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1、(10)授权公告号 CN 101880686 B (45)授权公告日 2012.05.23 CN 101880686 B *CN101880686B* (21)申请号 201010223264.5 (22)申请日 2010.07.12 C12N 15/82(2006.01) A01H 4/00(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (73)专利权人 山东大学 地址 250100 山东省济南市历城区山大南路 27 号 (72)发明人 向凤宁 姬丹丹 王鹏 (74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 37221 代理人 李健康 (54) 发明名称 大豆萌动胚真空渗透辅助。
2、的外源基因转化方 法 (57) 摘要 本发明公开了一种大豆萌动胚真空渗透辅助 的外源基因转化方法， 所述方法包括以下步骤 ： (1) 种子的消毒及预培养处理 (2) 种子胚膨大萌 动后经切割， 暴露或损伤萌动胚部位 (3) 含有目 的基因的农杆菌侵染萌动胚 (4) 共培养 (5) 丛生 芽再生、 筛选及小苗生根、 筛选 (6) 丛生芽再生、 筛选及小苗生根、 筛选。 本发明方法适用于多种基 因型， 且再生速度快， 是一个能够用于大豆转基因 育种的可靠体系。 (51)Int.Cl. 审查员 安玉苹 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发。
3、明专利 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 4 页 1/1 页 2 1. 大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法， 步骤包括 ： 1) 种子的消毒及预培养处理 ； 2) 种子胚膨大萌动后经切割， 暴露或损伤萌动胚部位 ； 3) 真空渗透辅助法将含有目的基因的农杆菌侵染萌动胚 ； 4) 共培养 ； 5) 丛生芽再生、 筛选及小苗生根、 筛选 ； 6) 小苗壮苗及移栽 ； 其特征在于 ： 步骤 1) 所述预培养培养基配方为 ： MS+3.2mg/L 6- 苄氨基腺嘌呤 +20g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂， pH5.8 ； 步骤 2) 所述种子胚膨大萌动后经切割， 暴露或损伤萌动胚部位是 。
4、的方法是 ： 当预培养的大豆胚整体膨大、 胚根长至 0.50.1mm， 未突破种皮时， 剥去种皮， 切去胚根， 保留胚芽、 胚轴及 1/2 的子叶， 同时用解剖针在胚芽尖处刺针， 使针眼布满胚芽 尖 ； 步骤3)所述真空渗透辅助法将含有目的基因的农杆菌侵染萌动胚的方法是 ： 将步骤2) 处理后的大豆胚浸在OD600为0.6-0.8并加入30mg/L乙酰丁香酮的农杆菌悬液中， 抽真空并 维持0.05MPa压力5-8分钟， 然后置黑暗下28、 200r/min振荡培养15-20分钟 ； 步骤4)所 述共培养的方法是 ： 将步骤 3) 处理后的大豆胚切面朝下置于共培养培养基上， 25 -28 下暗培。
5、养 3-4 天， 其中所述共培养培养基配方为 ： MS+30mg/L 乙酰丁香酮 +20g/L 蔗糖 +7g/ L 琼脂， pH5.8 ； 步骤 5) 所述丛生芽再生、 筛选及小苗生根、 筛选的方法是 ： 将步骤 4) 所述 暗培养后的大豆胚用无菌水清洗 3-4 次， 再用无菌滤纸吸干， 转接至丛生芽诱导筛选培养 基上， 在 25 -28、 且每日光照 14-15 小时条件下， 连续培养 202 天， 分化出丛生芽 ； 选 长至1-2cm的丛生芽， 将小芽单独剪下， 转移到生根筛选培养基上， 在25-28、 且每日光 照 14-15 小时条件下， 培养 141 天， 进行生根及筛选， 其中所述。
6、丛生芽诱导筛选培养基配 方为 ： MS+3.2mg/L 6- 苄氨基腺嘌呤 +0.35mg/L 吲哚乙酸 +15mg/L 卡那霉素 +200mg/L 头孢 噻肟钠 +20g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂， pH5.8， 所述生根筛选培养基配方为 ： MS+0.5mg/L 乙哚丁酸 +25mg/L 卡那霉素 +200mg/L 头孢噻肟钠 +20g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂， pH5.8 ； 步骤 6) 所述小苗 壮苗的方法是 ： 选步骤5)所述生根的小苗转移到壮苗培养基上， 在25-28、 且每日光照 14-15 小时条件下， 培养 7-10 天， 其中所述壮苗培养基配方为 ： MS+2.2mg。
7、/L 激动素 +0.5mg/ L- 萘乙酸 +20g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂， pH5.8。 权 利 要 求 书 CN 101880686 B 2 1/8 页 3 大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法 技术领域 0001 本发明涉及一种大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法， 属于植物基因工 程领域。 背景技术 0002 大豆是重要的经济作物， 因此提高和优化大豆品质成为人们关注的热点。建立一 个良好的组培再生系统， 是大豆遗传转化成功的前提。虽然目前转基因大豆在全球已经大 规模种植， 其遗传转化仍然是基因工程领域的难点之一。大豆遗传转化系统局限于农杆菌 介导的子叶节转化系统和胚芽转。
8、化系统。这几种转化系统都存在转化频率低、 难于重复及 依赖于特定的基因型等问题。 大豆基因转移和功能基因组学的进步因而受到目前的转化系 统限制。 0003 农杆菌是一种土壤寄生菌， 具有天然感染植物细胞的能力， 农杆菌介导的遗传 转化已经广泛应用于单子叶和双子叶植物中。目前应用的农杆菌主要有根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) 和发根农杆菌 (Agrobacterium rhizogenes)， 在植物基因 工程中， 利用根瘤农杆菌介导的遗传转化最多。根癌农杆菌具有趋化性， 侵染受体时， 在植 物受伤组织产生的一些糖类和酚类物质诱导下， 向受伤组织集中， 通过供体。
9、和受体特异互 作， 农杆菌细胞识别并附着到植物细胞表面， 将 Ti 质粒上的一段 T-DNA 片段导入植物细胞 并整合到植物基因组中。这个转化过程主要包括 ： 农杆菌积聚、 农杆菌致毒系统的诱导、 T-DNA 转移复合物的形成、 T-DNA 转入并整合到植物基因组， 植物受伤后产生的酚类诱导物 主要为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮， 这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成， 通常不 存在于单子叶植物中， 一些中性糖 ( 如 L- 阿拉伯糖、 D- 木糖等 ) 对农杆菌也有诱导作用。 这些酚类物质和糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物， 又可以作为农杆菌中 Ti 质粒 上 Vir 区 ( 毒性区 ) 。
10、基因的诱导物， 使 Vir 区基因活化， 促使 T-DNA 的加工和转移， 从而侵 染植物细胞。 0004 1988 年 H inchee 等首次用农杆菌介导法获得大豆转基因植株。从 100 个栽培品 种中筛选到对农杆菌敏感的品种 Peking， 用农杆菌转化其子叶外植体， 经检测再生植株中 仅有 6为转基因植株。2001 年 Clement 等也使用了与 Hinche 等相似的方法， 以草甘麟作 为筛选剂， 获得了 196 个转基因植株。1996 年 Di 等用农杆菌 / 子叶节系统以卡那霉素为 筛选剂将 BPMV(bean pod mottle virus) 外壳蛋白基因转人大豆。2000。
11、 年 Donaldson 等 用农杆菌转化 12 个短季大豆品种子叶节， 感染率可达 92， 但仅从品种 Accolibri 得到了 遗传稳定的转基因植株， 且转化率极低。2001 年 P.M.olhoft 等发现在固体共培养培养基 中加入 L- 半胧氨酸 (L-Cys) 能大大提高农杆菌对子叶节区的感染率。1989 年 Parrott 等 用14个大豆品种的未成熟子叶为外植体， 接种土壤农杆菌EHA 101或LBA4404， 两株菌都含 有质粒 pH5PZ3D， 该质粒带有 15kD 的玉米醇溶蛋白基因 (zein) 和新霉素磷酸转移酶基因 (apt II)， 得到 3 株转基因植株。200。
12、0 年 B.Ya n 等利用根癌农杆菌感染大豆未成熟子叶， 通过体细胞胚发生过程得到 3 株转基因植株， 转化效率为 0.03。这一系统的转化效率仍 说 明 书 CN 101880686 B 3 2/8 页 4 很低。最近， 人们又发现了一些新的转化方法 ： 超声辅助农杆菌转化法 (SAAT)、 真空抽滤辅 助农杆菌转化完整植株法、 微粒轰击与农杆菌综合法等， 但大豆转化的频率仍很低， 远未达 到模式化水平， 还存在着重复性差， 受大豆基因型限制的缺点， 因此， 尚需深入研究。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法。 0006 本发明所述大豆萌动胚。
13、真空渗透辅助的外源基因转化方法包括 ： 种子的消毒及预 培养处理 ； 种子胚膨大萌动后经切割， 暴露或损伤萌动胚部位 ； 真空渗透辅助法将含有目 的基因的农杆菌侵染萌动胚 ； 共培养 ； 丛生芽再生、 筛选及小苗生根、 筛选 ； 小苗壮苗及移 栽。具体是 ： 0007 (1) 种子消毒及预培养处理 0008 将大豆种子用 70乙醇消毒 5 分钟， 去净乙醇后用 0.1 HgCl2消毒 10 分钟， 无 菌水冲洗 5-6 遍， 在 25 -28下无菌水浸种 12 小时。 0009 将浸种后胚膨大萌动的大豆放入预培养培养基， 28、 光培养 1 天， 其中所述预 培养培养基配方为 ： MS+3.0。
14、-3.5mg/L 6-BA(6- 苄氨基腺嘌呤 )+20g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂， pH5.8。 0010 (2) 种子胚膨大萌动后经切割， 暴露或损伤萌动胚部位 0011 当预培养的大豆胚整体膨大、 胚根长至 0.50.1mm， 未突破种皮时， 剥去种皮， 切 去胚根， 保留胚芽、 胚轴及 1/2 的子叶， 同时用解剖针在胚芽尖处刺针， 使针眼布满胚芽尖。 0012 (3) 真空渗透辅助法将含有目的基因的农杆菌侵染萌动胚 0013 将 4保存的带有植物表达载体的农杆菌在添加了 50mg/L 利福平的 YEP 固体培 养基上划线， 28黑暗培养 3 天后挑取单菌落， 接入含有 50mg/。
15、L 利福平的 YEP 液体培养基， 黑暗下 28、 200r/min 振荡培养 24 小时后再次转接， 相同条件下培养 16 小时。将菌液置 于灭菌的离心管中， 5000rpm 离心 5 分钟收集菌体， 用侵染液重悬菌体， 调整至 OD600值为 0.6-0.8， 加入 30mg/L 乙酰丁香酮， 备用 ； 其中所述侵染液配方为 ： 0.1MS 大量元素 +0.1MS 微量元素 +B 5 维生素 +0.5MES+1葡萄糖 +2蔗糖， pH5.4。 0014 将步骤 2) 处理后的大豆胚浸在 OD600为 0.6-0.8 并加入 30mg/L 乙酰丁香酮的农 杆菌悬液中， 抽真空并维持 0.05。
16、MPa 压力 5-8 分钟， 然后置黑暗下 28、 200r/min 振荡培养 15-20 分钟。 0015 (4) 共培养 0016 将步骤 (3) 的大豆取出， 用无菌滤纸吸去多余菌液， 切面朝下置于共培养培养基 上， 25 -28下暗培养 3-4 天 ； 其中所述共培养培养基配方为 ： MS+30mg/L 乙酰丁香酮 +20g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂， pH5.8。 0017 (5) 丛生芽再生、 筛选及小苗生根、 筛选 0018 将步骤 4) 所述暗培养后的大豆胚用无菌水清洗 3-4 次， 再用无菌滤纸吸干， 转 接至丛生芽诱导培养基上， 在 25 -28、 且每日光照 14 小时。
17、条件下， 每两周换至新的 培养基， 连续培养 202 天， 分化出丛生芽。其中所述丛生芽诱导筛选培养基配方为 ： MS+3.0-3.5mg/L 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)+0.2-0.5mg/L IAA(吲哚乙酸)+15mg/L卡那霉素 +200mg/L 头孢噻肟钠 +20g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂， pH5.8。 说 明 书 CN 101880686 B 4 3/8 页 5 0019 选筛选后长至 1-2 厘米的丛生芽， 将小芽单独剪下， 转移到生根筛选培养基上， 在 25-28、 且每日光照141小时条件下， 连续培养14天。 其中所述生根筛选培养基配方 为 ： MS+0.4-0.6。
18、mg/L IBA( 乙哚丁酸 )+25mg/L 卡那霉素 +200mg/L 头孢噻肟钠 +20g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂， pH5.8。 0020 (6) 小苗壮苗及移栽 0021 选步骤 5) 所得的根系生长良好的小苗转移到壮苗培养基上， 在 25 -28且每 日光照 14-15 小时条件下， 培养 7-10 天 ； 其中所述壮苗培养基配方为 ： MS+2.0-2.5mg/L KT( 激动素 )+0.4-0.6mg/L NAA(- 萘乙酸 )+20g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂， pH5.8。 0022 当小苗经筛选存活、 且根系生长良好后， 将其不伤及根部取出， 除去残存培养基移 入土。
19、壤， 用薄膜覆盖花盆以提高湿度。 0023 上述大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法中 ： 所述预培养培养基配方优 选为 MS+3.2mg/L 6- 苄氨基腺嘌呤 +20g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂， pH5.8。 0024 上述大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法中 ： 所述丛生芽诱导筛选培 养基配方优选为 MS+3.2mg/L 6- 苄氨基腺嘌呤 +0.35mg/L 吲哚乙酸 +15mg/L 卡那霉素 +200mg/L 头孢噻肟钠 +20g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂， pH5.8。 0025 上述大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法中 ： 生根筛选培养基配方优选 为 MS+。
20、0.5mg/L 乙哚丁酸 +25mg/L 卡那霉素 +200mg/L 头孢噻肟钠 +20g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂， pH5.8。 0026 上述大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法中 ： 壮苗培养基配方优选为 MS+2.2mg/L 激动素 +0.5mg/L- 萘乙酸 +20g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂， pH5.8。 0027 当小苗在土壤中长出 4-7 片新叶， 剪取 2-3 片新叶用 CTAB 法提取 DNA 检测。 0028 大豆叶片经液氮研磨后迅速转移至 1.5ml 离心管中， 加入 600l 65预热的 2CTAB 提取缓冲液， 颠倒离心管混匀， 65水浴 30 分钟。混。
21、合物冷却至室温后加入等体 积的酚氯仿异戊醇 ( 体积比 25 24 1)， 混匀后 12000rpm 离心 10 分钟， 上清液转 移至新管， 加入等体积氯仿异戊醇 ( 体积比 24 1)， 混匀后 12000rpm 离心 10 分钟， 上 清液转移至新管， 加入三分之二体积预冷的异丙醇， 混匀， 12000rpm 离心 10 分钟， 弃去上清 液， 70乙醇不打散沉淀洗涤 3 次， 弃去乙醇将沉淀晾干， 用 30l 双蒸水溶解后 PCR 检测。 0029 本发明所述真空渗透辅助的大豆萌动胚外源基因转化方法的特点和有益效果 是 ： 0030 (1) 丛生芽再生速度快， 转化周期短， 从大豆预处。
22、理开始 60-70 天即可获得转基因 植株 ； 0031 (2) 以萌动胚为外植体诱导丛生芽可以避免愈伤组织培养中引起的不良变异 ； 0032 (3) 本发明的萌动胚丛生芽再生体系再生率高且适用于多种大豆品种 ( 例如 ： 冀 豆 12 号， 圣豆 9 号等 )， 适用性广， 克服了基因型对大豆遗传转化的限制 ； 0033 (4) 不可育的再生植株少 ； 0034 (5) 外植体来源广， 不受时间限制 ； 0035 (6) 操作比较简单， 易于掌握， 重复性好 ； 0036 (7) 转化频率高， 是一个能够用于大豆转基因育种的有效的体系。 说 明 书 CN 101880686 B 5 4/8 。
23、页 6 附图说明 0037 图 1 示 pK7WG2D 载体图 ( 含 snac1 和 snac6 基因 )。 0038 图 2 示大豆再生苗生根。 0039 图 3 示 pKGWFS7 载体图 ( 含 gus 基因 )。 0040 图 4 示转 gus 基因植株 PCR 阳性植株的 GUS 染色结果。 0041 图 5 转 snac1 基 因 植 株 35S 引 物 PCR 检 测 电 泳 图， 其 中 M 为 Marker(DNA/ HindIII-EcoRI)。 0042 图 6 示转 snac1 基因植株 snac1 基因引物 PCR 检测电泳图， 其中 M 为 Marker(DNA/。
24、 HindIII-EcoRI)。 0043 图 7 示示转 snac1 基因植株 snac1 基因在大豆中的非重复序列引物 PCR 检测电泳 图， 其中 M 为 Marker (DNA/HindIII-EcoRI)。 0044 图 8 示转 snac6 基因植株 35S 引物 PCR 检测电泳图， 其中 M 为 Marker(DNA/ HindIII-EcoRI)。 0045 图 9 示转 snac6 基因植株 snac6 基因引物 PCR 检测电泳图， 其中 M 为 Marker(DNA/ HindIII-EcoRI)。 0046 图 10 示转 snac6 基因植株 snac6 基因在大豆。
25、中的非重复序列引物 PCR 检测电泳 图， 其中 M 为 Marker (DNA/HindIII-EcoRI)。 具体实施方式 0047 实施例 1 ： 0048 以冀豆 12( 购买自潍坊农科院 ) 为受体材料， 转化菌株为携带 psnac1:K7WG2D 载 体的农杆菌菌株 AGL104( 载体购买自 Invitrogen 公司 )。 0049 (1) 种子消毒及预培养处理 0050 将大豆种子用 70乙醇消毒 5 分钟， 去净乙醇后用 0.1 HgCl2消毒 10 分钟， 无 菌水冲洗 5-6 遍， 在 25 -28下无菌水浸种 12 小时。 0051 将浸种后胚膨大萌动的大豆放入预培养。
26、培养基， 28、 光培养 1 天， 其中所述预培 养培养基配方为 ： MS+3.0mg/L 6-BA(6- 苄氨基腺嘌呤 )+20g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂， pH5.8。 0052 (2) 种子胚膨大萌动后经切割， 暴露或损伤萌动胚部位 0053 当预培养的大豆胚整体膨大、 胚根长至 0.50.1mm， 未突破种皮时， 剥去种皮， 切 去胚根， 保留胚芽、 胚轴及 1/2 的子叶， 同时用解剖针在胚芽尖处刺针， 使针眼布满胚芽尖。 0054 (3) 真空渗透辅助法将含有目的基因的农杆菌侵染萌动胚 0055 将4保存的带有植物表达载体的农杆菌在添加了50mg/L利福平的YEP固体培养 基上。
27、划线， 28黑暗培养 3 天后挑取单菌落， 接入含有 50mg/L 利福平的 YEP 液体培养基， 黑 暗下 28、 200r/min 振荡培养 24 小时后再次转接， 相同条件下培养 16 小时。将菌液置于 灭菌的离心管中， 5000rpm 离心 5 分钟收集菌体， 用侵染液重悬菌体， 调整至 OD600值为 0.6， 加入 30mg/L 乙酰丁香酮备用。其中所述侵染液配方为 ： 0.1MS 大量 +0.1MS 微量 +B 5 维生 素 +0.5MES+1葡萄糖 +2蔗糖， pH5.4。 0056 将步骤 (2) 的大豆浸入农杆菌菌液中， 抽真空并维持 0.05MPa 压力 5-8 分钟， 。
28、黑暗 下 28、 200r/min 振荡培养， 侵染 15-20min 钟。 说 明 书 CN 101880686 B 6 5/8 页 7 0057 (4) 共培养 0058 将步骤 (3) 的大豆取出， 用无菌滤纸吸去多余菌液， 切面朝下置于共培养培养基 上， 25-28下暗培养4天。 其中所述共培养培养基配方为 ： MS+30mg/L乙酰丁香酮+20g/ L 蔗糖 +7g/L 琼脂， pH5.8。 0059 (5) 丛生芽再生、 筛选及小苗生根、 筛选 0060 将共培养后的大豆用无菌水清洗 4 次， 再用无菌滤纸吸干， 转接至丛生芽诱导培 养基上， 在 25、 且每日光照 14 小时条件。
29、下， 每两周换至新的培养基， 连续培养 202 天， 分化出丛生芽。其中所述丛生芽诱导筛选培养基配方为 ： MS+3.0mg/L 6-BA(6- 苄氨基腺嘌 呤 )+0.2mg/L IAA( 吲哚乙酸 )+15mg/L 卡那霉素 +200mg/L 头孢噻肟钠 +20g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂， pH5.8。 0061 选筛选后长至 1-2 厘米的丛生芽， 将小芽单独剪下， 转移到生根筛选培养基上， 在 25、 且每日光照 141 小时条件下， 连续培养 14 天。其中所述生根筛选培养基配方为 ： MS+0.4mg/L IBA(乙哚丁酸)+25mg/L卡那霉素+200mg/L头孢噻肟钠+20。
30、g/L蔗糖+7g/L琼 脂， pH5.8。 0062 (6) 小苗壮苗及移栽 0063 选根系生长良好的小苗转移到壮苗培养基上， 在 25且每日光照 14 小时条件 下， 培养 7-10 天。当小苗经筛选存活、 且根系生长良好后， 将其不伤及根部取出， 除去残存 培养基移入土壤， 用薄膜覆盖花盆以提高湿度。其中所述壮苗培养基配方为 ： MS+2.0mg/ LKT( 激动素 )+0.4mg/L NAA(- 萘乙酸 )+20g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂， pH5.8。移栽成活率大 于 90。 0064 当小苗在土壤中长出 4-7 片新叶， 剪取 2-3 片新叶用 CTAB 法提取 DNA 检测。。
31、大豆 叶片经液氮研磨后迅速转移至1.5ml离心管中， 加入600l 65预热的2CTAB提取缓冲 液， 颠倒离心管混匀， 65水浴 30 分钟。混合物冷却至室温后加入等体积的酚氯仿异 戊醇 ( 体积比 25 24 1)， 混匀后 12000rpm 离心 10 分钟， 上清液转移至新管， 加入等体 积氯仿异戊醇(体积比241)， 混匀后12000rpm离心10分钟， 上清液转移至新管， 加入 三分之二体积预冷的异丙醇， 混匀， 12000rpm离心10分钟， 弃去上清液。 70乙醇不打散沉 淀洗涤 3 次， 弃去乙醇将沉淀晾干。用 30l 双蒸水溶解。 0065 PCR 法检测阳性转基因植株 ：。
32、 抗性植株总 DNA 分别用 35S 启动子引物、 snac1 基因 引物和 snac1 基因在大豆中的非重复序列引物进行 PCR 检测。 0066 0067 说 明 书 CN 101880686 B 7 6/8 页 8 0068 PCR 反应条件如下 ： 预变性 94 5min， 94 30sec， 52 -57 30min， 72 2min， 35 个循环， 72延伸 10min。PCR 产物用 1.0 Agrose 电泳鉴定。 0069 结果 ： 利用大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法， 对冀豆 12 进行了农杆 菌转化。三次生物学重复 ( 共 600 颗种子 ) 丛生芽芽再生获得。
33、 510 植株， 抗生素筛选具有 抗性植株 37 株。转基因阳性植株经 PCR 检测， 证明 27 株为阳性植株， 转化率为 5.3。 0070 实施例 2 ： 0071 以 圣 豆 9 号 ( 购 买 自 潍 坊 农 科 院 ) 为 受 体 材 料， 转 化 菌 株 为 携 带 有 psnac6:K7WG2D 的农杆菌 AGL104(p2K7GW7 载体购买自 Invitrogen 公司 )。 0072 (1) 种子消毒及预培养处理 0073 将大豆种子用 70乙醇消毒 5 分钟， 去净乙醇后用 0.1 HgCl2消毒 10 分钟， 无 菌水冲洗 5-6 遍， 在 25 -28下无菌水浸种 。
34、12 小时。 0074 将浸种后胚膨大萌动的大豆放入预培养培养基， 28、 光培养 1 天， 其中所述预培 养培养基配方为 ： MS+3.2mg/L 6-BA(6- 苄氨基腺嘌呤 )+20g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂， pH5.8。 0075 (2) 种子胚膨大萌动后经切割， 暴露或损伤萌动胚部位 0076 当预培养的大豆胚整体膨大、 胚根长至 0.50.1mm， 未突破种皮时， 剥去种皮， 切 去胚根， 保留胚芽、 胚轴及 1/2 的子叶， 同时用解剖针在胚芽尖处刺针， 使针眼布满胚芽尖。 0077 (3) 真空渗透辅助法将含有目的基因的农杆菌侵染萌动胚 0078 将4保存的带有植物表达载。
35、体的农杆菌在添加了50mg/L利福平的YEP固体培养 基上划线， 28黑暗培养 3 天后挑取单菌落， 接入含有 50mg/L 利福平的 YEP 液体培养基， 黑 暗下 28、 200r/min 振荡培养 24 小时后再次转接， 相同条件下培养 16 小时。将菌液置于 灭菌的离心管中， 5000rpm 离心 5 分钟收集菌体， 用侵染液重悬菌体， 调整至 OD600值为 0.7， 加入 30mg/L 乙酰丁香酮备用。其中所述侵染液配方为 ： 0.1MS 大量 +0.1MS 微量 +B5 维生 素 +0.5MES+1葡萄糖 +2蔗糖， pH5.4。 0079 将步骤 (2) 的大豆浸入农杆菌菌液中。
36、， 抽真空并维持 0.05MPa 压力 5-8 分钟， 黑暗 下 28、 200r/min 振荡培养， 侵染 15-20min 钟。 0080 (4) 共培养 0081 将步骤 (3) 的大豆取出， 用无菌滤纸吸去多余菌液， 切面朝下置于共培养培养基 上， 25-28下暗培养3天。 其中所述共培养培养基配方为 ： MS+30mg/L乙酰丁香酮+20g/ L 蔗糖 +7g/L 琼脂， pH5.8。 0082 (5) 丛生芽再生、 筛选及小苗生根、 筛选 0083 将共培养后的大豆用无菌水清洗 4 次， 再用无菌滤纸吸干， 转接至丛生芽诱导培 养基上， 在 28、 且每日光照 14 小时条件下， 。
37、每两周换至新的培养基， 连续培养 202 天， 分化出丛生芽。其中所述丛生芽诱导筛选培养基配方为 ： MS+3.2mg/L 6-BA(6- 苄氨基腺嘌 呤 )+0.35mg/L IAA( 吲哚乙酸 )+15mg/L 卡那霉素 +200mg/L 头孢噻肟钠 +20g/L 蔗糖 +7g/ 说 明 书 CN 101880686 B 8 7/8 页 9 L 琼脂， pH5.8。 0084 选筛选后长至 1-2 厘米的丛生芽， 将小芽单独剪下， 转移到生根筛选培养基上， 在 28、 且每日光照 141 小时条件下， 连续培养 14 天。其中所述生根筛选培养基配方为 ： MS+0.5mg/L IBA(乙哚。
38、丁酸)+25mg/L卡那霉素+200mg/L头孢噻肟钠+20g/L蔗糖+7g/L琼 脂， pH5.8。 0085 (6) 小苗壮苗及移栽 0086 选根系生长良好的小苗转移到壮苗培养基上， 在 28且每日光照 14 小时条件下， 培养 7-10 天。当小苗经筛选存活、 且根系生长良好后， 将其不伤及根部取出， 除去残存培养 基移入土壤， 用薄膜覆盖花盆以提高湿度。其中所述壮苗培养基配方为 ： MS+2.2mg/LKT( 激 动素 )+0.5mg/L NAA(- 萘乙酸 )+20g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂， pH5.8。移栽成活率大于 90。 0087 当小苗在土壤中长出 4-7 片新叶， 。
39、剪取 2-3 片新叶用 CTAB 法提取 DNA 检测。大豆 叶片经液氮研磨后迅速转移至1.5ml离心管中， 加入600l 65预热的2CTAB提取缓冲 液， 颠倒离心管混匀， 65水浴 30 分钟。混合物冷却至室温后加入等体积的酚氯仿异 戊醇 ( 体积比 25 24 1)， 混匀后 12000rpm 离心 10 分钟， 上清液转移至新管， 加入等体 积氯仿异戊醇(体积比241)， 混匀后12000rpm离心10分钟， 上清液转移至新管， 加入 三分之二体积预冷的异丙醇， 混匀， 12000rpm离心10分钟， 弃去上清液。 70乙醇不打散沉 淀洗涤 3 次， 弃去乙醇将沉淀晾干。用 30l 。
40、双蒸水溶解。 0088 PCR 法检测阳性转基因植株 ： 抗性植株总 DNA 分别用 35S 启动子引物、 snac6 基因 引物和 snac6 基因在大豆中的非重复序列引物进行 PCR 检测。 0089 0090 0091 PCR 反应条件如下 ： 预变性 94 5min， 94 30sec， 50 -55 30min， 72 2min， 35 个循环， 72延伸 10min。PCR 产物用 1.0 Agrose 电泳鉴定。 0092 结果 ： 利用大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法， 对圣豆 9 号了农杆菌 转化。三次生物学重复 ( 共 600 颗种子 )， 丛生芽再生获得 591 。
41、株， 抗生素筛选具有抗性植 株 46 株。转基因阳性植株经 PCR 检测， 证明 31 株为阳性植株， 转化率为 5.2。 0093 本发明中所述 MS 培养基配方如下 ： 说 明 书 CN 101880686 B 9 8/8 页 10 0094 说 明 书 CN 101880686 B 10 1/4 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101880686 B 11 2/4 页 12 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 101880686 B 12 3/4 页 13 图 5 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 101880686 B 13 4/4 页 14 图 8 图 9 图 10 说 明 书 附 图 CN 101880686 B 14 。