一种微量动物细胞基因组DNA模板制备液及相应的DNA模板制备方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101948828 B (45)授权公告日 2011.08.17 CN 101948828 B *CN101948828B* (21)申请号 201010507070.8 (22)申请日 2010.10.14 C12N 15/10(2006.01) (73)专利权人 江苏省农业科学院 地址 210014 江苏省南京市玄武区钟灵街 50 号 (72)发明人 邢光东 夏银 王根林 (74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 代理人 徐冬涛 CN 101532011 A,2009.09.16, 全文 . WO 03035679 A,2003.05.01。

2、, 全文 . 叶冰莹 . 阔叶榧总 DNA 的提取及其 RAPD 反 应条件的研究 .厦门大学学报 .2002, 第 41 卷 ( 第 5 期 ),683-686. (54) 发明名称 一种微量动物细胞基因组 DNA 模板制备液及 相应的 DNA 模板制备方法 (57) 摘要 本发明属于分子生物学领域， 公开了一种微 量动物细胞基因组 DNA 模板制备液及相应的 DNA 模板制备方法。微量动物细胞基因组 DNA 模板制 备液由 A 液和 B 液以 1:3-10 的体积比混合制得， A 液为 Tris、 (NH4)2SO4、 MgCl2的混合溶液， 三种试 剂终浓度分别为 0.1-2.0M ； 。

3、所述的 B 液为 Triton 和 - 琉基乙醇的混合溶液， 二种试剂终浓度分 别为 0.1-2.0%。本发明微量动物细胞基因组 DNA 模板制备液成本较之现有的基因组 DNA 提取所需 试剂的提取成本大幅降低 ； 由于模板制备过程简 单， 所制备的基因组 DNA 模板完整， 没有耗损， 可 确保细胞基因组 DNA 模板制备的一次性成功。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李振鹏 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 2 页 附图 1 页 CN 101948828 B1/1 页 2 1. 一种微量动物细胞基因组 DN。

4、A 模板制备液， 其特征在于该制备液由 A 液和 B 液以 1 3-10 的体积比混合制得， 其中所述的 A 液为 Tris、 (NH4)2SO4、 MgCl2的混合溶液， 三种试 剂终浓度均为 0.1-2.0M ； 所述的 B 液为 Triton 和 - 琉基乙醇的混合溶液， 二种试剂终浓 度均为 0.1-2.0。 2. 一种 DNA 模板制备方法， 其特征在于依次包括如下步骤 ： (1)取权利要求1所述的微量动物细胞基因组DNA模板制备液， 加入装有微量动物细胞 的离心管或 PCR 管中 ； (2)将装有所述DNA模板制备液和动物细胞的离心管或PCR管于95保温5分钟， 16 保温 5 分。

5、钟 ； (3) 加入蛋白酶 K 溶液， 使该蛋白酶 K 终浓度为 1.0-3.0mg/ml ； (4)55保温 2 小时或以上， 95保温 10 分钟， 16保温 5 分钟 ； (5) 离心取上清， 此上清液直接用作 PCR 的 DNA 模板。 3. 根据权利要求 2 所述的 DNA 模板制备方法， 依次包括如下步骤 ： (1) 取权利要求 1 所述的微量动物细胞基因组 DNA 模板制备液 8.8l， 加入装有微量 动物细胞的离心管或 PCR 管中 ； (2)将装有所述DNA模板制备液和动物细胞的离心管或PCR管于95保温5分钟， 16 保温 5 分钟 ； (3)加入浓度为10mg/ml蛋白酶。

6、K溶液1.2l， 使该蛋白酶K终浓度为1.2mg/ml， 得到 总反应体积 10l ； (4)55保温 2 小时或以上， 95保温 10 分钟， 16保温 5 分钟 ； (5) 离心取上清， 此上清液直接用作 PCR 的 DNA 模板。 权 利 要 求 书 CN 101948828 B1/3 页 3 一种微量动物细胞基因组 DNA 模板制备液及相应的 DNA 模 板制备方法 技术领域 0001 本发明属于分子生物学领域， 涉及一种微量动物细胞基因组 DNA 模板制备液及相 应的 DNA 模板制备方法。 背景技术 0002 现有的动物细胞基因组 DNA 提取方法很多， 包括酚氯仿抽提法等， 提取。

7、过程由于 DNA 纯化需要洗涤等过程而繁琐， 而且由于 DNA 纯化的得率问题， 需要细胞初始样本量较 多， 因此一般需要抽取动物血样或采动物组织样， 对动物造成伤害较大。 市场上现有的微量 动物细胞基因组 DNA 提取试剂盒由于需要纯化柱子而价格昂贵， 且过程也相对繁琐。 发明内容 0003 本发明目的在于提供针对现有动物细胞基因组 DNA 提取存在的不足， 提供一种微 量动物细胞基因组 DNA 模板制备液及相应的 DNA 模板制备方法。 0004 一种微量动物细胞基因组 DNA 模板制备液， 该制备液由 A 液和 B 液以 1:3-10 的 体积比混合制得， 其中所述的 A 液为 Tris。

8、、 (NH4)2SO4、 MgCl2的混合溶液， 三种试剂终浓度 均为 0.1-2.0M ； 所述的 B 液为 Triton 和 - 琉基乙醇的混合溶液， 二种试剂终浓度均为 0.1-2.0%。 。 0005 相应的 DNA 模板制备方法， 依次包括如下步骤 ： 0006 (1) 取上述微量动物细胞基因组 DNA 模板制备液， 加入装有微量动物细胞的离心 管或 PCR 管中 ； 0007 (2) 将装有所述 DNA 模板制备液和动物细胞的离心管或 PCR 管 95保温 5 分钟， 16保温 5 分钟 ； 0008 (3) 加入蛋白酶 K 溶液， 该蛋白酶 K 终浓度为 1.0-3.0mg/ml。

9、 ； 0009 (4) 55保温 2 小时或以上， 95保温 10 分钟， 16保温 5 分钟 ； 0010 (5) 离心取上清， 此上清液直接用作 PCR 的 DNA 模板。 0011 所述的 DNA 模板制备方法优选依次包括如下步骤 ： 0012 (1) 取上述微量动物细胞基因组 DNA 模板制备液 8.8l， 加入装有动物细胞的离 心管或 PCR 管中 ； 0013 (2) 将装有所述 DNA 模板制备液和动物细胞的离心管或 PCR 管 95保温 5 分钟， 16保温 5 分钟 ； 0014 (3) 加入浓度为10mg/ml蛋白酶K溶液1.2l， 使该蛋白酶K终浓度为1.2mg/ml， 。

10、得到总反应体积 10 l ； 0015 (4) 55保温 2 小时或以上， 95保温 10 分钟， 16保温 5 分钟 ； 0016 (5) 离心取上清， 此上清液直接用作 PCR 的 DNA 模板。 0017 有益效果 ： 说 明 书 CN 101948828 B2/3 页 4 0018 本发明微量动物细胞基因组 DNA 模板制备液成本较之现有的动物细胞基因组 DNA 提取所需试剂成本大幅降低。本发明动物细胞基因组 DNA 模板制备过程简单， 利用所配制 的 DNA 模板制备液直接将动物细胞裂解， 释放的 DNA 无需进行纯化可直接用作常规 PCR 的 DNA 模板， 避免了常规方法提取基因。

11、组 DNA 的繁琐过程。由于模板制备过程简单， 本发明从 微量动物细胞制备的基因组 DNA 模板完整， 没有耗损。本发明微量动物细胞基因组 DNA 的 模板制备液及相应的 DNA 模板制备方法因所需初始动物细胞数量较小， 可用于动物毛发毛 囊、 极微量的动物培养细胞等基因组DNA模板的制备， 使大规模动物细胞基因组DNA模板制 备成为可能。 由于动物毛发等取样简单， 较之动物血样或组织样等的取样手段， 对动物的伤 害更小。 附图说明 0019 图1、 实施例3利用本发明制备乳鸽微量羽髓细胞基因组DNA模板及乳鸽雌雄鉴别 结果图， 0020 M ： Marker DL 2000。 0021 图 。

12、2、 实施例 4 利用本发明制备牛毛囊细胞基因组 DNA 模板的 PCR 鉴定结果图， 0022 M ： Marker DL 2000。 0023 图3、 实施例5利用本发明制备猪单个卵母细胞周边少量卵丘细胞基因组DNA模板 的 PCR 鉴定结果图， 0024 M ： Marker DL 2000, 泳道 1、 2 ： 基因组 DNA 扩增片段， 泳道 3、 4 ： 阴性对照。 具体实施方式 0025 实施例 1 微量动物细胞基因组 DNA 模板制备液的配制 0026 A 液 ： Tris、 (NH4)2SO4、 MgCl2三种试剂溶于双蒸水， 使其终浓度均为 0.1M ； 0027 B 液 。

13、： Triton 和 - 巯基乙醇用双蒸水稀释， 使其终浓度均为 0.1% ； 0028 以双蒸水为溶剂， 按常规方法分别配制 A 液和 B 液， 然后以 1:3 的比例将 A、 B 两种 液体混合均匀， 即得动物细胞基因组 DNA 模板制备液。 0029 实施例 2 微量动物细胞基因组 DNA 模板制备液的配制 0030 A 液 ： Tris、 (NH4)2SO4、 MgCl2三种试剂溶于双蒸水， 使其终浓度均为 2.0M ； 0031 B 液 ： Triton 和 - 巯基乙醇用双蒸水稀释， 使其终浓度均为 2.0% ； 0032 以双蒸水为溶剂， 按常规方法分别配制 A 液和 B 液， 。

14、然后以 1:10 的比例将 A、 B 两 种液体混合均匀， 即得动物细胞基因组 DNA 模板制备液。 0033 实施例 3 利用乳鸽微量羽髓细胞制备基因组 DNA 模板及乳鸽雌雄鉴别 0034 1.1 乳鸽羽髓细胞基因组 DNA 模板制备 0035 拨取 7 天左右乳鸽新生腹侧羽毛 （含少量羽髓） 1 根， 并取 1mg 左右羽髓于 PCR 管 中 ； 0036 PCR 管中加入实施例 1 微量动物细胞基因组 DNA 模板制备液 8.8l ； 0037 PCR 管置 PCR 仪中 95 5 分钟， 16 5 分钟， 55 2 小时， 95 10 分钟， 16 5 分钟。并在第一个 16 5 分。

15、钟过种中暂停 PCR 仪， 加入 1.2 l 蛋白酶 K（10mg/ml） ； 0038 离心取上清作 PCR 的 DNA 模板。 说 明 书 CN 101948828 B3/3 页 5 0039 1.2 PCR 扩增 0040 反 应 体 系 ： 双 蒸 水 6.05l、 25mM Mg2+ 1.0l、 10Buffer 1.0l、 5mM dNTP 0.4l、 5M上、 下游引物各0.5l、 Taq酶0.05l、 DNA模板0.5l ； 上游引物为 ： SEQ ID NO.1， 下游引物为 ： SEQ ID NO.2。 0041 反应条件 ： 94 2 分钟 ； 94 30 秒， 50 3。

16、0 秒， 72 40 秒， 35 个循环。 0042 1.3 PCR 产物条带分型 0043 EB 染色， 1% 琼脂糖凝胶 5-10V/cm 电泳， 成像系统条带分型。雌性鸽为三条条带， 长度分别是 628bp、 420bp 和 358bp ； 雄性鸽为二条条带， 长度分别为 628bp 和 358bp（见图 1） 。 0044 实施例 4 利用牛毛囊细胞制备基因组 DNA 模板 0045 1.1 种公牛毛囊细胞基因组 DNA 模板制备 0046 拨取种公牛毛发 1 根， 并取毛囊于 PCR 管中 ； 0047 PCR 管中加入实施例 2 微量动物细胞基因组 DNA 模板制备液 8.8l ；。

17、 0048 PCR 管置 PCR 仪中 95 5 分钟， 16 5 分钟， 55 2 小时， 95 10 分钟， 16 5 分钟。并在第一个 16 5 分钟过种中暂停 PCR 仪， 加入 1.2 l 蛋白酶 K（10 mg/ml） ； 0049 离心取上清作 PCR 的 DNA 模板。 0050 1.2 PCR 扩增 0051 反 应 体 系 ： 双 蒸 水 6.05l、 25mM Mg2+ 1.0l、 10Buffer 1.0l、 5mM dNTP 0.4l、 5M所述的上、 下游引物各0.5l、 Taq酶0.05l、 DNA模板0.5l ； 上游引物为 ： SEQ ID NO.3， 下游引。

18、物为 ： SEQ ID NO.4。 0052 反应条件 ： 94 2 分钟 ； 94 30 秒， 56 30 秒， 72 40 秒， 35 个循环。 0053 1.3 基因组 DNA 模板的 PCR 鉴定 0054 EB染色， 1%琼脂糖凝胶5-10V/cm电泳， 成像系统鉴定PCR扩增产物条带 （见图2） 。 0055 实施例 5 利用猪单个卵母细胞周边少量卵丘细胞制备基因组 DNA 模板 0056 1.1 单个卵母细胞周边的少量卵丘细胞基因组 DNA 模板制备 0057 吸取单个卵母细胞 （含少量卵丘细胞） ， 并吹入 PCR 管中 （PBS 尽量少） ； 0058 PCR 管中加入实施例。

19、 2 微量动物细胞基因组 DNA 模板制备液 8.8l ； 0059 PCR 管置 PCR 仪中 95 5 分钟， 16 5 分钟， 55 2 小时， 95 10 分钟， 16 5 分钟。并在第一个 16 5 分钟过种中暂停 PCR 仪， 加入 1.2 l 蛋白酶 K（10mg/ml） ； 0060 离心取上清作 PCR 的 DNA 模板。 0061 1.2 PCR 扩增 0062 反 应 体 系 ： 双 蒸 水 6.05l、 25mM Mg2+ 1.0l、 10Buffer 1.0l、 5mM dNTP 0.4l、 5M所述的上、 下游引物各0.5l、 Taq酶0.05l、 DNA模板0.5。

20、l ； 上游引物为 ： SEQ ID NO.5， 下游引物为 ： SEQ ID NO.6。 0063 反应条件 ： 94 2 分钟 ； 94 30 秒， 59 30 秒， 72 30 秒， 35 个循环。 0064 1.3 基因组 DNA 模板的 PCR 鉴定 0065 EB染色， 1%琼脂糖凝胶5-10V/cm电泳， 成像系统鉴定PCR扩增产物条带 （见图3） 。 说 明 书 CN 101948828 B1/2 页 6 江苏省农业科学院 一种微量动物细胞基因组 DNA 模板制备液及相应的 DNA 模板制备方法 6 1 18 DNA 人工序列 乳鸽雌雄鉴别 PCR 上游引物序列 1 aacgt。

21、ggcaa cagagtac 18 2 18 DNA 人工序列 乳鸽雌雄鉴别 PCR 下游引物序列 2 gatccagtgc ttgtttcc 18 3 19 DNA 人工序列 牛毛囊细胞基因组 DNA 模板的 PCR 鉴定上游引物序列 3 agcatcacag cagctggac 19 4 20 DNA 序 列 表 CN 101948828 B2/2 页 7 人工序列 牛毛囊细胞基因组 DNA 模板的 PCR 鉴定下游引物序列 4 gctttccatc caagtacgag 20 5 22 DNA 人工序列 猪单个卵母细胞周边的少量卵丘细胞基因组DNA模板的PCR鉴定上游引物序列 5 aagtcggaag gtcattgtcg tg 22 6 21 DNA 人工序列 猪单个卵母细胞周边的少量卵丘细胞基因组DNA模板的PCR鉴定下游引物序列 6 cgcccagtcc aggtaggtat t 21 序 列 表 CN 101948828 B1/1 页 8 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 。