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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310583134.6 (22)申请日 2013.11.19 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104651482 A (43)申请公布日 2015.05.27 (73)专利权人 北京市理化分析测试中心 地址 100089 北京市海淀区西三环北路27 号 (72)发明人 杜美红孙永军刘清珺杨寅 陈婷陈舜琮 (74)专利代理机构 北京润平知识产权代理有限 公司 11283 代理人 李婉婉张苗 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) C12Q。
2、 1/04(2006.01) C12R 1/63(2006.01) 审查员 张蕊 (54)发明名称 一种检测样品中副溶血性弧菌活菌体的方 法 (57)摘要 本发明公开了一种检测样品中副溶血性弧 菌活菌体的方法， 该方法包括：（1） 将能够特异地 与副溶血性弧菌活菌体结合的抗体偶联在磁球 上， 得到免疫磁球； 所述能够特异地与副溶血性 弧菌活菌体结合的抗体不能与死菌体结合；（2） 将免疫磁球与液体形式的待测样品进行混合， 得 到混合后的物料； 混合的条件使得当待测样品中 存在副溶血性弧菌活菌体时， 免疫磁球能够特异 性地吸附副溶血性弧菌活菌体；（3） 将所述混合 后的物料置于分选磁场中以固定免疫。
3、磁球， 并洗 脱未吸附在免疫磁球上的物质， 得到洗脱后的免 疫磁球；（4） 将吸附在免疫磁球上的物质进行提 取DNA的操作， 得到模板样品；（5） 使用针对所述 副溶血性弧菌活菌体的特异性引物对模板样品 进行PCR扩增， 并根据PCR扩增产物中的目的片段 的含量判断待测样品中的副溶血性弧菌活菌体 的含量。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 CN 104651482 B 2016.09.14 CN 104651482 B 1.一种检测样品中副溶血性弧菌活菌体的方法， 该方法包括： (1)将能够特异地与副溶血性弧菌活菌体结合的抗体偶联在磁球上， 得到免疫磁球； 所 述能够特异地与副溶血性弧菌。
4、活菌体结合的抗体不能与死菌体结合且为编号为VP-mab-01 的慧耘生物单克隆抗体， 相对于每毫克的磁球， 所述抗体的用量为0.05-2mg； (2)将免疫磁球与液体形式的待测样品进行混合， 得到混合后的物料； 混合的条件使得 当待测样品中存在副溶血性弧菌活菌体时， 免疫磁球能够特异性地吸附副溶血性弧菌活菌 体， 所述待测样品为食品和/或药品； (3)将所述混合后的物料置于分选磁场中以固定免疫磁球， 并洗脱未吸附在免疫磁球 上的物质， 得到洗脱后的免疫磁球； (4)将吸附在免疫磁球上的物质进行提取DNA的操作， 得到模板样品； (5)使用针对所述副溶血性弧菌活菌体的特异性引物对模板样品进行PC。
5、R扩增， 并根据 PCR扩增产物中的目的片段的含量判断待测样品中的副溶血性弧菌活菌体的含量， PCR扩增 所用的引物为包括如SEQIDNO:1所示的正向引物和如SEQIDNO:2所示的反向引物。 2.根据权利要求1所述的方法， 其中， 相对于每毫升的液体形式的待测样品， 以磁球的 重量计， 所述免疫磁球的用量为10-25 g。 3.根据权利要求1所述的方法， 其中， 步骤(3)中， 洗脱所用的液体为磷酸缓冲液， 所述 磷酸缓冲液含有0.144-0.162mol/L的磷酸氢二钠和0.038-0.056mol/L的磷酸二氢钠。 4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法， 其中， 所述磁球为表面修。
6、饰有氨基或羧基 的超顺磁性Fe3O4聚苯乙烯复合微球。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104651482 B 2 一种检测样品中副溶血性弧菌活菌体的方法 技术领域 0001 本发明涉及生物医药领域， 具体地， 涉及一种检测样品中副溶血性弧菌活菌体的 方法。 背景技术 0002 致病菌 （Pathogenicbacteria)能引起疾病的微生物称为病原微生物或致病菌。 病原微生物包括细菌、 病毒、 螺旋体、 立克次氏体、 衣原体、 支原体、 真菌及放线菌等。 一般所 说的致病菌指的是病原微生物中的细菌。 细菌的致病性与其毒力、 侵入数量及侵入门户有 关。 虽然绝大多数细菌是无害甚至有益的， 。
7、但是相当大一部分可以致病。 条件致病菌只在特 定条件下致病， 如有伤口可以允许细菌进入血液， 或者免疫力降低时。 例如， 金黄色葡萄球 菌和链球菌也是正常菌群， 常可以存在于体表皮肤， 鼻腔而不引起疾病， 但可以潜在引起皮 肤感染， 如肺炎 （pneumonia） ， 脑膜炎 （meningitis） 和败血症 （sepsis)等。 0003 副溶血性弧菌 （VibrioParahemolyticus） 是一种嗜盐性细菌。 副溶血性弧菌食物 中毒， 是进食含有该菌的食物所致， 该菌主要来自海产品， 如墨鱼、 海鱼、 海虾、 海蟹、 海蜇， 以及含盐分较高的腌制食品， 如咸菜、 腌肉等。 该菌存。
8、活能力强， 在抹布和砧板上能生存1个 月以上， 海水中可存活47天。 临床上以急性起病、 腹痛、 呕吐、 腹泻及水样便为主要症状。 本 病多在夏秋季发生于沿海地区， 常造成集体发病。 0004 目前， 检测致病菌的方法只能检测样品中的致病菌的总体数量， 而不能区分样品 中的副溶血性弧菌活菌体和死菌体的数量分别为多少。 发明内容 0005 为了将待测样品中的死菌体数量和副溶血性弧菌活菌体数量区别开来， 本发明提 供了一种检测样品中副溶血性弧菌活菌体的方法， 该方法包括：（1） 将能够特异地与副溶血 性弧菌活菌体结合的抗体偶联在磁球上， 得到免疫磁球； 所述能够特异地与副溶血性弧菌 活菌体结合的抗。
9、体不能与死菌体结合；（2） 将免疫磁球与液体形式的待测样品进行混合， 得 到混合后的物料； 混合的条件使得当待测样品中存在副溶血性弧菌活菌体时， 免疫磁球能 够特异性地吸附副溶血性弧菌活菌体；（3） 将所述混合后的物料置于分选磁场中以固定免 疫磁球， 并洗脱未吸附在免疫磁球上的物质， 得到洗脱后的免疫磁球；（4） 将吸附在免疫磁 球上的物质进行提取DNA的操作， 得到模板样品；（5） 使用针对所述副溶血性弧菌活菌体的 特异性引物对模板样品进行PCR扩增， 并根据PCR扩增产物中的目的片段的含量判断待测样 品中的副溶血性弧菌活菌体的含量 0006 通过上述技术方案， 本发明能够有效地将待测样品中。
10、的死菌体数量和副溶血性弧 菌活菌体数量区别开来。 0007 本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。 具体实施方式 说明书 1/4 页 3 CN 104651482 B 3 0008 以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。 应当理解的是， 此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明， 并不用于限制本发明。 0009 在本发明中， 在未作相反说明的情况下， 使用的术语 “免疫磁球” 是指通过偶联反 应将抗体结合到磁性微球的表面上， 形成的免疫磁性微球。 术语 “PCR” 是指聚合酶链式反 应。 术语 “引物” 包括至少一个上游引物和至少一个下游引物。 本发明中使用的。
11、液体体积均 为20下的数值。 0010 本发明提供了一种检测样品中副溶血性弧菌活菌体的方法， 该方法包括： 0011 （1） 将能够特异地与副溶血性弧菌活菌体结合的抗体偶联在磁球上， 得到免疫磁 球； 所述能够特异地与副溶血性弧菌活菌体结合的抗体不能与死菌体结合； 0012 （2） 将免疫磁球与液体形式的待测样品进行混合， 得到混合后的物料； 混合的条件 使得当待测样品中存在副溶血性弧菌活菌体时， 免疫磁球能够特异性地吸附副溶血性弧菌 活菌体； 0013 （3） 将所述混合后的物料置于分选磁场中以固定免疫磁球， 并洗脱未吸附在免疫 磁球上的物质， 得到洗脱后的免疫磁球； 0014 （4） 将吸。
12、附在免疫磁球上的物质进行提取DNA的操作， 得到模板样品； 0015 （5） 使用针对所述副溶血性弧菌活菌体的特异性引物对模板样品进行PCR扩增， 并 根据PCR扩增产物中的目的片段的含量判断待测样品中的副溶血性弧菌活菌体的含量。 0016 其中， ， 作为本发明特别优选的一种实施方式， 所述能够特异地与副溶血性弧菌活 菌体结合的抗体为编号为VP-mab-01的慧耘生物单克隆抗体， 该抗体可以从慧耘生物公司 商购得到， 商品号为VP-mab-01。 0017 其中， 相对于每毫克的磁球， 所述抗体的用量可以为0.05-2mg。 0018 其中， 相对于每毫升的液体形式的待测样品， 以磁球的重量。
13、计， 所述免疫磁球的用 量可以为10-25 g。 0019 其中， 步骤 （3） 中， 洗脱所用的液体可以为磷酸缓冲液， 所述磷酸缓冲液含有 0.144-0.162mol/L的磷酸氢二钠和0.038-0.056mol/L的磷酸二氢钠。 0020 其中， 作为本发明特别优选的一种实施方式， 对于副溶血性弧菌活菌体， PCR扩增 所用的引物包括如SEQIDNO:1所示的正向引物 （5 -AAGCGGATTATGCAGAAGCA-3 ） 和如SEQ IDNO:2所示的反向引物 （5 -GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3 ） 。 0021 其中， 所述磁球可以为表面修饰有氨基或羧基的。
14、超顺磁性Fe3O4聚苯乙烯复合微 球。 0022 根据本发明的方法， 其中， 待测样品可以为食品和/或药品。 具体地， 可以按照国家 标准GB4789.1-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验总则 中的方法取得待测样品。 0023 以下将通过实施例对本发明进行详细描述。 以下实施例中， 所述磷酸缓冲液为含 有0.153mol/L的磷酸氢二钠和0.047mol/L的磷酸二氢钠的水溶液。 将从慧耘生物公司商购 得到， 商品号为VP-mab-01的抗体作为抗体1。 0024 制备实施例1 0025 本制备实施例1使用抗体1制备本发明的方法所用的免疫磁球。 0026 将通过1-乙基-3-(3-二。
15、甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)活化的表面修饰有羧基的超顺磁性Fe3O4聚苯乙烯复合微球 （购自上海奥润微纳新材 说明书 2/4 页 4 CN 104651482 B 4 料科技有限公司， PM3-020型聚合物磁球， 浓度为10mg/mL， 粒径为180nm， 表面修饰有羧基官 能团） 作为磁球使用， 取2mg磁球， 分散磷酸缓冲溶液中， 分散液中磁球的浓度为2mg/mL。 取 0.2mg特异性抗体 （溶于1mL的磷酸缓冲液中） 与2mg磁球混合， 室温下在摇床(200r/min)中 保持3h， 然后通过磁分离进行清洗， 去除未偶联到磁球表面的特异性抗体。 。
16、接着用浓度为1% （w/v） 的牛血清白蛋白溶液 （溶于磷酸缓冲液） ， 在37下封闭30min， 然后通过磁分离进行 清洗， 洗去多余的牛血清白蛋白溶液， 即得到免疫磁球。 0027 本制备实施例得到使用抗体1制备的免疫磁球1。 0028 实施例1 0029 将副溶血性弧菌(VibrioParahemolyticus) （购自ATCC， 货号17802） 在LB培养基 （胰蛋白胨10g/L， 酵母提取物5g/L， 氯化钠10g/L） 中培养至对数期， 用LB培养基调整菌体浓 度至103个/L， 作为含有副溶血性弧菌活菌体的阳性样品。 0030 将上述阳性样品经过高压灭活 （121， 15mi。
17、n） 后得到不含有副溶血性弧菌活菌 体， 但含有103个/L死菌体的阴性样品。 0031 将阳性样品与阴性样品进行等体积混合， 即得到含有5102个/L的死菌体和5 102个/L的活菌体的混合样品。 0032 分别将1mL的阳性样品、 阴性样品和混合样品与免疫磁球1 （以磁球的重量计， 15mg） 混合， 得到混合后的物料， 在29下孵育30min， 然后在分选磁场中固定免疫磁球， 洗 脱未吸附在免疫磁球上的物质， 得到洗脱后的免疫磁球和洗脱下来的物料。 0033 使用购自天根生化科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒 （DP302） ， 按照其说 明书的操作方法， 对洗脱后的免疫磁球和洗脱。
18、下来的物料分别进行提取DNA的操作， 分别得 到富集在免疫磁珠上的物料中的DNA样品和富集剩余的物料中的DNA样品， 将它们作为模板 样品。 使用如SEQIDNO:1所示的正向引物 （5 -AAGCGGATTATGCAGAAGCA-3 ） 和如SEQID NO:2所示的反向引物 （5 -GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3 ） 对模板样品进行PCR扩增 （实时 定量PCR， 使用外参校正Ct值） ， 结果如表1所示。 0034 按照GB/T4789.7-2008中规定的方法 （食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检 验） ， 分别对在免疫磁珠上的物料和富集剩余的物料进行平板计数法的。
19、活菌体数目检测， 结 果如表1所示。 0035 表1 0036 0037 根据表1的数据可见， PCR定量信号值与平板计数法得到的活菌体数目的变化完全 一致。 0038 通过实施例1中表1的结果可见， 本发明能够有效地将待测样品中副溶血性弧菌的 说明书 3/4 页 5 CN 104651482 B 5 死菌体数量和活菌体数量区别开来， 由于本发明的方法不需要对待测样品进行菌体培养， 从而大大加速和简化了样品中的致病菌的检测。 0039 以上详细描述了本发明的优选实施方式， 但是， 本发明并不限于上述实施方式中 的具体细节， 在本发明的技术构思范围内， 可以对本发明的技术方案进行多种简单变型， 这 些简单变型均属于本发明的保护范围。 0040 另外需要说明的是， 在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征， 在不矛 盾的情况下， 可以通过任何合适的方式进行组合， 为了避免不必要的重复， 本发明对各种可 能的组合方式不再另行说明。 0041 此外， 本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合， 只要其不违背本 发明的思想， 其同样应当视为本发明所公开的内容。 说明书 4/4 页 6 CN 104651482 B 6 0001 序列表 1/1 页 7 CN 104651482 B 7 。