一种无标签结核杆菌融合蛋白ESAT6-RpfE及其制备方法和应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102190733 A (43)申请公布日 2011.09.21 CN 102190733 A *CN102190733A* (21)申请号 201110068819.8 (22)申请日 2011.03.22 C07K 19/00(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 1/21(2006.01) A61K 39/04(2006.01) A61P 31/06(2006.01) (71)申请人 兰州大学 地址 730000 甘肃省兰州市天水南路 222 号 (72)发明人 祝秉东 李志 达泽蛟 章国平 。

2、张颖 王秉祥 胡丽娜 (74)专利代理机构 北京中恒高博知识产权代理 有限公司 11249 代理人 夏晏平 (54) 发明名称 一种无标签结核杆菌融合蛋白 ESAT6-RpfE 及其制备方法和应用 (57) 摘要 本发明公开了一种无标签结核杆菌融合蛋白 ESAT6-RpfE， 是序列表中序列 2 的蛋白质， 并提供 了其制备方法和制备疫苗的应用。本发明选用的 结核分枝杆菌早期分泌蛋白 ESAT6， 是抗结核免 疫反应的主要配体， 有较强的免疫原性和免疫反 应性。RPF 是一种细菌复活生长因子， 以自分泌或 旁分泌的形式促进休眠菌的复苏和生长， 也是细 菌生长真正必需的分泌蛋白之一。RPF 蛋白。

3、是迄 今为止发现的第 1 个能使休眠的细菌恢复生长繁 殖能力的分泌型蛋白， 是宿主免疫系统识别的靶 抗原， 能引起较强的免疫应答， 刺激宿主机体产生 的特异性抗体， 能阻断 RPF 蛋白对 MTB 的作用， 阻 止MTB在体内的复苏和复发， 因此RPF蛋白可能是 预防和控制 MTB 感染的一种新型途径。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 4 页 附图 1 页 CN 102190736 A1/1 页 2 1. 一种无标签结核杆菌融合蛋白 ESAT6-RpfE， 是序列表中序列 2 的蛋白质。 2. 权利。

4、要求 1 所述的无标签结核杆菌融合蛋白 ESAT6-RpfE 的编码基因。 3. 如权利要求 2 所述的基因， 其特征在于 ： 所述融合蛋白 ESAT6-RpfE 的编码基因， 是 如下 1) 或 2) 的基因 ： a) 其核苷酸序列是序列表中的序列 1 ； b)在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且编码所述融合蛋白ESAT6-RpfE的DNA分 子。 4.含有权利要求2或3所述融合蛋白ESAT6-RpfE的编码基因的重组表达载体， 所述重 组表达载体为 PET30a 质粒。 5. 含有权利要求 4 所述重组表达载体的宿主细胞， 所述宿主细胞为大肠杆菌 BL21。 6. 一种如权利要求 1 。

5、所述的结核杆菌融合蛋白 ESAT6-RpfE 的制备方法， 其特征在于 ： 包括有以下步骤 ： 1) 获得如权利要求 2 所述的结核杆菌融合蛋白 ESAT6-RpfE 的编码基因 ； 2) 将步骤 1) 得到的结核杆菌融合蛋白 ESAT6-RpfE 的编码基因导入重组表达载体 ； 3) 将步骤 2) 载体导入宿主细胞 ； 4) 培养步骤 3) 得到的宿主细胞 ； 5) 将步骤 4) 得到的宿主细胞进行处理得到如权利要求 2 所述的结核杆菌融合蛋白 ESAT6-RpfE 并纯化和表达。 7. 如权利要求 6 所述的制备方法， 其特征在于 ： 所述编码基因为序列 1 所示的核苷酸 序列 ； 所述重。

6、组表达载体为 PET30a 质粒 ； 所述宿主细胞为大肠杆菌 BL21。 8. 一种如权利要求 1 所述的结核杆菌融合蛋白 ESAT6-RpfE 在制备抗结核的候选疫苗 中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102190733 A CN 102190736 A1/4 页 3 一种无标签结核杆菌融合蛋白 ESAT6-RpfE 及其制备方法 和应用 技术领域 0001 本发明涉及一种结核杆菌融合蛋白 ESAT6-RpfE 和其制备方法， 以及其在制备结 核亚单位疫苗中的应用。 背景技术 0002 结核病是长期危害人类健康的严重疾病之一。全世界仍有近 1/3 的人感染过结核 分枝杆菌。大约有 5的结。

7、核感染者在 2-5 年内会发展为肺结核病人 ； 其余的有可能会形 成结核病的潜伏感染者。我国是结核病高负担的国家之一， 每年约有 13 万人因结核病而死 亡。目前， 卡介苗 BCG 的接种是有效预防结核病的重要措施。然而， 不同研究显示， BCG 在 不同人群中的保护性不稳定， 尤其是对成人肺结核的保护效率介于0-80不等。 因此， 研制 和开发全面高效的抗结核疫苗是控制结核病的重要途径。可供研究的抗结核疫苗有 ： 亚单 位疫苗， 重组 BCG， 减毒的 MTB 活疫苗。而亚单位疫苗又包括蛋白疫苗， DNA 疫苗和以病毒为 载体的疫苗 ； 其中的蛋白疫苗具有成分明确， 使用安全等优点， 相对易。

8、于被人们接受。 0003 利用基因工程技术将具有优势的不同的单个结核保护性抗原进行重组， 从而构建 成融合蛋白。大量研究表明， 与单个抗原相比， 融合抗原的免疫原性会增强， 显示出更好的 保护效果 ； 因此受到国内外研究的重视。 0004 然而在以往的研究中， 为了后期简便的纯化方法， 往往构建成带有各种标签 ( 如 HisTag， GSTTag， STag 等 ) 形式的融合蛋白， 却未考虑这种融合蛋白所带有的标签是 否会影响到动物实验以及更进一步的临床学试验的认可。 发明内容 0005 本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷， 提供了一种无标签结核杆菌融合 蛋白 ESAT6-RpfE， 。

9、是序列表中序列 2 的蛋白质。 0006 本发明的另一个目的是提供一种上述无标签结核杆菌融合蛋白 ESAT6-RpfE 的编 码基因。 0007 所述融合蛋白 ESAT6-RpfE 的编码基因， 是如下 1) 或 2) 的基因 ： 0008 a) 其核苷酸序列是序列表中的序列 1 ； 0009 b) 在严格条件下与 a) 限定的 DNA 序列杂交且编码所述融合蛋白 ESAT6-RpfE 的 DNA 分子。 0010 含有上述融合蛋白 ESAT6-RpfE 的编码基因的重组表达载体， 所述重组表达载体 为 PET30a 质粒。 0011 含有上述重组表达载体的宿主细胞， 所述宿主细胞为大肠杆菌 。

10、BL21。 0012 本发明的第三个目的是提供一种上述无标签结核杆菌融合蛋白 ESAT6-RpfE 的制 备方法， 包括有以下步骤 ： 0013 1) 获得上述结核杆菌融合蛋白 ESAT6-RpfE 的编码基因 ； 说 明 书 CN 102190733 A CN 102190736 A2/4 页 4 0014 2) 将步骤 1) 得到的结核杆菌融合蛋白 ESAT6-RpfE 的编码基因导入重组表达载 体 ； 0015 3) 将步骤 2) 载体导入宿主细胞 ； 0016 4) 培养步骤 3) 得到的宿主细胞 ； 0017 5)将步骤4)得到的宿主细胞进行处理得到上述结核杆菌融合蛋白ESAT6-R。

11、pfE并 纯化和表达。 0018 所述编码基因为序列 1 所示的核苷酸序列 ； 所述重组表达载体为 PET30a 质粒 ； 所 述宿主细胞为大肠杆菌 BL21。 0019 本发明的第四个目的是提供一种上述无标签结核杆菌融合蛋白 ESAT6-RpfE 在制 备抗结核的候选疫苗中的应用。 0020 本发明选用的结核分枝杆菌早期分泌蛋白 ESAT6， 其具有多个 T 细胞、 B 细胞表 位， 是抗结核免疫反应的主要配体， 有较强的免疫原性和免疫反应性。ESAT6 能成为检测 MTB 抗体的特异性抗原， 其优势是能区分 MTB 自然感染和 BCG 接种以及非致病性分枝杆菌 感染后产生的抗体。另外 RP。

12、F(Resuscitation Promoting Factor) 是一种细菌复活生长因 子， 以自分泌或旁分泌的形式促进休眠菌的复苏和生长， 也是细菌生长真正必需的分泌蛋 白之一 . 结核分枝杆菌 H37 Rv 株的基因 Rv0867c(RpfA)、 Rv1009(RpfB)、 Rv1884c(RpfC) Rv2389c(RpfD)、 Rv2450c(Rpf E) 均编码具有同源性的 RPF 样蛋白， RPF 蛋白是迄今为止发 现的第 1 个能使休眠的细菌恢复生长繁殖能力的分泌型蛋白， 是宿主免疫系统识别的靶抗 原， 能引起较强的免疫应答， 刺激宿主机体产生的特异性抗体， 能阻断 RPF 蛋。

13、白对 MTB 的作 用， 阻止 MTB 在体内的复苏和复发， 因此 RPF 蛋白可能是预防和控制 MTB 感染的一种新型途 径。 0021 基于以上的研究背景情况， 本发明利用基因工程技术， 克隆构建了无任何标签的 结核分枝杆菌融合蛋白 ESAT6-RpfE， 并且进行了表达和纯化， 以期望成为抗结核的候选疫 苗。 附图说明 0022 图 1 为结核分枝杆菌基因 RpfE 体外扩增。 0023 图 2 为重组质粒 pET30a-ESAT6 的 PCR 鉴定。 0024 图 3 为重组质粒 pET30a-ESAT6 与基因 RpfE 的连接。 0025 其中 1 ： 未酶切的质粒 pET30a-。

14、ESAT6 ； 2 ： 双酶切以及纯化的质粒 pET30a-ESAT6 ； 3 ： 双酶切以及纯化的基因 RpfE。 0026 图 4 为融合基因 ESAT6-RpfE 的表达结果。 0027 其 中， 1 ： Marker ； 2 ： BL21 空 菌 上 清 ； 3 ： ESAT6-RpfE 上 清 4 ： BL21 空 菌 沉 淀 ； 5 ： ESAT6-RpfE 沉淀。 0028 图 5 为结核分枝杆菌融合蛋白 ESAT6-RpfE 最终的纯化结果。 0029 其中， 1 ： Marker ； 2 ： 最终纯化的 ESAT6-RpfE。 具体实施方式 0030 材料 ： 说 明 书 C。

15、N 102190733 A CN 102190736 A3/4 页 5 0031 1、 引物 ： ESAT6 上游引物 (Es)、 ESAT6 下游引物 (Ea)、 RpfE 上游引物 (Rs)、 RpfE 下 游引物 (Ra)。 0032 ESAT6 上游引物 (Es)CGGCATATGACAGAGCAGCAGTGGAAT ； 0033 ESAT6 下游引物 (Ea)TTGGAATTCTGCGAACATCCCAGTGAC ； 0034 RpfE 上游引物 (Rs)CGGGAATTCATGGACGACGCGGGCTTGGA ； 0035 RpfE 下游引物 (Ra)ATAAAGCTTTCAGC。

16、CGCGGCGGCCGCAGA。 0036 2、 引物由上海生物生工工程有限公司合成 ； 结核分枝杆菌株 H37Rv 及临床耐药株 来自甘肃省疾病控制中心 ； 质粒 pET30a、 E.coli DH5 与 BL21(DE3) 由复旦大学王洪海教 授惠赠 ； 、 0.45um 滤器购买于 Beyotime Biotechnoly， lot ROKA590211、 尿素购买于 Bio Basic INC， UB0148 试剂均购自兰州市鹏程生物有限公司 ； IPTG 购自兰州市鹏程生物有限 公司 Merck420332。 0037 3、 下列试剂的配方 ： 0038 50g/ml 卡那霉素 ： 。

17、取 5mg 的卡那霉素粉末溶于 100ml 双蒸水中， 0.22um 滤器过 滤后使用。 0039 LB 液体培养基 ： 取 1g 胰蛋白胨， 0.5g 酵母提取物， 1g 氯化钠加水定容至 100ml， 121 度， 高压 20min。 0040 20mM PB(pH7.4) 配制方法 ： 配制时， 先配制 0.2mol/L 的 NaH2PO4和 0.2mol/L 的 Na2HPO4， 两者按 19 81 的比例混合即成 0.2mol/L 的磷酸盐缓冲液 (PB)。 0041 PBS 缓冲液 ： 称取 0.29g 磷酸氢二钠， 0.02g 磷酸二氢钾， 0.02g 氯化钾， 0.8g 氯化 。

18、钠， 加水溶解定容至 100ml。 0042 4、 酶的来源 ： 0043 T4DNA连接酶购买于Fermentas， #EL10014， lot 0042595、 限制性内切酶EcoR I购 买于 Fermentas， #ER0271， lot00031477。 0044 HindIII 购买于 Fermentas， #ER0507 lot 00017410。 0045 Nde I 购买于 Fermentas， #ER0585， lot 00025089。 0046 5、 弱阴离子交换柱 DEAE 购买于 GE healthcare， 17-6002-33， lot100299 ； HiC 。

19、Octylg 柱购买于 GE healthcare， 28-4110-07， lot 10034003。 0047 实施例 1 0048 一、 重组质粒 pET30a-ESAT6-RpfE 的克隆构建 ； 0049 1、 根据 GenBank 中 H37Rv 中的 ESAT6 和 RpfE 的基因序列， 设计 4 对引物， 分别为 ESAT6 上游引物 (Es) 含酶切位点 Nde I 及起始密码子 ； ESAT6 下游引物 (Ea) 含酶切位点 EcoR I ； RpfE 上游引物 (Rs) 含酶切位点 EcoR I ； RpfE 下游引物 (Ra) 含酶切位点 HindIII 及终止密码子。

20、。以 H37Rv 的 DNA 为模板， PCR 扩增 285bp 的 ESAT6 基因 ； 临床耐药株为模板， PCR 扩增 436bp 的 RpfE 基因 ( 见图 1)。ESAT6 基因的 PCR 为 98变性 10s， 60退火 15s， 72聚合 30s， 共 30 个循环。RpfE 基因的 PCR 均为 98变性 15s， 63退火 15s， 72聚合 50s， 共 35 个循环。 0050 2、 Nde I、 EcoR I 双酶切并纯化后的 ESAT6 基因和质粒 pET30a， 在 T4 连接酶的作 用下将两者进行连接， 转化入 E.Coli DH5 中。PCR 验证筛选阳性克隆。

21、进行测序鉴定 ( 北 京华大基因科技完成测序 ) 见图 2。即保存菌种为 pET30a-ESAT6(DH5)。 说 明 书 CN 102190733 A CN 102190736 A4/4 页 6 0051 3、 提取以上鉴定正确的重组质粒 pET30a-ESAT6。EcoR I 和 HindIII 双酶切 RpfE 基因和重组质粒 pET30a-ESAT6， 分别纯化后用 T4 连接酶进行连接， 转化入 E.Coli DH5。 PCR 验证筛选阳性克隆进行测序鉴定 ( 北京华大基因科技完成测序 )( 见图 4)。即保存菌 种为 pET30a-ESAT6-RpfE(DH5)。 0052 二、 。

22、融合基因 ESAT6-RpfE 的诱导表达 ； 0053 1、 从以上 E.Coli pET30a-ESAT6-RpfE(DH5) 提取重组质粒 pET30a-ESAT6-RpfE， 转化入 E.Coli BL21(DE3) 中， PCR 验证筛选阳性克隆进行测序鉴定 ( 北京华大基因科技完成测序 )。即为保存菌种为 pET30a-ESAT6-RpfE(BL21)。 0054 2、 将菌种 pET30a-ESAT6-RpfE(BL21) 接种于含有 50g/ml 卡那霉素的 LB 液体培 养基， 37振荡培养约 3 小时， 至 A600 值为 0.6 0.8， 加入 IPTG 至终浓度为 0.。

23、5mmol/L， 37诱导表达 6 8h， 收集菌体。 0055 3、 上述菌体重悬于 20mM PB 缓冲液中， 冰浴下超声破碎 40min 左右至液体澄清， 4， 10000rpm 离心 20min 后， 将上清和沉淀分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE 凝胶 电泳 )。 0056 4、 经 SDS-PAGE 分析， 与 BL21 空菌相比， 有明显的特异蛋白表达条带， 以包涵体形 式表达为主， 上清中蛋白很少 ( 见图 5)。 0057 三、 融合蛋白 ESAT6-RpfE 的纯化步骤 ； 0058 1、 配制以下缓冲液 ： I液20mM PB(pH7.4) ； II液20mM。

24、 PB+1M NaCl(pH7.4) ； III液 20mM PB+2M NaCl(pH7.4). 0059 2、 大量表达融合蛋白 ESAT6-RpfE， 收集的菌体重悬于 20mM PB 缓冲液中， 冰浴下 超声破碎 1h 左右， 4， 10000rpm 离心 20min 离心后收集沉淀， 8M 尿素溶解。 0060 3、 预先处理透析袋， 配制复性液 6M 尿素， 4M 尿素， 2M 尿素， 1M 尿素， 0M 尿素各 5000ml， 4下进行梯度透析复性。 0061 4、 用 0.45um 滤器过滤复性后的蛋白， 并测定蛋白浓度 (mg/ml)， 根据所选层析柱 的载量， 计算确定蛋白。

25、的上样量。 0062 5、 第一步纯化 ： 离子交换层析。选用弱阴离子交换柱 DEAE 进行纯化， 收集不同梯 度洗脱液进行 SDS-PAGE 分析得初步纯化物。 0063 6、 第二步纯化 ： 疏水层析。经过离子交换层析初步纯化后的蛋白， 加入等体积 的 III 液， 使蛋白含高盐上柱。选用 HiC Octyl 柱进行纯化， 收集不同梯度洗脱液进行 SDS-PAGE 分析得最终纯化物。 0064 7、 将最终得到的蛋白纯化物， 在 PBS 溶液中进行透析后即可用。 说 明 书 CN 102190733 A CN 102190736 A1/4 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 102190733 A CN 102190736 A2/4 页 8 0003 序 列 表 CN 102190733 A CN 102190736 A3/4 页 9 0004 序 列 表 CN 102190733 A CN 102190736 A4/4 页 10 序 列 表 CN 102190733 A CN 102190736 A1/1 页 11 图 1 图 2 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102190733 A 。