一种检测感染马铃薯的病毒的方法及其专用引物.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101851685 B (45)授权公告日 2012.02.01 CN 101851685 B *CN101851685B* (21)申请号 201010102020.1 (22)申请日 2010.01.27 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (73)专利权人 中国检验检疫科学研究院 地址 100121 北京市朝阳区双桥中路动植检 所 (72)发明人 李明福 黄新 刘梅 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 任凤华 CN 101210271 A,。

2、2008.07.02, (54) 发明名称 一种检测感染马铃薯的病毒的方法及其专用 引物 (57) 摘要 本发明公开了检测感染马铃薯的病毒的方法 及其专用引物。 本发明提供的的专用引物， 包括如 下至少一对 ： 引物对 I ： 序列表的序列 1 和序列表 的序列 2 所示核苷酸序列组成的引物对 ； 引物对 II ： 序列表的序列 3 和序列表的序列 4 所示核苷 酸序列组成的引物对 ； 引物对 III ： 序列表的序列 5 和序列表的序列 6 所示核苷酸序列组成的引物 对 ； 引物对 IV ： 序列表的序列 7 和序列表的序列 8 所示核苷酸序列组成的引物对 ； 引物对 V ： 序列表 的序列。

3、9和序列表的序列10所示核苷酸序列组成 的引物对。本发明提供的方法用所述引物对进行 检测。 应用本发明进行核酸检测具有高选择、 高特 异性、 可操作性强、 一管式快速检测五种病毒的优 点。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张艳霞 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 5 页 附图 1 页 CN 101851685 B1/1 页 2 1. 辅助检测感染马铃薯的病毒的专用引物， 包括如下五对引物中的至少一对 ： 引物对 I ： 序列表的序列 1 和序列表的序列 2 所示核苷酸序列组成的引物对 ； 引物对 II ： 序列。

4、表的序列 3 和序列表的序列 4 所示核苷酸序列组成的引物对 ； 引物对 III ： 序列表的序列 5 和序列表的序列 6 所示核苷酸序列组成的引物对 ； 引物对 IV ： 序列表的序列 7 和序列表的序列 8 所示核苷酸序列组成的引物对 ； 引物对 V ： 序列表的序列 9 和序列表的序列 10 所示核苷酸序列组成的引物对 ； 所述感染马铃薯的病毒为烟草花叶病毒、 马铃薯 X 病毒、 马铃薯 Y 病毒、 马铃薯 V 病毒 或烟草环斑病毒。 2. 如权利要求 1 所述的专用引物， 其特征在于 ： 所述专用引物由所述引物对 I、 所述引 物对 II、 所述引物对 III、 所述引物对 IV 和所。

5、述引物对 V 组成。 3. 权利要求 1 或 2 所述专用引物在辅助检测感染马铃薯的病毒中的应用 ； 所述感染马 铃薯的病毒为烟草花叶病毒、 马铃薯 X 病毒、 马铃薯 Y 病毒、 马铃薯 V 病毒或烟草环斑病毒。 4. 权利要求 1 或 2 所述专用引物在制备辅助检测感染马铃薯的病毒的试剂盒中的应 用 ； 所述感染马铃薯的病毒为烟草花叶病毒、 马铃薯X病毒、 马铃薯Y病毒、 马铃薯V病毒或 烟草环斑病毒。 5. 一种辅助检测感染马铃薯的病毒的试剂盒， 它包括权利要求 1 或 2 所述专用引物 ； 所述感染马铃薯的病毒为烟草花叶病毒、 马铃薯 X 病毒、 马铃薯 Y 病毒、 马铃薯 V 病毒或。

6、烟 草环斑病毒。 6. 权利要求 5 所述试剂盒在辅助检测感染马铃薯的病毒中的应用 ； 所述感染马铃薯的 病毒为烟草花叶病毒、 马铃薯 X 病毒、 马铃薯 Y 病毒、 马铃薯 V 病毒或烟草环斑病毒。 7. 一种辅助检测待测生物样本中含有哪种或哪几种感染马铃薯的病毒的方法， 所述感 染马铃薯的病毒为烟草花叶病毒、 马铃薯 X 病毒、 马铃薯 Y 病毒、 马铃薯 V 病毒或烟草环斑 病毒， 其特征在于 ： 所述方法包括如下步骤 ： 以待测样本的cDNA为模板， 权利要求1至3中任一所述专用引物进行PCR， 检测PCR产 物 ； 如果得到 152bp 的 PCR 产物， 则待测样本中含有烟草花叶病。

7、毒 ； 如果得到 879bp 的 PCR 产物， 则待测样本中含有马铃薯 X 病毒 ； 如果得到 563bp 的 PCR 产物， 则待测样本中含有马 铃薯Y病毒 ； 如果得到615bp的PCR产物， 则待测样本中含有马铃薯V病毒 ； 如果得到343bp 的 PCR 产物， 则待测样本中含有烟草环斑病毒。 8.如权利要求7所述的方法， 其特征在于 ： 所述PCR的反应参数为 ： 94、 15min ； 94、 30sec， 60、 30sec， 72、 70sec， 34 个循环 ； 72、 10min。 9. 用于检测目的 DNA 或 RNA 的引物对， 所述引物对为如下五对引物中的任意一对 。

8、： 引物对 I ： 序列表的序列 1 和序列表的序列 2 所示核苷酸序列组成的引物对 ； 引物对 II ： 序列表的序列 3 和序列表的序列 4 所示核苷酸序列组成的引物对 ； 引物对 III ： 序列表的序列 5 和序列表的序列 6 所示核苷酸序列组成的引物对 ； 引物对 IV ： 序列表的序列 7 和序列表的序列 8 所示核苷酸序列组成的引物对 ； 引物对 V ： 序列表的序列 9 和序列表的序列 10 所示核苷酸序列组成的引物对。 权 利 要 求 书 CN 101851685 B1/6 页 3 一种检测感染马铃薯的病毒的方法及其专用引物 技术领域 0001 本发明涉及一种检测感染马铃薯的。

9、病毒的方法及其专用引物。 背景技术 0002 聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction， PCR) 是 80 年代中期发展起来的 体外核酸扩增技术。PCR 反应类似于 DNA 的天然复制过程， 由变性 - 退火 - 延伸三个基本 反应步骤构成， 即在TaqDNA聚合酶的作用下， 以dNTP为反应原料， 靶序列为模板， 按碱基配 对与半保留复制原理， 合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。通过 PCR， 能在一 个试管内将所要研究的目的基因或某一 DNA 片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍， 具有 特异、 敏感、 产率高、 快速、 简便、 重复性好、 易自。

10、动化等突出优点， PCR 已广泛应用于生物检 测和疾病诊断等领域。 0003 多重 PCR 是在普通 PCR 的基础上加以改进， 原理与常规 PCR 基本相同， 只是在一个 PCR 反应体系中加入两对以上引物， 针对多个模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片 段的 PCR 技术。 0004 在上述两种 PCR 反应中， 引物设计的好坏直接影响检测的特异性和灵敏度。然而， 传统的 PCR 体系中， 引物二聚体的形成以及引物与模板的错配严重制约 PCR 技术的应用。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种检测感染马铃薯的病毒的方法及其专用引物。 0006 本发明提供了辅助检测感染马铃薯的病毒的。

11、专用引物， 包括如下五对引物中的至 少一对 ： 0007 引物对 I ： 序列表的序列 1 和序列表的序列 2 所示核苷酸序列组成的引物对 ； 0008 引物对 II ： 序列表的序列 3 和序列表的序列 4 所示核苷酸序列组成的引物对 ； 0009 引物对 III ： 序列表的序列 5 和序列表的序列 6 所示核苷酸序列组成的引物对 ； 0010 引物对 IV ： 序列表的序列 7 和序列表的序列 8 所示核苷酸序列组成的引物对 ； 0011 引物对 V ： 序列表的序列 9 和序列表的序列 10 所示核苷酸序列组成的引物对 ； 0012 所述感染马铃薯的病毒为烟草花叶病毒、 马铃薯 X 病。

12、毒、 马铃薯 Y 病毒、 马铃薯 V 病毒或烟草环斑病毒。 0013 所述专用引物具体由所述引物对 I、 所述引物对 II、 所述引物对 III、 所述引物对 IV 和所述引物对 V 组成。 0014 所述专用引物可应用于辅助检测感染马铃薯的病毒 ； 所述感染马铃薯的病毒为烟 草花叶病毒、 马铃薯 X 病毒、 马铃薯 Y 病毒、 马铃薯 V 病毒或烟草环斑病毒。 0015 所述专用引物可应用于制备辅助检测感染马铃薯的病毒的试剂盒 ； 所述感染马铃 薯的病毒为烟草花叶病毒、 马铃薯 X 病毒、 马铃薯 Y 病毒、 马铃薯 V 病毒或烟草环斑病毒。 0016 本发明还保护一种辅助检测感染马铃薯的病。

13、毒的试剂盒， 它包括所述专用引物 ； 所述感染马铃薯的病毒为烟草花叶病毒、 马铃薯 X 病毒、 马铃薯 Y 病毒、 马铃薯 V 病毒或烟 说 明 书 CN 101851685 B2/6 页 4 草环斑病毒。 0017 所述试剂盒可应用于辅助检测感染马铃薯的病毒 ； 所述感染马铃薯的病毒为烟草 花叶病毒、 马铃薯 X 病毒、 马铃薯 Y 病毒、 马铃薯 V 病毒或烟草环斑病毒。 0018 本发明提供了辅助检测待测生物样本中含有哪种或哪几种感染马铃薯的病毒的 方法， 所述感染马铃薯的病毒为烟草花叶病毒、 马铃薯 X 病毒、 马铃薯 Y 病毒、 马铃薯 V 病毒 或烟草环斑病毒， 其特征在于 ： 所。

14、述方法包括如下步骤 ： 0019 以待测样本的 cDNA 为模板， 任一所述专用引物进行 PCR， 检测 PCR 产物 ； 如果得到 152bp的PCR产物， 则待测样本中含有烟草花叶病毒 ； 如果得到879bp的PCR产物， 则待测样 本中含有马铃薯 X 病毒 ； 如果得到 563bp 的 PCR 产物， 则待测样本中含有马铃薯 Y 病毒 ； 如 果得到 615bp 的 PCR 产物， 则待测样本中含有马铃薯 V 病毒 ； 如果得到 343bp 的 PCR 产物， 则待测样本中含有烟草环斑病毒。 0020 所述方法中， 所述 PCR 的反应参数为 ： 94、 15min ； 94、 30se。

15、c， 60、 30sec， 72、 70sec， 34 个循环 ； 72、 10min。 0021 检测烟草花叶病毒 (CMV) 的引物序列为 ： 0022 CMV-f ： 5 -GCGCATTCAAATTCGAGTTAATIIIIIGCCGAAAT-3 ( 序列 1) ； 0023 CMV-r ： 5 -GCATACTGATAAACCAGTACCGGTIIIIITCCGTCCG-3 ( 序列 2)。 0024 目的条带为 152bp。 0025 检测马铃薯 X 病毒 (PVX) 的引物序列为 ： 0026 PVX-f ： 5 -ATCCCTTTGGACCTGCTTAGIIIIIGAGACTA。

16、CGG-3 ( 序列 3) ； 0027 PVX-r ： 5 -TTTCCCAGAAGGCCGAAGIIIIIGCACTTGTGTTC-3 ( 序列 4)。 0028 目的条带为 879bp。 0029 检测马铃薯 Y 病毒 (PVY) 的引物序列为 ： 0030 PVY-f ： 5 -GCCACGAATTAAAGCTATCACGTCCIIIIIGAGAATGC-3 ( 序列 5) ； 0031 PVY-r ： 5 -GTCGAGGTTGGGCTGATTTCAIIIIIGCGGCCTTCA-3 ( 序列 6)。 0032 目的条带为 563bp。 0033 检测马铃薯 V 病毒 (PVV) 的。

17、引物序列为 ： 0034 PVV-f ： 5 -CATACATGCCACGITATGGTTTGGIIIIIAATTTGCG-3 ( 序列 7) ； 0035 PVV-r ： 5 -TGAAATCAATGAGTTTACCIIIIIGAGTGTTTCG-3 ( 序列 8)。 0036 目的条带为 615bp。 0037 检测烟草环斑病毒 (TRSV) 的引物序列为 ： 0038 TRSV-f ： 5 -TGGTCTGGCACTATAAGCGGAIIIIICAAGAGTGT-3 ( 序列 9) ； 0039 TRSV-r ： 5 -ACTAGAAAACATGGGAGGAIIIIICTGAGAITCG。

18、G-3 ( 序列 10)。 0040 目的条带为 343bp。 0041 I 指的是脱氧次黄嘌呤核苷酸。 0042 本发明还保护如下 (a) 或 (b) 或 (c) 的引物对 ： 0043 (a) 用于检测目的 DNA 的引物对， 由针对目的 DNA 的上游引物和下游引物组成， 其 特征在于 ： 所述上游引物和所述下游引物自 5 端至 3 端依次为结合区 (5 区 )、 连接区 (polyI 区 ) 和保证特异性延伸区 (3 区 ) ； 所述结合区由 18-25 个与待测的目的 DNA 的保 守区域互补的核苷酸组成 ； 所述连接区由 4-8 个脱氧次黄嘌呤核苷酸组成 ； 所述保证特异 说 明 。

19、书 CN 101851685 B3/6 页 5 性延伸区由 6-12 与待测的目的 DNA 的保守区域互补的核苷酸组成 ； 0044 (b) 用脱氧次黄嘌呤核苷酸取代 (a) 所述引物对中的所述结合区和 / 或所述保证 特异性延伸区中的核苷酸， 得到的引物对 ； 0045 (c) 用于检测目的 RNA 的引物对， 由针对目的 RNA 的上游引物和下游引物组成， 其 特征在于 ： 所述上游引物和所述下游引物自 5 端至 3 端依次为结合区 (5 区 )、 连接区 (polyI 区 ) 和保证特异性延伸区 (3 区 ) ； 所述结合区由 18-25 个与待测的目的 RNA 的保 守区域互补的核苷酸。

20、组成 ； 所述连接区由 4-8 个脱氧次黄嘌呤核苷酸组成 ； 所述保证特异 性延伸区由 6-12 与待测的目的 RNA 的保守区域互补的核苷酸组成。 0046 所述保守区域是指与待测物种内核酸序列同源性较高的， 能特异性识别该待测物 种的基因片段。本发明的引物对可应用于 PCR 反应和核酸检测。PCR 扩增时， polyI 区并不 与模板结合， 而是形成了泡状突起， 使引物的 5 区和 3 区各具不同的功能 ： 5 区的 18-25 个碱基起始引物与模板的结合， 起固定作用 ； 3 区的 6-12 个碱基决定着引物的特异性延 伸， 两者相互作用， 既保证扩增的特异性， 又大大提高了扩增效率。 。

21、0047 所述引物对具体可为如下五对引物中的任意一对 ： 0048 引物对 I ： 序列表的序列 1 和序列表的序列 2 所示核苷酸序列组成的引物对 ； 0049 引物对 II ： 序列表的序列 3 和序列表的序列 4 所示核苷酸序列组成的引物对 ； 0050 引物对 III ： 序列表的序列 5 和序列表的序列 6 所示核苷酸序列组成的引物对 ； 0051 引物对 IV ： 序列表的序列 7 和序列表的序列 8 所示核苷酸序列组成的引物对 ； 0052 引物对 V ： 序列表的序列 9 和序列表的序列 10 所示核苷酸序列组成的引物对。 0053 本发明提供的五种针对感染马铃薯的不同病毒的引。

22、物对， 是根据 NCBI 的比对结 果， 选取各自的保守区域设计的。应用本发明进行核酸检测具有高选择、 高特异性、 可操作 性强、 一管式快速检测五种病毒的优点。 0054 本发明提供的核酸检测方法具有以下优点 ： 0055 1) 特异性强 0056 传统的 PCR 方法中， 引物易形成二聚体以及与模板发生错配， 导致假阴性和假阳 性结果的出现。 本发明采用的引物， 由于其特殊的结构， 引物自身以及引物之间很少形成二 级结构 ； 与模板发生错配的几率很小， 一旦有 3 个以上碱基错配， 就不会成功扩增， 提高了 核酸检测的特异性。 0057 2) 设计简单、 可操作性强 0058 传统多重 P。

23、CR 方法中， 引物设计过程复杂， 要求引物自身或者引物之间很少形成 发夹结构或者二聚体， 保证各引物有相近的退火温度 ； 操作过程中需要对大量的引物进行 筛选， 对其影响因素及条件进行优化。本发明采用的引物， 设计过程简单， 对退火温度不敏 感， 试验过程中无需对引物进行筛选， 大大简化操作程序。 0059 3) 简便、 快速 0060 本发明采用多重 RT-PCR 技术， 可在 3 个小时内同时检测五种马铃薯病毒 (PVX， PVY， PVV， TRSV 和 CMV)。 附图说明 0061 图 1 为图中， M ： DL2000 ； N ： 阴性对照 ； 1 为 CMV ； 2 为 TRS。

24、V ； 3 为 PVY ； 4 为 PVV ； 5 为 说 明 书 CN 101851685 B4/6 页 6 PVX ； 6 为 PVY 与 PVX 复合侵染 ； 7 为 CMV， TRSV， PVV 与 PVX 四种病毒复合侵染 ； 8 为 CMV， TRSV， PVY 与 PVX 四种病毒复合侵染 ； 9 为 CMV， TRSV， PVY， PVV 与 PVX 五种病毒复合侵染。 具体实施方式 0062 以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购。

25、买得到的。 0063 M-MLV 反 转 录 酶 (Promega 公 司 ) ； RNA 酶 抑 制 剂 (Promega 公 司 ) ； 10PCR buffer( 大连 TaKaRa 公司 ) ； dNTP( 大连 TaKaRa 公司 ) ； Ex Taq 酶 ( 大连 TaKaRa 公司 ) ； DL2000DNA Marker( 大连 TaKaRa 公司 ) ； 引物由英骏生物技术公司合成。 0064 实施例 1、 试剂盒的组成 0065 试剂盒由引物对 I、 引物对 II、 引物对 III、 引物对 IV 和引物对 V 组成。 0066 引物对 I( 用于检测烟草花叶病毒 ) ： 。

26、0067 CMV-f ： 5 -GCGCATTCAAATTCGAGTTAATIIIIIGCCGAAAT-3 ； 0068 CMV-r ： 5 -GCATACTGATAAACCAGTACCGGTIIIIITCCGTCCG-3 。 0069 引物对 II( 用于检测马铃薯 X 病毒 ) ： 0070 PVX-f ： 5 -ATCCCTTTGGACCTGCTTAGIIIIIGAGACTACGG-3 ； 0071 PVX-r ： 5 -TTTCCCAGAAGGCCGAAGIIIIIGCACTTGTGTTC-3 。 0072 引物对 III( 用于检测马铃薯 Y 病毒 ) ： 0073 PVY-f ： 。

27、5 -GCCACGAATTAAAGCTATCACGTCCIIIIIGAGAATGC-3 ； 0074 PVY-r ： 5 -GTCGAGGTTGGGCTGATTTCAIIIIIGCGGCCTTCA-3 。 0075 引物对 IV( 用于检测马铃薯 V 病毒 ) ： 0076 PVV-f ： 5 -CATACATGCCACGITATGGTTTGGIIIIIAATTTGCG-3 ； 0077 PVV-r ： 5 -TGAAATCAATGAGTTTACCIIIIIGAGTGTTTCG-3 。 0078 引物对 V( 用于检测烟草环斑病毒 ) ： 0079 TRSV-f ： 5 -TGGTCTGGCA。

28、CTATAAGCGGAIIIIICAAGAGTGT-3 ； 0080 TRSV-r ： 5 -ACTAGAAAACATGGGAGGAIIIIICTGAGAITCGG-3 。 0081 以上 5 对引物混合， 得到引物混合物 ( 每条引物的浓度均为 0.1 0.4M)。 0082 实施例 2、 试剂盒的应用 0083 本生烟 ： 中国检验检疫科学研究院动植物检验检疫科学研究所双桥隔离苗圃鉴别 寄主库。 0084 五种病毒 ： 马铃薯 X 病毒 (PVX) ： ATCC， PV-197 ； 马铃薯 Y 病毒 (PVY) ： ATCC， PV-50 ； 马铃薯 V 病毒 (PVV) ： ATCC， 。

29、PV-754 ； 黄瓜花叶病毒 (CMV) ： ATCC， PV-453 ； 烟草环斑病毒 (TRSV) ： ATCC， PV-97。 0085 样本 A ： CMV ； 0086 样本 B ： TRSV ； 0087 样本 C ： PVY ； 0088 样本 D ： PVV ； 0089 样本 E ： PVX ； 说 明 书 CN 101851685 B5/6 页 7 0090 样本 F ： PVY 与 PVX 等量混合 ； 0091 样本 G ： CMV、 TRSV、 PVV 与 PVX 等量混合 ； 0092 样本 H ： CMV、 TRSV、 PVY 与 PVX 等量混合 ； 0093。

30、 样本 I ： CMV、 TRSV、 PVY、 PVV 与 PVX 等量混合。 0094 二、 一管式检测五种马铃薯病毒 0095 1、 病毒 RNA 的提取 0096 分别用9个样本接种本生烟， 称取0.1g发病本生烟叶片采用植物病毒核酸纳米磁 珠快速提取试剂盒提取病毒 RNA。 0097 2、 cDNA 的合成 0098 反应体系见表 1。 0099 表 1 合成 cDNA 的反应体系 0100 DEPC-H2O 7.8L 10buffer 2.0L MgCl2(25mmol/L) 4.0L dNTP(10mmol/L) 1.0L 随机六聚体引物 2.0L RNasin(44U/L) 0.。

31、5L 植物总 RNA 2.0L AMV Reverse Transcriptase(22U/L) 0.7L 总计 20.0L 0101 混匀后 42水浴 1h， 95灭活 5min， 冰上放置待用。 0102 3、 PCR 扩增 0103 以 cDNA 为模板， 同时使用实施例 1 制备的试剂盒中的 5 对引物进行 PCR 扩增， PCR 体系见表 2， PCR 循环参数见表 3。 0104 表 2PCR 体系 0105 10PCR Buffer 2.5L dNTP Mix(10mM) 1.0L cDNA 2.5L 引物混合物 8.0L 说 明 书 CN 101851685 B6/6 页 8 。

32、ddH2O 10.5L EX Taq 酶 0.5L 总量 25.0L 0106 表 3PCR 循环参数 0107 0108 4、 PCR 产物的电泳检测 0109 采用 TAE 配制 2的琼脂糖凝胶， PCR 产物上样量为每孔 6L， 电泳的分子量参照 为 DL2000。电压 4 10v/cm， 50min， 电泳结果采用凝胶成像系统分析。 0110 电泳结果如图 1 所示。 0111 将 PCR 产物进行测序。测序结果与琼脂糖凝胶电泳结果一致。 0112 结果表明， 本发明的引物特异性强， 可用于对马铃薯病毒进行检测与鉴定。 说 明 书 CN 101851685 B1/5 页 9 0001 0002 序 列 表 CN 101851685 B2/5 页 10 0003 序 列 表 CN 101851685 B3/5 页 11 0004 0005 序 列 表 CN 101851685 B4/5 页 12 0006 序 列 表 CN 101851685 B5/5 页 13 0007 序 列 表 CN 101851685 B1/1 页 14 图 1 说 明 书 附 图 。