技术领域
本发明属于微生物检验领域，具体涉及一种基于环介导的等温扩增(LAMP)技术原理而开发的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌及单核细胞增生李斯特菌核酸筛查方法。
背景技术
目前金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌及单核细胞增生李斯特菌的检测方法主要是微生物培养鉴定及多重PCR检测技术。(1)细菌培养，结果可信度高，并能做细菌药敏试验，但需时过长，应用受到限制，同时由于金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌及单核细胞增生李斯特菌等危害性大，对实验室安全要求较高，不利于上述细菌的普遍筛查。(2)聚合酶链反应(PCR)，特异性较差，优点是敏感度可达98％～100％.，但是其需要PCR扩增仪、凝胶电泳等相关贵重设备，不利于基层医疗防疫机构及现场快速测定。
21世纪初，Notomi T等开发了一种新颖的恒温核酸扩增理论，即所谓的环介导恒温扩增法(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)，其特点是针对靶基因的8/6个区域设计6/4种特异引物，利用一种链置换Bst DNA聚合酶在恒温条件(65℃左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应，短时间扩增效率可达到109-1010个拷贝。直接靠扩增产物电泳或显色反应进行判断是否发生反应。该方法不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程，LAMP法具有高特异性、高效性、快速、廉价(不需要特定的贵重检测设备，只需要简单结构的恒温箱)、易检测(直接进行目测判断)等特点。
发明内容
本发明的目的是提供一种应用于金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌及单核细胞增生李斯特菌的核酸检测方法，一是填补在金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌及单核细胞增生李斯特菌LAMP(环介导恒温扩增法)检测技术方面的空白，使在金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌及单核细胞增生李斯特菌的检测技术方法达到国际先进水平；二是检测能力进一步提高，LAMP检测技术的检测限高于常规检测法100-200倍，这样就有力地克服了传统的的微生物培养鉴定方法检出率较底的问题；三是由于经典聚合酶链反应(PCR)扩增技术对仪器设备要求较高(如PCR扩增仪，琼脂凝胶电泳系统等)、技术较为复杂，不利于其在基层医疗防疫、检验检疫机构的普遍应用，而LAMP检测技术具有仪器设备要求检测(只需要简单结构的恒温箱)、检测时间短(0.5-1.0小时)、特异性高(针对靶基因的8/6个区域设计6/4种特异引物，)等特点，可以使用基因扩增技术在基层医疗防疫机构及现场监测中广泛使用。
本发明是以如下技术方案实现的：一种应用于筛查金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌及单核细胞增生李斯特菌核酸的检测方法，利用环介导等温扩增(LAMP)技术来进行，利用LAMP技术平台通过使用特异性引物扩增靶基因的特定区域(分别针对金黄色葡萄球菌clfA基因(Genebank登录号为EF207779)，沙门氏菌invA基因(Genebank登录号为M90846)，志贺氏菌ipaH基因(Genebank登录号为M76444)，单增李斯特的hly基因(GeneBank登录号为M24199))，在阳性和阴性质控和内对照检测体系的辅助下，从分子水平对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌及单核细胞增生李斯特菌进行核酸筛查或检测。
进一步地，在本发明所述的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌及单核细胞增生李斯特菌核酸的筛查检测方法中，在LAMP筛查过程中引入了阴阳性对照检测系统。阳性对照质控品为相同于扩增靶基因的DNA，阴性对照质控品为不相同于扩增靶基因的DNA，并使用电泳分析或PicoGreen荧光染料显色法同时检测内对照和金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌及单核细胞增生李斯特菌靶基因扩增产物。
进一步地，在本发明所述的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌及单核细胞增生李斯特菌核酸检测方法中，针对金黄色葡萄球菌clfA基因(Genebank登录号为EF207779)，沙门氏菌invA基因(Genebank登录号为M90846)，志贺氏菌ipaH基因(Genebank登录号为M76444)，单增李斯特的hly基因(GeneBank登录号为M24199)分别设计环介导等温扩增引物。
进一步地，在本发明所述的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌及单核细胞增生李斯特菌核酸检测方法中，其特征在于，所用的LAMP反应体系是一系列通过优化的反应成分组成，并具有特定反应程序。
本发明具有严格的鉴别筛查诊断体系，以保证检测结果的准确性。该鉴别筛查诊断系统由阳性和阴性质控品，内对照质控品以及相关扩增和检测体系组成。
本发明中鉴别筛查诊断系统的阳性和阴性质控品是每批实验检测结果是否有效的重要标志。对于每批实验，必须引入一个阴性质控品的检测，以保证反应体系不会出现假阳性结果；对于每批实验，必须引入一个金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌及单核细胞增生李斯特菌阳性质控品的检测，以保证反应体系不会出现假阴性反应。针对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌及单核细胞增生李斯特菌的阳性质控品是人工构建的上述细菌待检靶序列的质粒DNA。
本发明鉴别诊断系统中的特异性扩增产物均由发明人设计，通过核酸合成设备制备。核酸合成设备可选用不同厂家，不同型号的产品，也可委托相关的基因公司合成。所有引物按照LAMP引物设计原则，利用ICBgyrB数据库及RIDOM数据库寻找金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌及单核细胞增生李斯特菌的LAMP基因序列，利用软件选取其特异性序列，利用PrimerExplorerIV软件进行进一步分析，设计4套引物，分别针对上述4种细菌。本发明鉴别诊断系统中的LAMP体系及反应程序均由发明人设计。金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌及单核细胞增生李斯特菌的核酸特异性引物序列、LAMP反应体系及反应程序如下：
一、环介导等温扩增引物
表1 金黄色葡萄球菌clfA基因LAMP检测引物
(GeneBank EF207779)的LAMP反应引物序列组成
表2 沙门氏菌invA基因LAMP检测引物
(GeneBank M90846)的LAMP反应引物序列组成
表3 志贺氏菌ipaH基因LAMP检测引物
6
(GeneBank M76444)的LAMP反应引物序列组成
表4 单增李斯特的hly基因LAMP检测引物
(GeneBank M24199)的LAMP反应引物序列组成
二、本发明包括的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌及单核细胞增生李斯特菌的LAMP反应体系组成如下：
10×Bst buffer(200mM Tris-HCl(pH8.8，25℃)，100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，20mMMgSO4，0.1％Triton-100)2.5μl；Betaine(4M)5μl；引物(F3∶B3∶FIP∶BIP＝5μM∶5μM∶40μM∶40μM)1μl；Bst酶(8U)1μl；dNTPs(10mM)3.5μl；MgCl2(25mM)6μl；模板1μl；灭菌去离子水4μl。。
三、扩增程序：65℃1小时→80℃10分钟→10℃保存；
四、反应终点检测方法：反应结束后，加入1μL Pico Green染料，混匀，观察反应管是否颜色发生变化或取5μL上述细菌LAMP反应产物，于2％琼脂糖凝胶上进行电泳检测。观察是否有梯状条带产生。
本发明的有益效果是：方法简便、经济、快速、灵敏。
附图说明
图1是金黄色葡萄球菌LAMP反应产物染料染色图；
图中：1、阳性质粒pGEM-T-clfA；2、金黄色葡萄球基因组DNA；3、阴性对照。
图2是沙门氏菌(invA基因)LAMP检测染料染色图；
图中：1：阳性对照pGEM-T-invA，2：沙门氏菌基因组DNA，3：阴性对照。
图3是单增李斯特菌(hly基因)LAMP扩增产物凝胶电泳图；
图中：M：DL2000；1：阳性质粒pGEM-T-hly；2：单增李斯特菌基因组DNA；3：阴性对照。
图4是志贺氏菌LAMP反应产物染料染色图；
图中：1、阳性质粒pGEM-T-ipaH；2、痢疾志贺氏菌48097；3、福氏志贺氏菌51302；4、鲍氏志贺氏菌51149；5、宋氏志贺氏菌51334；6、阴性对照。
具体实施方式
实施例
(1)核酸提取：从37℃摇床培养10小时的菌悬液中吸取1ml菌液，10000rpm离心5min，弃上清，加100μl无菌水震荡摇匀(或是从4℃冰箱中保存的平板上挑取2-3个菌落于100μl无菌水中)。100℃煮沸10min，用台式离心机以10000rpm离心5min，上清液为基因组DNA，可直接作为核酸扩增反应的模板。
(2)LAMP反应：准备上述反应体系，将反应体系混匀，分装到0.2ml的PCR反应管中，每管19ul，PCR反应管中分别加入(1)步骤抽提的模板，每管1ul，阳性对照品和阴性对照品各1ul，分别作阳性对照、阴性对照，混合均匀。放入恒温水浴箱，设定反应条件：65℃，60分钟，80℃10分钟终止反应，10℃保存，反应结束后加入1μL Pico Green染料，混匀，观察反应管是否颜色发生变化或取5μL上述细菌LAMP反应产物，于2％琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
(3)结果判定：细菌阳性基因组DNA模板的反应管可观察到颜色变为绿色，而阴性对照则为橙色。琼脂糖凝胶电泳检测后，细菌阳性基因组DNA模板的反应产物有特异性的梯状条带出现，而阴性对照则无条带出现。
其结果见附图1-图4所示。
序列表
<110>中华人民共和国徐州出入境检验检疫局
<120>基于环介导的等温扩增技术的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌及单核细胞增生李斯特菌核酸筛查方法
<160>4
<170>Primer explorer v4
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>1
TCAACTGAAG CAACACCT 18
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>引物
<400>2
CAGTCGTACC AGAGTCAAT 19
<210>3
<211>46
<212>DNA
<213>引物
<400>3
CGCACTTGTA TTAACCGCTT GATTATCAAA CAATGAATCA GCTCCA 46
<210>4
<211>45
<212>DNA
<213>引物
<400>4
AGAGCATTTA GTTTAGCGGC AGTAGCAACT GTCACATTCG TCAAC 45
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>5
GAACGTGTCG CGGAAGTC’ 18
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>引物
<400>6
CGGCAATAGC GTCACCTT’ 19
<210>7
<211>38
<212>DNA
<213>引物
<400>7
GCGCGGCATC CGCATCAATA TCTGGATGGT ATGCCCGG 38
<210>8
<211>39
<212>DNA
<213>引物
<400>8
GAACGGCGAA GCGTACTGGA CATCGCACCG TCAAAGGAA 39
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>9
CCGGATTCCG TGAACAGG 18
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>10
AGCGCCGGTA TCATTATCGA 20
<210>11
<211>42
<212>DNA
<213>引物
<400>11
AGCAACAGCG AAAGACTGCT GTCTGCATGG CTGGAAAAACTC 42
<210>12
<211>40
<212>DNA
<213>引物
<400>12
GCCACTGAGA GCTGTGAGGA CCTGATGGAC CAGGAGGGTT 40
<210>13
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>13
TAAACTTCGG CGCAATCA 18
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>14
CAAATAAACT TGACGGCCAT 20
<210>15
<211>46
<212>DNA
<213>引物
<400>15
GGAAGGTCTT GTAGGTTCAT TAACAGGAAA ATGCAAGAAG AAGTCA 46
<210>16
<211>44
<212>DNA
<213>引物
<400>16
TCGGCAAAGC TGTTACTAAA GAGCTTGAGA TATATGCAGG AGGA 44