(一)技术领域
本发明涉及一种提高变构霉素发酵产量的制备方法，特别涉及一种在以放线菌发酵培养生产变构霉素时补加前体物质来提高变构霉素发酵产量的工艺方法。
(二)背景技术
变构霉素(Tautomycin)是我国著名生物化工学家、中国工程院院士沈寅初院士于60年代末发现的抗生素。于1987年在日本理化所对其结构进行了初步鉴定，1990年对变构霉素进行了完整鉴定，其分子式为C41H66O13。
Tautomycin是Streptomyces spiroverticillatus产生的一种特定的蛋白磷酸酶抑制剂[5]，尤其是对蛋白磷酸酶类型1(PP1)和蛋白磷酸酶类型2A(PP2A)作用明显，其IC50分别是22nM和32nM；它也是一种有效研究细胞内转换信号的介质，具有良好的生物活性和抗真菌活性。它对黄瓜灰霉病有很好的抑制作用，斑点测试剂量为6ppm；对油菜菌核病具有极强的抗菌活性，其最低抑制浓度达到0.5μg/mL。另外还可以在0.03-0.3μg/mL范围内有效抑制人体佛波酯诱导的髓样白血病细胞系HL60的扩散。
介于变构霉素良好的抗菌活性和诸多优点，已经有很多的研究小组对其进行了合成方面的研究。但是自该化合物发现以来。研究人员多数是从化学合成方向生产变构霉素。化学合成方法虽然精度高，但原料有限、有机溶剂污染大、过程繁杂(20多个步骤)以及产量低等都是限制变构霉素大生产重要因素。随着生物技术的发展，生物法生产抗生素显示出了它独特的优点。但是到目前为止，很少有关于生物法生产变构霉素的报导，1987年，Cheng等从16L发酵液中提取得到4.8g油状物，初略地报导了其发酵产量为133.3mg/L。1995年Ubukata等在研究其生物合成途径过程中间接地报导了变构霉素的产量为91.8mg/L。而在补料发酵方面自今未见有报导，补料发酵是提高抗生素产量的一种很有效途径。因此，我们希望以补料的方式提高变构霉素的产量。
变构霉素化学结构中含有一个独特的酸酐结构，1995年Ubukata等利用13C研究了变构霉素生物合成过程的中间体。因此，我们试图通过补加这些中间物质来提高变构霉素的产量。最终发现，在其发酵液中添加一定量的前体类物质可以在一定那个程度上提高变构霉素的产量。其中尤其是具有与变构霉素相同酸酐结构的顺丁烯二酸酐对其发酵的影响较大，可以大大提高变构霉素的产量。然而顺丁烯二酸酐水溶液成酸性，在发酵补加过程中对发酵液的pH也有很大影响。如果补加速度过快、或者浓度过高都会导致发酵液pH成较强的酸性，最终使菌体溶解死亡。因此，补料过程流速、浓度的控制必须严格控制发酵液pH。另外，变构霉素属于次级代谢产物，对前体类物质的利用一般发生在产物合成期，即发酵后期。因此，前体物质补加的最佳时间也在发酵的中后期。
(三)发明内容
本发明的目的是提供一种通过发酵的方法制备变构霉素提高变构霉素产量的方法，本发明在发酵过程中适时地补加前体物质，最终可以使变构霉素产量得到大幅度的提高，可以很好地改善发酵生产变构霉素产量过低的现状。
为实现以上目的，本发明的技术方案如下：
一种提高变构霉素发酵产量的制备方法，所述工艺方法包括如下步骤：
(1)将放线菌菌种接入种子培养基，于27～30℃摇瓶培养20～26h后得种子液，再取种子液，接入发酵培养基在26～35℃温度条件下进行发酵培养；
(2)发酵培养50～90h后，发酵液的pH升至4.5～7时，补加前体物质，这里pH升至4.5～7的含意是pH升至4.5或无限接近于7但不到7；通常是待发酵液pH从最低值上升至4.5～6.5时开始缓慢补加低浓度的前体物质效果较好；所述前体物质的补加总质量为所述发酵液的0.1％～0.3％g/mL；所述前体物质为单一下列物质之一或是按顺序补加下列任意几种物质：顺丁烯二酸酐、甘氨酸、蛋氨酸、α-酮戊二酸、丁二酸盐、丙二酸、柠檬酸、谷氨酸或2，3-二甲基马来酸酐，补加后在27～30℃继续发酵10～30小时，所述补加前体类物质以水溶液的形式加入，所述的前体类物质水溶液的浓度为10～80g/L，流速为0.2～0.8mL/min，且继续保持发酵液pH在4.0～7.0之间；
(3)发酵结束，离心分离出沉淀，再用有机溶剂浸泡沉淀5h～20小时，沉淀与有机溶剂的质量体积比列为1∶3～1∶10(g/ml)，这里所述的沉淀的质量是以离心后的湿重来计的，所述的有机溶剂为下列之一或基任意组合：丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇或二氯甲烷，静置或离心后，弃沉淀，再取有机溶剂层，于旋转蒸发仪上将有机溶剂层蒸发干净，剩余物质即为发酵产物变构霉素样品。
为了验证我们得到的变构霉素，我们用了如下方法分析检测，取样品适量加入0.3～0.8mol/L NaHCO3溶液，待其反应20-30min，将产物于高效液相色谱检测，色谱柱为C18反相柱(250mm×4.6mm，5μm，Elite)，流动相为乙腈∶水＝2∶3，流速为1mL/min。进样量为20μL，紫外检测器波长为220nm。检测时加入NaHCO3溶液，NaHCO3溶液是使得变构霉素多个构型转化为统一的变构霉素盐，以方便检测。
所述种子培养基的成分和含量为：葡萄糖8～25g/L，牛肉膏4～6g/L，酵母粉5～10g/L，NaCl 1～4g/L，K2HPO40.005～0.01g/L，初始pH 6.5～7.0；溶剂为水。所述的种子培养基成份及含量优选为：葡萄糖10g/L，牛肉膏5g/L，酵母粉10g/L，NaCl 2g/L，K2HPO40.02g/L，初始pH 6.5；溶剂为水。
所述发酵培养基的成分和含量为：葡萄糖8～25g/L，黄豆粉20～30g/L，淀粉8～15g/L，酵母提取物5～10g/L，NaCl 1～4g/L，K2HPO40.01～0.05g/L，初始pH 6.5～7.0；溶剂为水。所述的发酵培养基成份及含量优选为：葡萄糖20g/L，黄豆粉25g/L，淀粉10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl2g/L，K2HPO4 0.05g/L pH 6.5；溶剂为水。
本发明所述的发酵培养推荐取种子液，以体积比6％～10％的接种量接种于发酵培养基中，于接入发酵培养基在26～35℃温度条件下摇床转速为150～200r/min，进行发酵培养。
本发明推荐所述的前体物质为顺丁烯二酸酐。
所述前体物质以其水溶液形式补加，优选的，所述的步骤(2)中，所述的前体类物质的水溶液浓度为40g/L，加入的流速为0.5ml/min。
本明所述的发酵培养总时间为96～120h。优选所述的步骤(2)将发酵液的pH升至6～6.5时，补加前体物质。
所述的放线菌菌种为Streptomyces spiroverticillatus，保藏号为，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，100101，保藏编号CGMCC-0092，保藏日期：1979年12月20日。
具体的本发明推荐所述工艺方法包括如下步骤：
(1)将Streptomyces spiroverticillatus接入种子培养基，于28℃摇瓶培养24h后于27～30℃摇瓶培养20～26h后得种子液，取种子液，以体积比6％～10％的接种量接入发酵培养基中，在26～35℃温度条件下摇床转速为150～200r/min，进行发酵培养；
(2)发酵培养50～90h后，发酵液的pH升至6～6.5时，补加前体物质，所述前体物质的补加总质量为所述发酵液的0.1％～0.3％g/mL；所述前体物质为单一下列物质之一：顺丁烯二酸酐、蛋氨酸、α-酮戊二酸，补加后在27～30℃继续发酵10～30小时，所述补加前体类物质以水溶液的形式加入，所述的前体类物质水溶液的浓度为10～80g/L，优选40g/L，流速为0.2～0.8mL/min，且继续保持发酵液pH在4.0～7.0之间；
(3)发酵结束，离心分离出沉淀，再用有机溶剂浸泡沉淀5h～20小时，所述的沉淀与有机溶剂的质量体积比列为1∶3～1∶10g/ml，取有机溶剂层于旋转蒸发仪上将有机溶剂成分蒸发干净，剩余物质即为发酵产物变构霉素样品，所述的有机溶剂为下列之一或其任意方式的组合：丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、二氯甲烷。
本发明通过在发酵过程中适时地补加前体物质来提高变构霉素的产量方法，尤其是顺丁烯二酸酐的添加与变构霉素的产生具有较强的正相关性，最终可以使变构霉素产量得到大幅度的提高。可以很好地改善发酵生产变构霉素产量过低的现状。通过关联发酵过程中的pH来补加前体物质，使发酵后期得以保持在最佳的环境中，同时很好地利用了前体物质，因为补加某些氨基酸类前体时会大大降低pH，故补加前体的过程中需要观察pH的变化。最终使变构霉素的产量得以增加。补料工艺简单、原料低廉、环境污染小且操作方便。
(五)具体实施方式
图1是实施例3不同pH发酵液中菌丝体的观察图，A是发酵液pH 6.5(10×100倍)，B发酵液pH 3.5(10×100倍)
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1：
菌种：Streptomyces spiroverticillatus，保藏号为CGMCC-0092。
本发明实施例的培养基配方：
斜面培养基：斜面培养基为高氏一号培养基；
种子培养基：葡萄糖10g/L，牛肉膏5g/L，酵母粉10g/L，NaCl 2g/L，K2HPO40.02g/L，初始pH 6.5；溶剂为水。
发酵培养基：葡萄糖20g/L，黄豆粉25g/L，淀粉10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 2g/L，K2HPO4 0.05g/L 初始pH 6.5；溶剂为水。
实验过程：
步骤1：种子培养
将S.spiroverticillatus菌种从斜面接入含100ml种子培养基的500ml三角瓶内，于回旋式摇床28℃下培养24h，转速为150rpm。
步骤2：不同pH的顺丁烯二酸酐对补料发酵的影响
移接3ml种子液于含50ml发酵培养基的三角瓶内，在温度28℃、转速150rpm的条件下进行发酵培养。每组实验为三个平行。待发酵至72h时，分别往发酵液中补加0.2％(W/V)的以下前体物质，分别为水溶液的形式补加，各自所添加的量为：(A)用NaOH调节至pH 7.0的顺丁烯二酸酐水溶液，质量体积浓度为20g/L，共加5ml；(B)不调节pH的顺丁烯二酸酐水溶液，质量体积浓度为20g/L，共加5ml。(C)蒸馏水溶液5ml(作为对照)。
步骤3：发酵结束以及检测分析
每一份补料后继续发酵培养至96h，进行变构霉素提取以及分离检测。各取1mL发酵液，加入0.1mL，1mol/L的HCl，调pH至2，振荡摇匀，再加入4mL的丙酮，于振荡器上振荡均匀，待其浸泡5h后，取1mL于1.5mL Eppendorf离心管中，12000r/min离心5min，取上清液，将丙酮吹干后加入0.5mol/L的NaHCO3溶液，12000r/min离心5min，进行高效液相色谱分析。运行条件如下：色谱柱为C18反相柱(250mm×4.6mm，5μm，Elite)，流动相为乙腈∶水＝2∶3，流速为1mL/min。进样量为20μL，紫外检测器波长为220nm。本实施例要说明的是，对检测过程来说，直接从发酵液检测更为准确，所以是直接取发酵液来浸泡。如果目的是获取产物，可在调pH至2后振荡摇匀，再加入4mL的丙酮，于振荡器上振荡均匀取菌体浸泡就可以了，因为液体中含量很少，主要在菌体中，生产中通常弃去液体。
实验结果
各组中变构霉素产物量分别为(A)628.9mg/L；(B)1436.2mg/L；(C)703.5mg/L。这表明在发酵液中补加自然pH的水溶液对变构霉素的产量的提高才是有效的，而不能将其调节pH 7.0再进行补加。即顺丁烯二酸酐的补加必须以其酸酐形式补加，调节pH 7.0后它将变成盐的形式，以其盐的形式补加是无效的。
实施例2：
菌种、培养基以及培养条件同实例1
实验过程：
步骤1：种子培养同实例1
步骤2：不同时间补加顺丁烯二酸酐
移接6ml种子液于含100ml发酵培养基的三角瓶内，在温度28℃、转速150rpm的条件下进行发酵培养。待其发酵一定时间后补加前体物质，共有八组实验，每组实验为三个平行，分别取三个平行实验的平均值作为下列结果。
为了确定顺丁烯二酸酐补加的最佳时间，分别在不同的发酵时间段补加0.2％(g/mL)的顺丁烯二酸酐，浓度为40g/L，补加顺丁烯二酸酐水溶液的量为5mL，对照组为蒸馏水，在48小时时补加5ml蒸馏水。如表1所示：
表1不同补料时间对变构霉素发酵的影响
添加时 间点 18h 30h 42h 54h 66h 78h 90h 对照 变构霉 素mg/L 875.3 867.3 982.2 1455.5 1723.1 1645.9 1252.8 899.9
步骤3：发酵结束以及检测分析过程同实例1，结果见表1。
实验结果
实验结果如表1所示，表明42h～90h添加顺丁烯二酸酐对发酵生产变构霉素都有较好的促进作用。其中在66h补加后的效果最明显，相对于对照组其提高了91.5％。
实施例3：
在实施列1中阐明了顺丁烯二酸酐的补加必须以其酸酐形式补加，不得以调其pH为中性或碱性。因此，所补加的顺丁烯二酸酐为酸性水溶液，对发酵液本身的pH会产生很大影响。补加浓度过大或速度过快都会导致发酵液pH急剧下降，从而最终影响变构霉素的产生。为了进一步弄清pH对菌丝的影响程度以及顺丁烯二酸酐的最佳补加时间和补加速度，我们对实施例1中的(B)顺丁烯二酸酐补加前后以及不同pH条件下的菌丝体进行了显微观察。结果如图1所示。
实验结果
补加顺丁烯二酸酐前发酵液pH为6.5，此时，菌丝体生长的长而且粗壮，发酵液较为粘稠；当补加过量的顺丁烯二酸酐pH变为3.5后，菌丝变得弥散而不完整，菌丝体自溶，发酵液变得稀薄。因此，补加顺丁烯二酸酐不得使发酵液的pH低于3.5才有可能保证菌体的正常生长并利用顺丁烯二酸酐。
鉴于产物变构霉素特殊的酸酐结构，碱性条件会造成变构霉素的破坏，也就是发酵过程中本身就需要控制其pH在7.0以下。因此，顺丁烯二酸酐的补加的最佳发酵液pH范围是4.0-6.8而关联到发酵时间上，由于发酵指数期的代谢活跃，发酵液的pH会降到一个较低值，然后开始上升，此时一般为发酵的50h-90h之间。
实施例4：
菌种、培养基以及培养条件同实例1
实验过程：
步骤1：种子培养同实例1
步骤2：补加不同浓度的顺丁烯二酸酐
移接6ml种子液于含100ml发酵培养基的三角瓶内，在温度28℃、转速150rpm的条件下进行发酵培养。待发酵至72h时，分别做六组实验，每组三个平行，其中一组为对照，添加蒸馏水，另五组以发酵过程中补加不同浓度的顺丁烯二酸酐。
为了确定顺丁烯二酸酐补加量，且鉴于实例2所确定的最佳补加时间为66h，在发酵的66h往发酵液中补加不同质量比的顺丁烯二酸酐，按表2添加量补加不同量的浓度为40g/L顺丁烯二酸酐水溶液，对照组为蒸馏水，在66小时时补加5ml蒸馏水。如表2所示：
表2不同补料量对变构霉素发酵的影响
添加量 (g/mL) 0.05％ 0.10％ 0.20％ 0.30％ 0.50％ 对照 变构霉素 mg/L 738.5 1029.9 1488.6 1239.4 1148.3 811.4
步骤3：发酵结束以及检测分析过程同实例1，结果见表2。
实验结果
实验结果如表2所示，表明0.2％的顺丁烯二酸酐是最佳的添加浓度，相对于对照组其提高了83.5％。浓度过高或过低都达不到理想的效果。添加量过多，一方面可能会利用过剩；另一方面可能会对发酵液的pH环境造成较大的影响而不利于菌体的生长和变构霉素的生物合成。
实施例5：
菌种、培养基以及培养条件同实例1
实验过程：
步骤1：种子培养同实例1
步骤2：补料发酵
分别取做三份发酵培养(a)(b)(c)，每一份将400ml种子液移接于含8L发酵培养基的15L发酵罐中，在温度28℃、转速150rpm通气1.1vvm的条件下进行发酵培养。设计了以下实验进行补加实验：(a)待发酵至65h时，开始往发酵液中补加40g/L的顺丁烯二酸酐水溶液，400ml，总补加量为0.2％(g/mL)，以0.6ml/min的流速在11h内补加完成；(b)待发酵至72h时，开始往发酵液中补加40g/L的甘氨酸300ml，总补加量为0.15％(g/mL)，以0.5ml/min的流速在10h内补加完成；(c)待发酵至72h时，开始往发酵液中补加40g/L的蛋氨酸400ml，总补加量为0.2％(g/mL)，以0.6ml/min的流速在11h内补加完成。各组发酵实验在补料后继续发酵培养至96h，结束后进行变构霉素提取以及分离检测。
步骤3：发酵结束以及检测分析过程同实例1
实验结果
各组变构霉素产量为(a)1714.7mg/L；(b)621.64mg/L；(c)711.51mg/L；(对照)572.413mg/L。与对照组比较分别提高了(a)199.7％；(b)8.6％；(c)24.3％。