技术领域
本发明提供了一种改良的方法，该方法通过加入二-或者三羧酸例如 柠檬酸，在哺乳动物细胞培养中降低乳酸的形成和/或葡萄糖的消耗。
背景技术
细胞培养方法的最优化通常集中在细胞的存活力上(Bibila，T.A.和 Robinson，D.K.Biotechnol.Prog.11(1995)1-13)。随时间流逝的可存活细胞 数的积分通常被作为培养成功的量度标准，并且与产物的形成正相关。在 本文中，这个积分被定义为CTI(CTI＝细胞密度时间积分)。
除铵以外，乳酸是在哺乳动物细胞培养过程中形成的一种主要的废 物。在典型的培养条件下，细胞大量地消耗葡萄糖并且主要将其代谢成乳 酸。作为pH和/或通过碱调节pH的结果，乳酸的积累负面地影响细胞生 长，CTI和蛋白产生(Chang，Y.H.D.等，Biotechnol.Bioeng.47(1995) 319-326)；Omasa，T.等，Biotechnol.Bioeng.39(1992)556-565)和Chen， K.等，Biotechnol.Bioeng.72(2001)55-62)。
已经作出过许多努力来减少乳酸形成。Glacken，M.W.等，Biotechnol. Bioeng.28(1986)1376-1389)，Hu，W.S.等，Dev.Biol.Stand.66(1987) 279-290)和Xie，L.和Wang，D.I.C.Cytotechnology 15(1994)17-29)建议： 用动态控制给予葡萄糖在低葡萄糖浓度下培养哺乳动物细胞。这个想法是 为了实现从高葡萄糖/乳酸通量代谢转化为低葡萄糖/乳酸通量。但是，这 些方法需要细胞的适应并且需要小心地设计控制给予机制。因此是操作起 来复杂且困难(美国专利6,156,570)。
其它降低乳酸形成的方法基于遗传工程方法。一种方法描述在Chen， K.等的Biotechnol.Bioeng.72(2001)55-62中。Chen等建议通过在所述细 胞中，钝化至少一个拷贝的乳酸脱氢酶基因，来操纵在哺乳动物细胞中乳 酸的代谢通路。另一种方法描述在Irani，N.等的J.Biotechnol.66(1999) 238-246)中。作者将丙酮酸羧化酶基因引入到宿主细胞的基因组中。推测： 丙酮酸到乳酸的转化被降低并且从而提高了细胞培养的存活力。
本发明的目的是为了提供一种降低在哺乳动物细胞生长过程中的葡 萄糖消耗和/或乳酸形成的简单方法。
将柠檬酸铁作为运铁蛋白的替代物加入到无血清培养基中来用于哺 乳动物细胞的培养已经被知道很长时间了(cf.例如.Toyoda，K.和 Inouye，K.Agric.Biol.Chem.55(1991)1631-1633)，Franek，F.和 Dolnikova，J.Cytotechnology 7(1991)33-38)，Kovar，J.和Franek，F.Exp. Cell Res.182(1989)358-369)，Schneider，Y.J.J.Immunol.Meth.116(1989) 65-77)和Kovar，J.Hybridoma 7(1988)255-263)。
发明内容
发明概述
已经令人惊讶地发现：加入一种或者多种二-或者三羧酸明显地抑制 了葡萄糖消耗和/或由葡萄糖形成的乳酸并因此提高了在哺乳动物细胞培 养过程中细胞密度和细胞生存力。基于这些发现，使用按照本发明的方法， 明显地增加了通过这种细胞培养而产生的目的蛋白(POI)的产量。此外， 二-或者三羧酸的加入降低了约50％-70％的碱量，该碱需要被加入以维 持pH值稳定。
因此，本发明涉及在体外动物细胞培养过程中降低葡萄糖消耗和/或 乳酸产生的方法，其特征在于所述的培养在以约1-50mmol/l的浓度存在 一种或者多种二-或三羧酸或者它们的盐的情况下进行，所述的酸例如α- 酮戊二酸，琥珀酸，延胡索酸，苹果酸，酮戊二酸或者柠檬酸或者它们的 结合，由此，当所述的二-或者三羧酸或者盐是柠檬酸或柠檬酸盐的情况 下，这样的量的所述柠檬酸或柠檬酸盐在螯合物中不与铁或者另一种过渡 金属离子结合。
在本发明的一个优选实施方案中，动物细胞是哺乳动物细胞，优选杂 交瘤细胞或者骨髓瘤细胞，CHO，NS0，BHK，或者HeLa细胞，这些 细胞产生单克隆抗体或者蛋白质激素。
在本发明的另一个优选的实施方案中，以分批给料，分批灌注，透析， 固体状态，或者连续发酵的形式培养细胞，优选超过10-20天。
发明详述
依照本发明，相对于使用不存在非组合柠檬酸盐方法的发酵方法，葡 萄糖消耗的具体速度(μg/106细胞x天)，被减少到大约40％，优选超过 40％，即：40-60％。相对于使用不存在非组合柠檬酸盐方法的发酵方法， 乳酸产生的具体速率(μg/106细胞x天)，被减少到大约50％，优选超过 50％，即：50-70％，
乳酸在细胞培养基中的累积可以抑制细胞培养过程中的细胞生长和 POI产生。抑制生长的乳酸浓度随细胞系而变化。在培养过程中某一时间 后的乳酸浓度，是乳酸产率和CTI的结果。该发明降低了乳酸的特定产率， 这样使得在抑制浓度发生前的时期延长，或者在最佳情况下，乳酸停留在 抑制浓度以下。但是，该发明在培养过程中引起CTI的大量增加。
细胞培养在生产容积内进行，即：在体积为10-10,000l的生物反应 器中进行。这些方法描述在例如Bibila，T.A.和Robinson，D.K.Biotechnol. Prog.11(1995)1-13中。
优选地，发酵培养基是无血清培养基。这样的培养基广泛地描述在本 领域状态中(参见，例如Murakami，H.Monoclonal Antibodies：Production and Application(1989)107-141)。
二和三羧酸优选被作为碱金属或者碱土金属盐或者作为游离酸，以约 1-50mmol/l的浓度加入。这样的羧酸量优选在螯合物中不与铁或者另一 种过渡金属结合。但是，培养基可以优选在含有铁的螯合物中包含额外数 量的二-和三羧酸或者其盐，所述的铁被作为无血清培养基的铁源加入。 如前所述，众所周知，柠檬酸盐是作为铁源的无血清培养基的添加剂，该 铁源应该是例如转铁蛋白。
术语“络合的二-和三羧酸”指的是所述酸和铁离子的化学计算量的 含水溶液，其引起在质量作用定律内的络合物形成。
术语“目的蛋白(POI)”指的是任何需要被表达的蛋白。优选该术 语包括所需蛋白的任何重组体形式。这些目的蛋白是例如蛋白激素如红 细胞生成素，或者抗体等等。这些重组体蛋白综述在例如Hudson，P.J.和 Souriau，C.Expert.Opin.Biol.Ther.1(2001)845-855)中。
哺乳动物细胞优选重组体细胞系如CHO细胞或者杂交瘤或骨髓瘤细 胞，这些细胞被转染了能够表达这种目的蛋白的表达载体。这些方法被 本领域的技术人员所熟知，并且综述在例如Colosimo，A.等Biotechniques 29(2000)314-331)中。
优选在搅动的生物反应器中进行分批给料方式的发酵4-10天。细胞 密度优选为0.2-10×106细胞/毫升。PO2优选为15-30％并且pH为6.9- 7.3。
优选在搅动的生物反应器中进行透析方式的发酵(Comer，M.J.等. Cytotechnology 3(1990)295-299)12-16天。细胞密度优选为0.2-30×106细胞/毫升。PO2为15-30％并且pH为6.9-7.3。
作为发酵培养基，优选使用普通无血清培养基并且使用浓缩养分的 溶液来给料。
提供下面的实施例和参考文献来帮助理解本发明，本发明的真实范 围阐述在后附的权利要求中。应该理解在不离开本发明精神的情况下， 可对所阐述的程序进行修改。
具体实施方式
实施例1
解冻骨髓瘤细胞系(Sp2/0)的细胞并且在超过大约14天的时间将其 在旋转烧瓶中扩大到2L，以用于10L生物反应器的接种。在2-4天后， 细胞被分离或者被转移到100L的生物反应器中，并且进一步培养2-4天。 这个100L的生物反应器作为1000L生产生物反应器的接种物。对于每个 接种步骤，使用的初始细胞密度为0.2-0.4×106可存活细胞/毫升。
该生产生物反应器以透析方式运转。该生物反应器是一个搅动的罐 式反应器，其工作体积为900-1300L。使用喷射来进行通气。控制下面 的工艺参数：pH、温度、pO2、压力和搅动速度。该生物反应器为透析 方式装备了中空的纤维筒。这些筒被连接到一个带有透析培养基储存器 的外部环上。在接种后2-4天，开始培养物的透析。在发酵过程中，反 复用新鲜的透析培养基填充储存器。将一些培养基组分作为单独的无菌 溶液提供给生物反应器。这些组分包括葡萄糖、氨基酸、维生素、和微 量元素。
最多16天后停止发酵。
在发酵培养基中和透析培养基中加入柠檬酸盐。
实施例1的结果
表1和表2显示了具体的葡萄糖消耗速度和加入或者不加入柠檬酸盐 的CTI(如果使用延胡索酸盐，可以得到类似的结果)。发酵以透析的方 式在1000L的规模下进行。在培养基中加入柠檬酸盐，使葡萄糖的具体消 耗速度下降了大约44％并且使CTI增加了大约105％。同时，乳酸的具体 产率降低了大约60％(表3和表4)。
在发酵过程中，POI的具体产率几乎是稳定不变的，因此POI的量随 着CTI相对地增加。
表1
未添加柠檬酸盐的透析方式的发酵
运行 葡萄糖的具体消耗速度 CTI 号码 μg/106细胞×天 相对单位 1 663 134 2 873 98 3 776 96 4 736 100 5 1424 72 平均值 894 100
表2
添加2,4mmol/l柠檬酸盐的透析方式的发酵
运行 葡萄糖的具体消耗速度 CTI 号码 μg/106细胞×天 相对单位 6 705 142 7 351 262 8 429 219 9 549 195 10 481 208 11 355 275 12 535 213 13 537 128 14 519 215 15 578 192 平均值 504 205
在发酵培养基中加入柠檬酸盐，碱量降低了的大约66％，在培养过 程中需要碱来调节pH(表3和表4)。
表3
未添加柠檬酸盐的透析方式的发酵
运行 乳酸的具体产生速度 添加的碱 号码 μg/106细胞×天 相对单位 1 506 110 2 746 111 3 574 59 4 595 77 5 1046 144 平均值 697 100
表4
添加了2,4mmol/l柠檬酸盐的透析方式的发酵
运行 乳酸的具体产生速度 添加的碱 号码 μg/106细胞×天 相对单位 6 491 107 7 176 18 8 200 19 9 320 13 10 241 40 11 200 17 12 284 15 13 338 8 14 259 55 15 307 46 平均值 282 34
实施例2
解冻骨髓瘤细胞系(Sp2/0)的细胞并且将其在旋转烧瓶中扩大到2L， 以用于10L生物反应器的接种。
此生产生物反应器以分批给料方式运转。该生物反应器是一个搅动的 罐式反应器，其工作体积为9-13L。通过喷射来进行通气。控制下面的工 艺参数：pH、温度、pO2、压力和搅动速度。在接种后2-4天，开始培养 物的给料。将一些培养基组分作为单独的无菌溶液提供给生物反应器，这 些组分包括葡萄糖、氨基酸、维生素、和微量元素。
最多10天后停止发酵。
在发酵培养基中和给料培养基中加入二-和三羧酸。
实施例2的结果
表5和表6显示了具体的产生速度和加入或者不加入柠檬酸盐的CTI。 发酵以分批给料方式在10L的规模中进行。在培养基中加入柠檬酸盐，使 葡萄糖的具体消耗速度下降了大约44％并且使CTI增加了大约241％。同 时，乳酸的具体形成速度降低了大约52％。这证明：通过加入柠檬酸盐， 对来自葡萄糖的代谢通量的抑制作用，贯串了整个糖酵解过程。
表5
未添加柠檬酸盐的分批给料方式的发酵
运行 葡萄糖的具体消耗速度 乳酸的具体产率 CTI 号码 μg/106细胞×天 μg/106细胞×天 相对单位 1 1206 670 84 2 939 509 84 3 779 527 104 4 703 471 140 5 1022 714 75 6 948 727 62 7 839 665 90 8 1233 867 86 9 912 612 90 10 967 668 184 平均值 955 643 100
表6
添加了2,4mmol/l柠檬酸盐的分批给料方式的发酵
运行 葡萄糖的具体消耗速度 乳酸的具体产率 CTI 号码 μg/106细胞×天 μg/106细胞×天 相对单位 11 443 230 478 12 715 392 321 13 451 304 224 平均值 536 309 341
参考文献目录
Bibila，T.A.and Robinson，D.K.Biotechnol.Prog.11(1995)1-13
Chang，Y.H.D.et al.Biotechnol.Bioeng.47(1995)319-326
Chen，K.et al.Biotechnol.Bioeng.72(2001)55-62
Colosimo，A.et.al.Biotechniques 29(2000)314-331
Comer，M.J.et.al.Cytotechnology 3(1990)295-299
Franek，F.and Dolnikova，J.Cytotechnology 7(1991)33-38
Glacken，M.W.et al.Biotechnol.Bioeng.28(1986)1376-1389
Hu，W.S.et al.Dev.Biol.Stand.66(1987)279-290
Hudson，P.J.and Souriau，C.Expert.Opin.Biol.Ther.1(2001)845- 855
Irani，N.et al.J.Biotechnol.66(1999)238-246
Kovar，J.and Franek，F.Exp.Cell Res.182(1989)358-369
Kovar，J.Hybridoma 7(1988)255-263
Murakami，H.Monoclonal Antibodies：Production and Application (1989)107-141
Omasa，T.et al.Biotechnol.Bioeng.39(1992)556-565
Schneider，Y.J.J.Immunol.Meth.116(1989)65-77
Toyoda，K.and Inouye，K.Agric.Biol.Chern.55(1991)1631- 1633
US Patent 6,156,570
Xie，L.and Wang，D.I.C.Cytotechnology 15(1994)17-29