技术领域
本发明属于临床微生物鉴定技术领域，具体涉及一种快速鉴定血液样本病原菌的试剂盒及检测方法。
背景技术
世界范围内成人和儿童菌血症都是高发病率和死亡率疾病。每年世界范围内菌血症病例有2千万，即使在发达国家医疗实践中，菌血症仍然具有很大的挑战，特别是新生儿监护病房、移植病房，住院病人、免疫抑制和术后病人、血液病患者等因病原体不能鉴定而应用广谱抗生素或不适当抗生素治疗导致治疗延误的死亡率极高，欧洲每年有135000例死亡，美国有215000例。为达到较好的治疗效果，针对性的抗生素应在症状发生6小时内使用。细菌早期鉴定对免疫抑制病人尤为重要，他们较一般患者感染细菌的范围更广，更难以预知，这样的选择主要取决于治病因素---细菌的鉴定，药敏试验确证。当鉴定结果是阴性，提示临床医生可能是非常见条件致病菌存在。对非培养快速检测技术颇有微词的是不能提供药敏结果，虽然耐药基因研究已有很大进展，并且能提供更符合体内耐药情况的结论，但仍有很多机制不明，特别是泛耐药情况还难以通过基因手段进行完全解决。然而，每一地区流行菌原菌的药敏情况大多可以通过过去的经验预知，特别是在一些教学医院，每月的院感报告可以提供流行病原菌的药敏信息，这些信息通常为菌血症患者提供指导治疗方案。因此，快速鉴定病原菌从而尽早开始针对性治疗，可以大大改善临床治疗效果。
菌血症病原体诊断的金标准是血培养，获得阳性结果需要1-3天，此外，阳性标本还需要1-2天的细菌鉴定和药敏试验，需要特殊培养基的细菌要获得阳性结果则需要更长时间。因血量不足，血液中抗生素的存在及需要特殊营养等条件的限制而导致的敏感性低也是传统培养的一个限制因素。此外，传统的鉴定方法在获得阳性结果后还要进行革兰氏染色，生化反应鉴定等，而这其中有很多潜在的问题：①低特异性病原体需要加做试验；②往往要多个生化试验同时进行；③生化鉴定前要分离纯化，至少需要1-3天；④表型试验不能重复。
因此迫切需要新的更快更精确的细菌鉴定方法。基因芯片技术虽然能够同时进行多种细菌的同时鉴定，但涵盖菌种仍然十分有限，对非常见菌、突变或新菌种更是无能为力，就目前技术而言其成本太高也是重要制约因素，杂交方式固有的局限性必然也影响其特异性。近年来，质谱技术以其快速准确的优点被用于微生物鉴定，但质谱鉴定必须是培养后分纯的单克隆菌落，加之设备昂贵，技术操作难度高等限制了其应用。应用PCR技术直接从临床样本中检测致病菌，与培养相比有很多优点，然而，即使PCR扩增技术早已经被广泛应用于病毒检测，但由于成本，设备、不同DNA抽提效率差异，潜在的产物污染等问题，PCR技术进行血液细菌鉴定仅限于研究，特别是当检测多种病原体时更是一个巨大的挑战。
在实际工作中，很短的一段保守/特异序列的测定就可满足对分子诊断的需要。由于16SrRNA在所有的细菌中都以多拷贝形式存在，并且包含高度保守和可变区域，能够同时满足扩增和进行比较的要求，因此以16SrRNA序列分析为基础，采取毒力和毒素基因鉴定方法，能够直接使用临床标本，在最短的时间内鉴定未知或不可培养的细菌，对细菌性新发传染病做出准确判定。
焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。
焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，通量高、操作方便，便于构建标准化操作流程，因此广受研究者青睐，并在很多方面已应用于临床微生物的分型鉴定及耐药检测。Monstein等(2001)用焦磷酸测序技术检测幽门螺杆菌16S rRNA基因16S rDNA的V1和V3区序列，将胃镜活检标本中得到的23个幽门螺杆菌标本依据其V1区的核苷酸序列差异，鉴定出8种不同的等位基因类型，除11个样本与幽门螺杆菌26695株序列一致、1个样本与199株的序列一致外，根据V1区的改变表现为有1个或2个核苷酸的突变或单个核苷酸的插入而分为4个等位基因类型。另有2个标本的V3区出现C至T转换，证明此技术可满足对临床病原菌标本的快速鉴定和分型。Unner stad等(2001)利用焦磷酸测序技术对106株不同血清型的单核细胞增生李斯特氏菌进行了分型，根据inIB基因第1575位和1578位核苷酸的变化，将血清型1/2a和1/2c分为一组，1/2b和3b分为一组，而血清型4b又可分为2个组。该技术还被应用于百日咳杆菌(Bordetella pert ussis)与副百日咳杆菌(Parapert ussis)等细菌的快速鉴定及分型(Ronaghi等，1999)。Martin等(2006)运用此技术对百日咳杆菌毒力相关ptxS1基因进行了分型鉴定，并与定量PCR作了方法学的比较，结果显示两种方法具有很好的一致性，焦磷酸测序技术适合百日咳杆菌的大规模筛选。此外，Alistair等(2003)用焦磷酸测序技术检测肠球菌的23s rRNA上的抗利奈唑胺位点，并与PCR-RFLP方法比较，结果显示了100％的一致性。Marjo等(2005)用焦磷酸测序技术检测鸟分支杆菌，肺炎链球菌，酿脓链球菌，空肠弯曲杆菌，流感(嗜血)杆菌等多种病原体的23S rRNA基因2058位多态性，以获得病原体的大环内脂抗药性信息。赵锦荣等(2005)建立了基于焦磷酸测序技术的高通量检测耐利福平结核分支杆菌的方法，并用传统的测序方法进行验证，结果显示了100％一致性，他们认为这种方法具有自动化程度高和结果准确等特点，相比传统的测序，具有更快速，简便等特点，适用于耐利福平结核分支杆菌的快速高通量的检测。
本研究通过设计软件对常见临床细菌测序引物随后25bp的序列进行了排列组合，产生了多重不同细菌感染的焦磷酸测序虚拟模式数据库，血培养阳性样品经DNA抽提、通用引物扩增，然后用通用引物作为测序引物，测序结果与焦磷酸测序虚拟模式数据库比对判断型别。该方法能一次测序区分常见临床细菌及不同细菌的混合感染，可用于细菌感染的临床诊断及耐药监测。采用的空白对照可以在型别判断中有效扣除可能发生的污染，解决了高的灵敏度必然带来难以控制的污染难题。快速可靠鉴定血液中细菌种属的重要意义在于：①合理应用抗生素，避免无效用药；②改善预后；③减缓获得耐药；④减少医疗费用。不合适抗生素应用常常导致治疗失败，而使住院期延长，并发症，耐药以及检验费用增加等后果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速可靠的菌血症检测试剂盒。
本发明还要解决的技术问题是提供上述试剂盒的检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种菌血症检测试剂盒，它包括：
(1)扩增细菌16S rRNA的V1可变区的通用引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物对；
(2)测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
(3)亲和素标记的磁珠；
其中，SEQ ID NO：1在其5’端标记生物素；
在一次检测中共同使用。
上述菌血症检测试剂盒，具体包括如下试剂：
(1)DNA提取试剂：核酸纯化柱，Buffer L1，Buffer L2，Buffer WA，Buffer WB，Buffer TE；
(2)反应液：PCR Buffer，通用引物SEQ ID NO：1～2，2mM MgCl2，0.2mM dNTPs，2U/μLTaq DNA聚合酶；
其中，PCR Buffer具体为：0.1％(v/v)NP-40，0.02％(v/v)明胶，0.06％g/mL BSA，0.1％(v/v)Tween-20，0.06M pH8.9Tricine。
(3)单链纯化试剂：75％(v/v)乙醇溶液，0.2M NaOH，10mM pH 7.6Tris-Acetate溶液，结合缓冲液，退火缓冲液；
其中，结合缓冲液具体为：10mM Tris-HCl，2M NaCl，1mM EDTA，0.1％(v/v)Tween-20；退火缓冲液具体为：20mM pH 7.6Tris-Acetate，2mM醋酸镁。
(4)测序试剂：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧光素和dNTP(dNTP即dATP S，dTTP，dCTP，dGTP)。
一种菌血症检测试剂盒，它包括上述的所有核苷酸序列的碱基互补序列，也就是包括：
(1)扩增细菌16S rRNA的V1可变区的通用引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示引物对；
(2)测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
(3)亲和素标记的磁珠；
其中，SEQ ID NO：3在其5’端标记生物素；
在一次检测中共同使用。
上述菌血症检测试剂盒，具体包括如下试剂：
(1)DNA提取试剂：核酸纯化柱，Buffer L1，Buffer L2，Buffer WA，Buffer WB，Buffer TE；
(2)反应液：PCR Buffer，通用引物SEQ ID NO：3～4，2mM MgCl2，0.2mM dNTPs，2U/μLTaq DNA聚合酶；
其中，PCR Buffer具体为：0.1％(v/v)NP-40，0.02％(v/v)明胶，0.06％(w/v)g/mL BSA，0.1％(v/v)Tween-20，0.06M pH8.9Tricine。
(3)单链纯化试剂：75％(v/v)乙醇溶液，0.2M NaOH，10mM pH 7.6Tris-Acetate溶液，结合缓冲液，退火缓冲液；
其中，结合缓冲液具体为：10mM Tris-HCl，2M NaCl，1mM EDTA，0.1％(v/v)Tween-20；退火缓冲液具体为：20mM pH 7.6Tris-Acetate，2mM醋酸镁。
(4)测序试剂：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧光素和dNTP(dNTP即dATP S，dTTP，dCTP，dGTP)。
本发明所检测的菌为狭义的细菌，包括：假单胞菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、链球菌属、克雷伯菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、不动杆菌属。
上述菌血症检测试剂盒的检测方法包括如下步骤：
(1)提取细菌DNA；
(2)以步骤(1)所得DNA为模板，利用通用引物进行细菌16S rRNA的V1可变区的PCR扩增；
(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化；
(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序；
(5)测序结果与数据库比对判断细菌种属。
步骤(2)中，所述的PCR扩增体系为：10×PCR buffer 5μL，SEQ ID NO：10.3μL，SEQ ID NO：20.3μL，Template DNA 3μl，0.2mM dNTPs，2mM MgCl2，Taq DNA聚合酶2U，加无菌水至50μL；PCR扩增条件为：94℃3min；28个循环(94℃25s，42℃30s，72℃20s)；72℃3min。或者将SEQ ID NO：3替换上述SEQ ID NO：1，同时将SEQ IDNO：4替换上述SEQ IDNO：2，其它PCR扩增体系和条件相同。
有益效果：本发明的试剂盒利用焦磷酸测序技术测定的V1正向区段的序列和数据库比对判断细菌种属。应用此试剂盒能一次测序鉴定血液样本细菌种属。可用于菌血症及败血症的临床诊断。不仅为临床诊疗赢得了宝贵的抢救时间，而且具有成本低廉，操作方便，特异性强的优点。本发明方法可以使血液样本细菌种属鉴定时间大大缩短，成本为传统鉴定法的三分之一(本发明方法检测时间约4～5小时)，另外，通过序列比对鉴定细菌是菌种鉴定的终极方法，特别是对一些难鉴定菌，序列比对鉴定更具优势。
附图说明
图1为1例血培养阴性标本致病菌检测结果图，测序结果为阴性。
图2为1例血培养阳性标本致病菌检测结果图，测序结果为GAATCCAGGAGCAAGCTCCC TTCATCCG，与数据库比对判定为铜绿假单胞菌。
图3为1例血培养阳性标本致病菌检测结果图，测序结果为AACGTCAGAGGAGCAAGCTC CTCG，与数据库比对判定为表皮葡萄球菌。
图4为1例血培养阳性标本致病菌检测结果图，测序结果为AACAGACGAGGAGCTTGCTC CTTTG，与数据库比对判定为人葡萄球菌。
图5为1例血培养阳性标本致病菌检测结果图，测序结果为GTAACAGGAAGAAGCTTGCT TC，与数据库比对判定为大肠埃希菌。
图6为1例血培养阳性标本致病菌检测结果图，测序结果为CCCGTCCCATTTTTCCCCCGGATGGGAAGGACGAACGAACGTCCCGGTTCGG，与数据库比对判定为屎肠球菌和嗜麦芽窄食单胞菌混合感染。
图7为1例血培养阳性标本致病菌检测结果图，测序结果为CCTCTTTTCCGGTGGAGCAA GCTCCGGTGG，与数据库比对判定为屎肠球菌。
图8为1例血培养阳性标本致病菌检测结果图，测序结果为CGTCACCCAAGGAGCAAGCT CCTC，与数据库比对判定为弗氏柠檬酸杆菌。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：试剂盒的制备方法。
(1)DNA提取试剂：
核酸纯化柱，购于杭州新捷生物科技有限公司，
Buffer L1，Buffer L2，Buffer WA，Buffer WB，Buffer TE，购于杭州新捷生物科技有限公司。
(2)反应液：
PCR Buffer：0.1％(v/v)NP-40(购于美国Sigma公司)，0.02％(v/v)明胶(购于美国Sigma公司)，0.06％g/mL BSA(购于美国Sigma公司)，0.1％(v/v)Tween-20(购于美国Sigma公司)，0.06M pH8.9Tricine(购于德国Merck公司)，
通用引物SEQ ID NO：1～2或SEQ ID NO：3～4，由上海英俊生物科技有限公司合成。
MgCl2：购于美国Sigma公司，
0.2mM dNTPs：购于上海鼎国生物技术有限公司，
2U/μLTaq DNA聚合酶：购自美国Fermentas公司。
(3)单链纯化试剂：
75％(v/v)乙醇溶液：购于杭州长征化学试剂有限公司，
0.2M NaOH：购于上海试四赫维化工有限公司，
10mM Tris-Acetate(pH 7.6)：Tris-base购于美国Sigma公司，无水乙酸购于杭州化学试剂有限公司，
结合缓冲液：由10mM Tris-HCl(Tris-base购于美国Sigma公司，盐酸购于杭州化学试剂有限公司)，2M NaCl(购于上海试四赫维化工有限公司)，1mM EDTA(购于杭州化学试剂有限公司)，0.1％(v/v)Tween 20(购于美国Sigma公司)组成，
退火缓冲液：由20mM Tris-Acetate(pH 7.6)(Tris-base购于美国Sigma公司，无水乙酸购于杭州化学试剂有限公司)，2mM醋酸镁(购于上海试四赫维化工有限公司)组成。
亲和素标记的磁珠(购于GE healthcare Bioscience AB)。
(4)测序试剂：
DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶：购于QIAGEN公司，
底物APS和荧光素：购于QIAGEN公司，
四种dNTP(dATP S，dTTP，dCTP，dGTP)：购于QIAGEN公司。
实施例2：检测方法。
仪器：Bio-Rad S1000PCR仪，Beckman Microfuge 22R台式微量冷冻离心机，北京六一琼脂糖凝胶电泳仪、上海培清凝胶成像系统，QIAGEN PyroMark Q96ID测序仪。
(1)提取细菌DNA，具体包括如下步骤：
(1a)加300uL Buffer L1到1.5mL离心管中。
(1b)加入400uL全血，盖上管盖，漩涡震荡30秒。
(1c)加入300uL Buffer L2，剧烈摇晃离心管3-5次，再漩涡震荡30秒混匀。
(1d)13000rpm离心2分钟。
(1e)将步骤(1d)中的上清液倒入到核酸纯化柱中，盖上管盖，12000rpm离心30秒。
(1f)弃2mL离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2mL离心管中，在核酸纯化柱中加入500uL Buffer WA，盖上管盖，12000rpm离心30秒。
(1g)弃2mL离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回2mL离心管中，在核酸纯化柱中加入600uL Buffer WB，盖上管盖，12000rpm离心30秒。
(1h)弃2mL离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2mL离心管中，14000rpm离心1分钟。
(1i)弃2ml离心管，将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5mL离心管中，在纯化柱中加入100uL 56℃温育的Buffer TE，盖上管盖，室温静置1分钟，12000rpm离心30秒。
(1j)弃纯化柱，洗脱的DNA作为PCR模板。
(2)以步骤(1)所得DNA为模板，利用通用引物进行细菌16S rRNA的V1可变区的PCR扩增；
其中，所述的PCR扩增体系为：10×PCR buffer 5μL，SEQ ID NO：10.3μL，SEQ IDNO：20.3μL，Template DNA 3μl，0.2mM dNTPs，2mM MgCl2，Taq DNA聚合酶2U，加无菌水至50μL；PCR扩增条件为：94℃3min；28个循环(94℃25s，42℃30s，72℃20s)；72℃3min；或者将SEQ ID NO：3替换上述SEQ ID NO：1，同时将SEQ ID NO：4替换上述SEQ ID NO：2，其它PCR扩增体系和条件相同。
(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化：
●在使用前，保证所有溶液都达到室温；
●在PSQ 96板中加入45μl annealing buffer，然后每孔加入SEQ ID NO：2测序引物(10uM)0.5uL；
●使用Vertex混匀Sepharose beads，将需要使用的sepharoe beads总量(每样本3μL)转移到一个Eppendorf管中，在sepharose bead中加入binding buffer，使得平均每个样品约有50μL的体积，将混合物混匀；
●将以上混合物加入PCR产物(50μL反应体积)中，每样本50μL，将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得beads与生物素结合；
●在Vacuum prep workstation中，四个样品板中依次加入180mL高纯水、70％乙醇、washing buffer和120ml Denaturation buffer；
●打开vacuum prep workstation的泵，将vacuum prep tool在高纯水中清洗30秒，然后将vacuum prep tool移到PCR板中，抓取sepharose beads，将vacuum prep tool放入70％乙醇中5秒，然后移到denatureationbuffer中5秒，再移到washing buffer中清洗10秒，把吸头放在相应含有测序引物的板孔的上方，不要接触液面，关掉泵，将vacuum prep tool放入含有测序引物的板中，摇动，释放sepharose beads；
●使用高纯水清洗vacuum prep tool。
将放有样品的PSQ 96板放在ThermoPlate上加热到80℃2分钟，再冷却到室温后放入测序仪中。
(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序；
(5)测序结果与美国国家生物信息技术中心(NCBI)数据库比对判断细菌种属。
将本发明方法用于8例临床血培养阳性标本的鉴定，测序图如图1-8所示。本发明方法鉴定结果与经微生物培养、致病菌分纯后用法国生物梅里埃的微生物鉴定系统做比对，结果一致。