一种链霉菌及其生产米尔贝霉素A4的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510137374.2 (22)申请日 2015.03.27 CGMCC NO.9671 2014.09.16 C12N 1/20(2006.01) C12P 17/18(2006.01) C12R 1/55(2006.01) (71)申请人 浙江海正药业股份有限公司 地址 318000 浙江省台州市椒江区外沙路 46 号 (72)发明人 滕云 徐美冬 莫美依 何志慧 陈正杰 江连清 白骅 (54) 发明名称 一种链霉菌及其生产米尔贝霉素 A4 的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种链霉菌 (Streptomyces hygros。

2、copicus)HS7522， 通过培养它制备米尔贝 霉素 A4 的方法。本发明的链霉菌 (Streptomyces hygroscopicus)HS7522 于 2014 年 9 月 16 日保藏 于 “中国生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心” ， 保藏登记号为CGMCC NO.9671， 命名为吸水链 霉菌 (Streptomyces hygroscopicus)。其在含有 可同化碳源和氮源的营养培养基中， 并在通氧的 条件下通过发酵可生产米尔贝霉素 A4。本发明提 高了 A4 在发酵液中的含量， 发酵单位大幅提高， 具备很好的工业应用价值。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl。

3、. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书10页 附图2页 CN 106148215 A 2016.11.23 CN 106148215 A 1/1 页 2 1.一种链霉菌 (Streptomyces hygroscopicus)HS7522， 其保藏编号为 CGMCC NO.9671 且具有生产米尔贝霉素的能力。 2.根据权利要求 1 所述的链霉菌 HS7522， 在生产米尔贝霉素中的应用。 3.一种发酵生产米尔贝霉素的方法， 其特征在于 ： 包括采用链霉菌 HS7522 在含有可同 化的碳源和氮源的营养培养基里， 进行有氧发酵的步骤。 4.根据权。

4、利要求 3 所述的制备方法， 其特征在于 ： 所述可同化的碳源选自淀粉、 糊精、 葡萄糖、 工业糖蜜、 甘油、 蔗糖、 乳糖、 麦芽糖、 海藻糖、 木聚糖、 甘露醇、 山梨醇之一或上述物 质的组合。 5.根据权利要求 3 所述的制备方法， 其特征在于 ： 所述可同化的氮源选自酵母抽提物、 酵母粉、 牛肉浸膏、 胰蛋白胨、 蛋白胨、 黄豆饼粉、 棉籽饼粉、 花生饼粉、 麸质粉、 玉米浆干粉、 麸皮、 尿素、 铵盐之一或上述物质的组合。 6.根据权利要求 3 5 任何一项所述的制备方法， 其特征在于 ： 其中所采用的米尔贝 霉素产生菌为链霉菌HS7522(CGMCC NO.9671)、 链霉菌HS。

5、7522(CGMCC NO.9671)自发的突变 株或通过常规的诱变得到的突变株。 7.根据权利要求 3 所述的制备方法， 其特征在于 ： 所述发酵培养的温度为 20 -40， 培养基 pH 为 6.0-8.0， 培养时间为 300-360 小时。 权 利 要 求 书 CN 106148215 A 2 1/10 页 3 一种链霉菌及其生产米尔贝霉素 A4 的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种新的链霉菌、 通过发酵培养该菌生产米尔贝霉素 A4 的方法。 背景技术 0002 米尔贝霉素是微生物天然产物农药， 已有数据表明它是当今世界上最优良的杀螨 剂之一。美国环保署认定其为低危险性杀虫剂， 。

6、荷兰批准其为 “GNO” ( 作物生产中的天然产 物 )。它属生态友好型农药， 适用于有机农业病虫害的综合防治， 在发达国家已成为一种受 欢迎的杀虫杀螨剂。 0003 米尔贝霉素是日本三共公司以二斑叶螨作为试虫， 从微生物的发酵液中筛选出 的具有抗虫活性的代谢产物 (US3,950,360)。经过大量基础研究， 1983 年米尔贝霉素 (milbemycin)A3 和 A4 组分的混合物 (A3 ： A4 3 ： 7) 被用作杀螨剂， 米尔贝霉素 A3 和 A4 结构如式 I 所示。1990 年， 1的米尔贝霉素乳油 (milbeknock) 在日本作为杀螨剂用于茶 叶、 茄子。 1993年，。

7、 1的米尔贝霉素乳油用作梨、 桃、 西瓜、 草莓、 茄子、 花卉的杀虫剂也在日 本登记。 当前， 米尔贝霉素已在日本、 欧美等多个国家登记， 并且作为安全、 对环境友好的杀 虫杀螨剂被美国环保局推荐使用。 0004 0005 日本三共公司是米尔贝霉素的原研厂， 其 1980 年发表的文献中表明米 尔 贝 霉 素 A3+A4 的 含 量 仅 仅 只 有 150mg/L 左 右 (Yo Takiguchi et al,The J.of Antibiotics,1980,OCT,1120-1127)。 后经过菌种诱变和发酵条件优化， 1990年米尔贝霉素 A3+A4的含量达到530mg/L(Koic。

8、chi Nonaka et al,Actinomycetol.1990， 13:32-41)。 国内 米尔贝霉素研发启动较晚， 主要集中在东北农业大学项文胜课题组， 目前也取得了较大的 突破， 如在2011年发表的文献中米尔贝霉素A3+A4的单位含量最高达到了1595mg/L(Zhang Baoxin et al， African J Biotechnol10(37):7225-7235)， 在中国专利CN 103468625 A中 米尔贝霉素 A3+A4 的单位含量提高至 2237mg/L。 0006 米尔贝霉素发酵液组分复杂， 米尔贝霉素 A3， A4 为主要成分， 另外还含有其他结 构类。

9、似物。 通常情况下米尔贝霉素发酵液中米尔贝霉素A3和A4的比例大约为1:2， 因此现 说 明 书 CN 106148215 A 3 2/10 页 4 有的商业化产品也是 A3， A4 的混合组分。导致这一结果最主要的原因在于要从 A3， A4 比例 相近的发酵液中单独分离出 A3， A4 单组分难度较大， 影响最终收率。实现 A4 的单一组分生 产， 可进一步推动米尔贝霉素 A4 单组分在其他领域的应用。而得到单组分最有效的方法是 获得能够生产单一组分的新菌种， 并进一步提高发酵单位。 发明内容 0007 鉴于此， 本发明的目的之一在于提供一种能提高米尔贝霉素 A4 单位产量的微生 物菌种， 。

10、该菌种的特点在于其发酵液中米尔贝霉素 A4 的含量占 A3 和 A4 总含量的百分比大 于 80， 且米尔贝霉素 A4 的单位产量可以达到大于 4000ug/ml， 米尔贝霉素 A3+A4 的单位 产量可以达到大于 5000ug/ml， 发酵单位高， 杂质含量低。 0008 本发明的链霉菌 HS7522 的微生物菌种于 2014 年 9 月 16 日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院， 中国科 学院微生物研究所 )， 保藏号为 CGMCC NO.9671， 分类命名为吸水链霉菌 (Streptomyces hygroscopicus。

11、)， 并登记入册， 证明存活。 0009 本发明的链霉菌HS7522主要生物学特征为 ： ISP1上菌落颜色白色， ISP2上菌落卵 石灰， ISP3 上亮象牙色， 圆形， 中间稍凸起， 多皱， 直径大小为中型 ( 约 6mm 左右 )， 除 ISP1 外， 孢子量丰富， 基内菌丝发达， 菌丝与培养基结合紧密， 不易挑起。在 ISP1， ISP2 培养基上 无色素产生， 在 ISP3 上有土黄灰色色素产生。 0010 本发明描述了链霉菌 HS7522 的形态学和分子水平上的特征， 经过和已知米尔贝 霉素生产菌进行形态学和分子水平的比较， 可以认定链霉菌 HS7522 属吸水链霉菌。链霉 菌 H。

12、S7522 与 Streptomyces sp.NRRL 5739 16s rRNA 同源性 99.5， 与 Streptomyces bingchenggensis BCW-1 同源性 99.9。本菌株与多数米尔贝生产菌在形态上最大的差异 在于其他菌种如 Streptomyces sp.CGMCC 7677 的菌落在生产平板上会分泌金黄泪珠体于 菌落表面。而 HS7522 在同样的培养基上颜色鼠灰， 表面无泪珠 ( 见附图 1)。 0011 本发明的还提供了一种采用链霉菌HS7522(CGMCC NO.9671)制备米尔贝霉素的方 法。该方法包括采用链霉菌 HS7522(CGMCC NO.9。

13、671) 在含有可同化的碳、 氮源的营养培养 基里， 进行有氧发酵的过程。 0012 优选的实施方案中， 上述可同化的碳源优选自淀粉、 糊精、 葡萄糖、 工业糖蜜、 甘 油、 蔗糖、 乳糖、 麦芽糖、 海藻糖、 木聚糖、 甘露醇、 山梨醇之一或上述物质的组合。 0013 优选的实施方案中， 上述可同化的氮源优选自酵母抽提物、 酵母粉、 牛肉浸膏、 胰 蛋白胨、 蛋白胨、 脱脂奶粉， 全脂奶粉， 黄豆饼粉、 棉籽饼粉、 花生饼粉、 麸质粉、 玉米浆干粉、 麸皮、 尿素、 铵盐之一或上述物质的组合。 0014 优选的实施方案中， 所述发酵培养的温度优选为 20 -40， 优选 25 -35， 培 。

14、养基 pH 为 6.0-8.0， 优选 7.0 左右 ； 培养时间为 300-360 小时 ； 通氧量为 0.5-1.0vvm。 0015 所述发酵方式为液体深层发酵。 0016 米尔贝霉素可以通过以下方法进行检测 ： 0017 取发酵液 0.5ml， 加入 4.5ml 75乙醇， 混合均匀， 3000rpm、 15 分钟离心， 取上层 液进样。 0018 HPLC 柱 ： Zorbex RX-C8 ； 150mm*4.6mm ； 5m 说 明 书 CN 106148215 A 4 3/10 页 5 0019 紫外吸收波长 ： 240nm 0020 温度控制 ： 摄氏 22 度 0021 HP。

15、LC 流动相条件 ： 梯度洗脱 0022 0023 0024 进样量 ： 10l 0025 本发明采用的米尔贝霉素产生菌为链霉菌 HS7522(CGMCC NO.9671)、 链霉菌 HS7522(CGMCC NO.9671) 自发的突变株或通过常规的诱变得到的突变株。 0026 本发明的主要优点在于 ： 0027 1. 本发明提供了一种生产米尔贝霉素的新菌链霉菌 HS7522 及其生产米尔贝霉素 的方法。本发明链霉菌 HS7522 的特点在于其发酵液中米尔贝霉素 A4 的含量占 A3 和 A4 总 含量的百分比大于 80， 且米尔贝霉素 A4 的单位产量可以达到大于 4000ug/ml， 米。

16、尔贝霉 素 A3+A4 的单位产量可以达到大于 5000ug/ml， 发酵单位高， 杂质含量低。 0028 2.由于本发明所述的链霉菌HS7522通过发酵方法提高米尔贝霉素A4在发酵产物 中的比例， 降低了制备米尔贝霉素 A4 单一组分的难度， 有利于降低生产成本和扩大米尔贝 霉素 A4 单组分的应用范围。 0029 3.提高了米尔贝霉素A4发酵单位。 本发明所述的链霉菌HS7522生产米尔贝霉素 A4 的效价较原始菌 Streptomyces milbemycinicus CGMCC NO.7677 大幅提高， 有利于实现 产业化生产。 附图说明 ： 0030 图 1 ： 本 发 明 链 霉。

17、 菌 HS7522 菌 株 的 菌 落 形 态 与 链 霉 菌 Streptomyces milbemycinicus NO.CGMCC 7677 对比图， 其中 B 为链霉菌 Streptomyces milbemycinicus NO.CGMCC 7677 菌落形态， A 为本发明链霉菌 HS7522 菌落形态。 0031 图 2 ： 本发明链霉菌 HS7522 在实施例 6 的 50L 发酵罐中生产米尔贝霉素 A3 和 A4 的发酵曲线。 0032 图3 ： 本发明链霉菌HS7522在实施例6条件下产生的米尔贝霉素A4的HPLC图谱， 说 明 书 CN 106148215 A 5 4/1。

18、0 页 6 米尔贝霉素 A4 含量为 4100mg/L， A3 含量 962mg/L， 米尔贝霉素 A4 的含量占 A3 和 A4 总含 量的百分比为 81。 具体实施方式 0033 实施例 1 ： 菌株来源 0034 本发明链霉菌 Streptomyces hygroscopicus HS7522 系在米尔贝霉素产生菌种 Streptomyces milbemycinicus CGMCC 7677(见中国专利CN103789339A)的基础上， 通过多 轮的诱变选育 ( 包括 NTG， EMS， UV 等诱变手段 ) 得到的米尔贝霉素 A4 高比例菌种。该菌种 与原始菌种相比， 其外观形态发。

19、生了较大的变化， 属于形态突变株。 0035 链霉菌 Streptomyces milbemycinicus CGMCC NO.7677 菌株在 ISP3 斜面培养基 中 28培养 10-12 天后， 在无菌条件下用接种铲将菌丝体刮下， 在磨口试管中磨碎菌丝体 并悬浮于无菌水中， 制得菌悬液， 采用 NTG( 亚硝基胍 )， EMS( 甲基磺酸乙酯 )， UV( 紫外线 ) 诱变处理。 0036 称取 NTG 晶体 10mg， 溶解在 10ml 无菌 Tris 缓冲液 (pH8.0) 中， 再用移液管加入 1ml菌悬液， 置于28培养基中旋转式或往复式摇床上振荡处理30min。 将处理过的菌悬。

20、液 经适当稀释涂布于 ISP3 平板上。未作诱变处理的菌悬液亦经适当稀释涂布于 ISP3 平板作 为对照。28培养 10 天后， 检查菌落数， 并计致死率。 0037 取 10-1或 10 -2梯度的单细胞菌悬液 5ml-10ml 到带一根回形针的平板内 ( 直径 9cm)， 置 UV 诱箱内 , 置磁力搅拌器上， 开盖于 UV15W， 30cm 处照射数分钟 ( 一般 2-5 分钟 )， 边照边搅拌， 照后用黑布包好 . 然后用生理盐水 (0.9氯化钠溶液 ) 稀释 10-210-7， 分别 涂 ISP3 平板得诱变组。 0038 吸取 1ml EMS 溶于 2ml 无水乙醇中， 再加入 2。

21、2ml， pH7.2 的 0.1mol/L 磷酸缓冲液。 取 10-1或 10 -2梯度的单细胞菌悬液 5ml 到带一根回形针的平板内， 加入 5ml， 4.0 EMS 溶 液， 最后 EMS 溶液浓度为 2.0， 置磁力搅拌器上， 搅拌处理 20 分钟至 60 分钟。诱变平板内 加入 10ml 5的硫代硫酸钠即可中止反应， 用生理盐水依次稀释 10-210-7， 涂 ISP3 平板 得诱变组。 0039 挑选经过多轮上述单个或组合诱变后的单菌落不少于 10000 株， 进行摇瓶 发酵， HPLC 检测米尔贝霉素的产量。经过多轮诱变， 筛选出突变菌株 Streptomyces hygrosco。

22、picus HS7522。 0040 实施例 2 ： 链霉菌 HS7522 菌种培养特征 0041 参照 链霉菌鉴定手册 、放线菌的分类与鉴定 、常见细菌系统鉴定手册 中的 有关内容进行实验。 0042 采用 ISP1、 ISP2、 ISP3、 ISP4、 ISP5、 高氏一号、 苹果酸钙、 营养琼脂、 YMS 和查氏十 种培养基， 28培养 7 10 天后， 观察菌丝体的颜色及色素情况 ( 培养特征见表 1)。 0043 表 1 链霉菌 HS7522 在 10 种培养基上的培养特征 0044 说 明 书 CN 106148215 A 6 5/10 页 7 0045 备注 ： 表 1 中 “/。

23、” 为不产生色素。 0046 实施例 3 ： 生理生化试验 0047 参照 链霉菌鉴定手册 、放线菌的分类与鉴定 、常见细菌系统鉴定手册 中的 有关内容进行实验。除温度实验外， 均为 28培养 7 10 天。 0048 1) 碳源的利用 ： 采用 ISP9 作为基础培养基， 各种碳源的终浓度均为 1.0。( 结 果见表 2) 0049 2) 无机氮源的利用 ： 采用 ISP9 作为基础培养基， 硝酸钾和硫酸铵的浓度均为 0.1。( 结果见表 2) 0050 3) 降解试验和 NaCl 耐受实验 ( 结果见表 7) 采用基础培养基为 GYEA(pH6.8)， 各 种降解物的浓度见表 3。( 结果。

24、见表 3) 0051 4) 氧化酶和过氧化氢酶试验 ( 结果见表 4)、 pH 试验 ( 结果见表 5) 和温度试验 ( 结果见表 6) 均采用 YMS 培养基。 0052 表 2 链霉菌 HS7522 菌株的碳源和氮源的利用情况 0053 说 明 书 CN 106148215 A 7 6/10 页 8 0054 表 3 链霉菌 HS7522 菌株的降解试验结果 0055 0056 表 4 链霉菌 HS7522 菌株主要的生理生化特征 0057 0058 0059 表 5 链霉菌 HS7522 菌株生长的 pH 试验 0060 0061 表 6 链霉菌 HS7522 菌株生长的温度试验 006。

25、2 0063 表 7 链霉菌 HS7522 菌株对 NaCl 的耐受性 0064 说 明 书 CN 106148215 A 8 7/10 页 9 0065 备注 ： 表 2-7 中， 0 ： 无生长 ； 1 ： 生长很弱 ； 2 ： 能生长， 有少量孢子 ； 3 ： 生长良好， 有 大量孢子 ； 4 ： 生长最好， 有丰富孢子 ； + ： 阳性 ； - ： 阴性。 0066 实施例 4 ： 16S rDNA 序列分析 0067 收集在 ISP2 上生长好的本发明菌丝体， 接于含玻璃珠的 TSB 液体培养基中， 置于 28的培养箱中， 250r/min 震荡培养 2-4d。离心收集菌丝体， 用无。

26、菌水洗涤 2 次后保存于 4备用。 0068 (1) 菌丝体 1000rpm 离心 1min。 0069 (2) 加终浓度为 3-4mg/ml 的溶菌酶溶液 ( 菌丝体体积 : 溶菌酶溶液体积 1:5-10)， 37水浴 1-3hr。 0070 (3) 加 50-100ug/ml 蛋白酶 K 及 1 SDS， 37水浴 0.5-3h。 0071 (4) 加等体积的中性酚 / 氯仿， 振荡 30sec， 12000rpm 离心 5min。 0072 (5) 上清加 1/10 体积的 3M NaAc 溶液和等体积的异丙醇， 混匀。室温放置 5min， 12000rpm 离心 5min。 0073 。

27、(6) 沉淀用 70乙醇洗涤 2 遍， 干燥后溶于 TE/RNase。 0074 (7) 将提取的基因组作为模板， 采用通用引物进行 PCR 扩增。 0075 上游引物 27F 为 5 -GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 0076 下游引物 1495R 为 5 -CTACGGCTACCTTGTTACGA-3 0077 反应在 PCR 扩增仪上进行。其程序是 ： 95预变性 5min， 94变性 45s， 55复性 45s， 72延伸 90s， 进行 30 个循环， 72延伸 10min。反应体系如下 ： 0078 0079 用 0.8琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物。选用条带清晰。

28、的产物进行纯化。扩增产 物经凝胶电泳回收， 并连接到T载体后进行测序， 获得了该菌株16S rDNA一级结构的序列。 通过在 Genebank 数据库中进行相似性搜索 (blast)， 结果显示与 Streptomyces sp.NRRL 573916s rRNA 同源性 99.5， 与 Streptomyces bingchenggensis BCW-1 同源性 99.9。 0080 表 8 链霉菌 HS7522 和相关菌株的同源性 0081 说 明 书 CN 106148215 A 9 8/10 页 10 0082 链霉菌 HS7522 与已知的米尔贝霉素产生菌的比较 0083 据 CN1。

29、01100651A 报 道，米 尔 贝 霉 素 产 生 菌 冰 城 链 霉 菌 (streptomyces bingchengsis sp.nov)CGMCC NO.1734 在高氏一号培养基上菌落表面灰色 ( 有黑色吸水 斑)， 菌落背面黄灰色， 有黄褐色色素产生。 而本发明链霉菌HS7522在高氏一号培养基上菌 落表面白色， 菌落背面米褐色， 无色素产生。 0084 据 US3950360 报道， 米尔贝霉素产生菌 Streptomyces NRRL NO.5739 在 ISP2 培养 基上气生菌丝灰色， 背面黄褐色， 菌落表面有许多黄色泪珠， 有黄色色素产生 ； 在 ISP4 培养 基上。

30、气生菌丝灰色， 背面土黄， 菌落表面也有许多黄色泪珠， 有明亮的橄榄绿会色素产生， 能够利用阿拉伯糖和木糖。而本发明链霉菌 HS7522 在 SP2 培养基上气生菌丝卵石灰， 背面 米红色， 菌落表面无泪珠， 无色素产生 ； 在 ISP4 培养基上气生菌丝象牙色， 背面象牙色， 菌 落表面无泪珠， 无色素产生， 不能利用阿拉伯糖和木糖。 0085 综上所述， 本发明链霉菌 HS7522 属于链霉菌属， 但它不同于已知的米尔贝霉素产 生菌 Streptomyces NRRL NO.5739， 菌冰城链霉菌 (streptomyces bingchengsis sp.nov) CGMCC NO.1。

31、734， 链霉菌 HS7522 是一株全新的菌种。 0086 实施例 5 ： 制备米尔贝霉素 A4 0087 (1) 斜面菌丝体的制备与培养 0088 斜面孢子培养基配方 (g/L) ： 酵母抽提物 2， 麦芽抽提物 2， 蔗糖 10， 脱脂奶粉 1.2， 琼脂 20， 消前 pH 7.0-7.2， 试管 30200mm， 装量 20mL， 经 121灭菌 20 分钟后， 冷却到 50-60摆斜面， 接入一环菌丝体经 281培养 10 天后， 菌丝成熟。 0089 (2) 种子液的制备与培养 0090 种子培养基配方 (g/L) ： 酵母抽提物 5， 蛋白胨 5， 蔗糖 20， 脱脂奶粉 3，。

32、 磷酸氢二钾 0.8， 消前 pH6.8-7.2， 摇瓶装液量为 250mL 三角瓶装 30mL， 经 121灭菌 20 分钟。菌体接种 量为 105-106c.f.u./mL， 培养温度 281， 250rpm， 摇床振荡培养 48 小时。 0091 (3) 米尔贝霉素 A4 发酵培养基的制备与培养 0092 发酵培养基配方 (g/L) ： 酵母抽提物 5， 蔗糖 100， 脱脂奶粉 11， 黄豆饼粉 10， 棉籽 饼粉14， 磷酸氢二钾1， 七水硫酸亚铁0.1， 硫酸锌0.02， 碳酸钙5， 硫酸铜0.05， 钼酸钠0.5， 摇瓶装液量为 250mL 三角瓶装 30mL， 经 121灭菌 。

33、20 分钟。将种子液以 10 ( 体积百分 比 ) 的接种量接入， 在 281， 250rpm 摇床振荡培养 14 天， 发酵结束后， 发酵液经 HPLC 测 定， 测得米尔贝霉素A4含量为3900mg/L， A3含量为967mg/L， 米尔贝霉素A4的含量占A3和 A4 总含量的百分比为 80.1。实施例 6 ： 制备米尔贝霉素 A4 0093 (1) 种子罐种子液的制备 说 明 书 CN 106148215 A 10 9/10 页 11 0094 在15L种子罐中投入10L的种子培养基(种子培养基的配比见实施例5， 同时添加 0.25的泡敌作消泡剂 )， 灭菌采用蒸汽灭菌， 121条件下 。

34、30 分钟， 待冷却后， 接入 200ml 摇瓶种子液， 培养温度 281， 搅拌转速 150rpm， 通气量 1vvm， 培养 48 小时。 0095 (2) 发酵罐培养基的配制与培养 0096 发酵培养基的配方与前述实施例 5 相同， 但要添加 0.25泡敌作为消泡剂， 发酵 罐50L， 投料体积为35L， 消前pH7.0-7.6， 于121下蒸汽灭菌25分钟， 冷却后， 接入约3.5L 种子罐培养液， 发酵温度 281， 搅拌桨转速底限 150rpm， 与溶氧关联， 溶氧不低于 35。 通气量为 0.6vvm， 发酵培养 14 天， 放罐， 发酵液经 HPLC 测定， 测得米尔贝霉素 A。

35、4 含量为 4100mg/L， A3 含量为 962mg/L， 米尔贝霉素 A4 的含量占 A3 和 A4 总含量的百分比为 81。 0097 实施例 7 ： 制备米尔贝霉素 A4 0098 (1) 种子罐种子液的制备 0099 在 15T 种子罐中投入 8T 的种子培养基 ( 种子培养基的配比见实施例 5， 同时添加 0.25的泡敌作消泡剂 )， 灭菌采用蒸汽灭菌， 121条件下 35 分钟， 消后体积 10T， 待冷却 后， 接入2L摇瓶种子液， 培养温度281， 搅拌转速100rpm， 通气量0.8vvm， 培养48小时。 0100 (2) 发酵罐培养基的配制与培养 0101 发酵培养基。

36、的配方与前述实施例 5 相同， 但要添加 0.3泡敌作为消泡剂， 发酵罐 70T， 投料体积为55T， 消前pH6.8-7.6， 于121下蒸汽灭菌35分钟， 冷却后， 接入约6T种子 罐培养液， 发酵温度 281， 搅拌桨转速底限 50rpm， 与溶氧关联， 溶氧不低于 35。通气 量为0.5vvm， 发酵培养14天， 放罐， 发酵液经HPLC测定， 测得米尔贝霉素A4含量为4020mg/ L， A3 含量为 961mg/L， 米尔贝霉素 A4 的含量占 A3 和 A4 总含量的百分比为 80.7。 0102 实施例 8 ： 制备米尔贝霉素 A4 0103 种子培养基配方 (g/L) ： 酵。

37、母浸粉 5， 蛋白胨 5， 蔗糖 40， 磷酸氢二钾 0.5， 消前 pH7.0-7.4。摇瓶装液量为 250mL 三角瓶装 25mL， 经 121灭菌 20 分钟。从实施例 5 中的斜 面上挖取12cm面积的菌块接入种子瓶中， 281下培养45hr。 取上述种子培养液2.5mL 接入发酵培养基 ： 酵母膏 12， 糖蜜 200， 脱脂奶粉 11， 黄豆饼粉 11， 棉籽饼粉 11， 磷酸氢二钾 1， 七水硫酸亚铁 0.1， 硫酸锌 0.02， 碳酸钙 5， 硫酸铜 0.05， 钼酸钠 0.5， 摇瓶装液量为 250mL 三角瓶装 30mL， 经 121灭菌 20 分钟， 在 281， 250。

38、rpm 摇床振荡培养 14 天， 发酵结束， 发酵液经 HPLC 测定， 测得米尔贝霉素 A4 的含量为 3960mg/L， A3 含量为 929mg/L， 米尔贝霉 素 A4 的含量占 A3 和 A4 总含量的百分比为 81。 0104 实施例 9 ： 制备米尔贝霉素 A4 0105 种子液按实施例8进行， 然后2.5mL种子液接入发酵培养基 ： 蛋白胨10， 蔗糖140， 玉米浆 10， 黄豆饼粉 10， 麸质粉 15， 磷酸氢二钾 1， 七水硫酸亚铁 0.1， 硫酸锌 0.02， 碳酸钙 5， 硫酸铜 0.05， 钼酸钠 0.5， 摇瓶装液量为 250mL 三角瓶装 30mL， 经 12。

39、1灭菌 20 分钟， 在 281， 250rpm 摇床振荡培养 14 天， 发酵结束后， 发酵液经 HPLC 测定， 测得米尔贝霉素 A4 的含量为 4100mg/L， A3 含量为 900mg/L， 米尔贝霉素 A4 的含量占 A3 和 A4 总含量的百分比 为 82。对比实施例 1 ： 本发明链霉菌 HS7522 与原始菌 CGMCC 7677 生产米尔贝霉素的对 比实验 0106 (1) 斜面， 种子， 发酵培养基组成和培养条件同实施例 5， 菌种采用原始菌 CGMCC 7677， 进行五组平行发酵培养， 发酵结束后， 发酵液经HPLC测定， 测得米尔贝霉素A4的平均 说 明 书 CN 。

40、106148215 A 11 10/10 页 12 含量为 729mg/L， A3 的平均含量为 297mg/L， 米尔贝霉素 A4 的含量占 A3 和 A4 总含量的百 分比为 71。 0107 (2) 斜面， 种子， 发酵培养基组成和培养条件同实施例 5， 菌种采用本发明链霉菌 HS7522， 进行五组平行发酵培养， 发酵结束后， 发酵液经HPLC测定， 测得米尔贝霉素A4的平 均含量为 4016mg/L， A3 的平均含量为 942mg/L， 米尔贝霉素 A4 的含量占 A3 和 A4 总含量的 百分比为 81。 说 明 书 CN 106148215 A 12 1/2 页 13 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 106148215 A 13 2/2 页 14 图 3 说 明 书 附 图 CN 106148215 A 14 。