 将其他窗口 全部关闭。 0037 (5) 点击 Tm 窗口， 用箭头逐个移动所需序列， 其他窗口顺序显示每段序列所对应 的各项参数值 (Tm 值、 GC 含量、 发夹结构、 二聚体 )。根据探针设计原则中各参数的要求选 择探针， 以保证探针在杂交时的。

20、反应条件比较一致。 0038 (6) 将所选择探针的序列输入 NCBI 网站 BLASTn 的 Enter Query Sequence， 在 Choose Search Set 中， 选择 database 中的 others， 并除去 HIV(exclude HIV) ； 0039 (7) 点击 BLAST， 进行比对 ； 0040 (8)比对结果中， 若该探针与非HIV基因序列Score分值高于40则弃用， 确保探针 的特异性。 0041 例 2 0042 本例为例 1 所得到的人免疫缺陷病毒寡核苷酸探针在对人免疫缺陷病毒芯片进 说 明 书 CN 101979537 A CN 10197。

21、9542 A4/4 页 6 行质量控制上的应用。 0043 首先， 利用DNA合成仪合成例1所得到的人免疫缺陷病毒寡核苷酸探针， 将其溶解 于点样液中， 调整终浓度为 1g/l， 并转移到 384 孔板中备用。运用 Cartesian PixSys 5500 基因芯片点样仪， 将上述探针以及空白对照打印在 Corning 公司的环氧基包被的玻片 上， 其中每行打印 6 个探针点， 第 3、 6 行打印空白对照， 制备获得生物芯片， 上述点样液是 Pronto！ TM epoxide spotting solution， 使用点样液作为空白对照液， 空白对照的信号可 代表芯片的点样过程及点样液的。

22、污染情况。 0044 然后， 合成结构为5 -荧光分子-ATACTGAGTC-3 的Cy3标记的互补序列， 将其溶解 在 2 杂交缓冲液中， 获得浓度分别为 10mol/L、 1mol/L、 0.1mol/L 的互补序列杂交 溶液 ； 将 Cy3 标记的 9mer 的随机引物溶解在 2 杂交缓冲液中， 获得浓度分别为 10mol/ L、 1mol/L、 0.1mol/L 的随机引物杂交溶液 ； 取 3l 互补序列杂交溶液、 随机引物杂交 溶液分别加入到上述制备好的生物芯片上， 置于杂交盒中 30下杂交 4h， 其中杂交缓冲溶 液组成为 50甲酰胺、 10SSC、 0.2 SDS。 0045 杂。

23、交后先用 2SSC、 0.1 SDS 洗脱掉盖玻片， 再用 2SSC、 0.1 SDS 洗脱 5min ； 0.1SSC、 0.1 SDS 洗脱 5min， 重复两次 ； 0.1SSC 洗脱 1min， 重复五次 ； 氮气吹干。 0046 用Genepix 4000B扫描生物芯片， 杂交结果如图1所示。 然后以Genepix Pro 6.0 分析各探针点与空白对照点 Cy3 的荧光强度。 0047 如图 1 所示， 较高浓度即 10mol/L 时两者的杂交效果基本相当 ( 图 1A、 D) ： 芯 片上所有探针点的荧光强度均大于 3000， 合格探针的比例为 100， 表明芯片制备质量合 格。。

24、空白对照无杂交信号， 表明点样液及点样过程无污染。而较低浓度时， 即 1mol/L、 0.1mol/L 的 Cy3 标记的互补序列的杂交信号显著强于相同浓度的 Cy3 标记的 9mer 的随 机引物的杂交信号， 其中1mol/L的Cy3-互补序列杂交信号与10mol/L的Cy3标记的互 补序列杂交信号基本相当， 也就是说采用比 Cy3 标记的 9mer 的随机引物浓度低十倍的 Cy3 标记的互补序列即可高效、 灵敏地检测寡核苷酸芯片的制备质量。 说 明 书 CN 101979537 A CN 101979542 A1/1 页 7 0001 序 列 表 CN 101979537 A CN 101979542 A1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 101979537 A 。