一种聋病易感基因SLC26A4 IVS7-2AG荧光检测试剂盒及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102559910 A (43)申请公布日 2012.07.11 CN 102559910 A *CN102559910A* (21)申请号 201210033126.X (22)申请日 2012.02.14 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 北京科聆金仪生物技术有限公司 地址 100101 北京市朝阳区大屯路 15 号 (72)发明人 万戈江 魏宏泉 步讯 夏子芳 (74)专利代理机构 北京汇信合知识产权代理有 限公司 11335 代理人 王秀丽 (54) 发明名称 一种聋病易感基因 SLC26A4 IVS7-2AG 荧光 检测试剂盒及其应用 (。

2、57) 摘要 本 发 明 公 开 了 一 种 检 测 聋 病 易 感 基 因 SLC26A4 突变热点 IVS7-2A G 的荧光检测试剂 盒， 该试剂盒包括扩增前试剂和扩增后试剂 ； 所 述扩增前试剂包括 ： PCR 缓冲液、 MgCl2和 dNTPs 的反应混合物， Taq 酶， 超纯水， 高特异性扩增 IVS7-2A G 及 Amelogenin 基因座的引物混合 物 ； 所述扩增后试剂包括 ： 基因分型标准物和内 标。本发明以 IVS7-2A G、 Amelogenin 基因座 为检测对象， 通过上述耳聋易感基因位点的扩增， 毛细管电泳检测， 与基因分型标准物的对比， 即 可筛选出含有。

3、上述位点突变的个体。对聋病易 感基因的检测， 尤其是对新生儿耳聋基因的筛查 具有重要意义 ； 在耳聋基因筛查领域中首次复合 采用了荧光标记技术、 LNA 核苷单体掺入 - 引物 修饰技术、 毛细管电泳技术实现对耳聋基因位点 IVS7-2A G 的高灵敏度特异性检测。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 3 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 3 页 附图 5 页 1/1 页 2 1. 一种聋病易感基因 SLC26A4 IVS7-2A G 荧光检测试剂盒， 其特征在于包括 DNA。

4、 聚合酶及其缓冲溶液、 扩增 IVS7-2A G 及 Amelogenin 基因座的引物、 及基因突变位点 IVS7-2A G 和 Amelogenin 基因座的基因分型标准物和内标。 2. 根据权利要求 1 所述的试剂盒， 其特征在于突变热点 IVS7-2A G 检测的引物为 ： SEQ ID NO.01 和 SEQ ID NO.02.X ； SEQ NO.01 ： 5 -CCAGCATTGTAATTTTTTTCCAGG-3 SEQ NO.02.1 ： 5 -GTTTTAACATCTTTTGTTTTATTTAG-3 SEQ NO.02.2 ： 5 -GTTTTTAACATCTTTGTTTTA。

5、TTTAG-3 SEQ NO.02.3 ： 5 -GTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTTG-3 其中 LNA 核苷以黑体字表示。 3.根据权利要求1或2所述的试剂盒， 其特征在于所述Amelogenin基因座检测的引物 为 ： SEQ NO.03 ： 5 -CCCTGGGCTCTGTAAAGAAT-3 SEQ NO.04 ： 5 -GCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3 。 4. 根据权利要求 1 或 2 所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述的用于 IVS7-2A G 和 Amelogenin 扩增的引物， 每对引物中有一条引物的 5 端进行荧光染料标记。 5. 根据权利要。

6、求 1 所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述突变热点 IVS7-2A G 检测的引 物和用于 Amelogenin 基因座扩增的引物可以采用相同或不同的荧光染料标记 ； 内标选用 不同于上述的荧光染料标记。 6. 根据权利要求 1 所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述 IVS7-2A G 和 Amelogenin 基因 座的复合扩增采用聚合酶链式反应来实现， 采用多道或单道毛细管电泳进行检测。 7. 一种快速检测聋病易感基因 SLC26A4 突变热点 IVS7-2A G 的方法， 其特征在于通 过荧光引物 PCR 及毛细管电泳特异性检测聋病易感基因 SLC26A4 突变热点 IVS7-2A G。

7、 及 Amelogenin 基因座 ； 用于 SLC26A4 基因 IVS7-2 位点 A G 突变检测的引物为 ： SEQ NO.01 和 SEQ NO.02.X 所示 ； 用于 Amelogenin 基因座检测的引物如 SEQ NO.03、 SEQ NO.04 所示 ； 所述 IVS7-2A G 和 Amelogenin 基因座的复合扩增采用聚合酶链式反应来实现， 采用多道 或单道毛细管电泳进行检测。 权 利 要 求 书 CN 102559910 A 2 1/8 页 3 一种聋病易感基因 SLC26A4 IVS7-2AG 荧光检测试剂盒及 其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种检测聋病。

8、易感基因SLC26A4突变热点IVS7-2AG及Amelogenin 基因座的荧光检测试剂盒， 属于生物检测技术领域。 背景技术 0002 SLC26A4 基因与弧立的大前庭水管综合征及 Pendred 综合征 ( 前庭水管扩大或伴 内耳畸形、 神经性聋和甲状腺肿 ) 的关系密切， 临床上表现为先天性或后天性耳聋， 耳聋发 生或加重与外伤、 感冒有关。通过颞骨 CT 扫描可以得出结论， 但目前由于设备和专业人员 的限制， 中国大部分地区的医院不能进行高分辨率的颞骨 CT 扫描， 导致许多地区无法诊断 大前庭水管综合征。 0003 通过对 SLC26A4 基因的检测， 则可以在全国范围内实现对 。

9、80以上大前庭水管综 合征的准确诊断， 并先于 CT 检查发现和确诊大前庭水管综合征， 这一方法可以避免放射线 检查的辐射问题， 更易为患者家属接受， 并且由于基因诊断操作能够批量进行， 可以在大标 本范围内进行筛查。大量研究表明， 存在于中国人群突变热点区域为 ： SLC26A4 基因外显子 8 的侧翼序列的 IVS7-2A G。 0004 目前常用的基因检测方法有 ： 直接测序 (direct sequencing， DS)、 连接酶检测 反应 (ligase detection reaction， LDR)、 限制性片段长度多态性分析 (restriction fragment leng。

10、th polymorphism， RFLP)、 变 性 高 效 液 相 色 谱 分 析 (denaturing high performance liquid chromotography， DHPLC)、 定量 PCR、 基因芯片。这些方法都存在不同 的缺陷， 例如操作繁琐、 结果不易判读、 重复性差、 假阴性假阳性多等问题。 0005 采用荧光标记技术、 毛细管电泳技术， 通过带荧光标记物的引物对 SLC26A4 基因 的 IVS7-2A G 位点特异性的扩增， 并在此引物中掺入核酸类似物提高引物的 Tm 值， 进一 步增强引物的特异性， 而后经毛细管电泳后分析 PCR 产物出峰情况， 即。

11、可实现对耳聋基因 位点的检测。该方法灵敏度高、 判读清晰准确， 仅需采取少量血样或口腔拭子样本， 即可进 行检测， 采样方便尤其适合新生婴幼儿样本的采集。 发明内容 0006 本发明目的是提供一种聋病易感基因 SLC26A4 突变热点 IVS7-2A G 荧光检测试 剂盒。 0007 为了实现上述目的， 采取的技术方案 ： 一种聋病易感基因 SLC26A4 突变热点 IVS7-2A G 荧光检测试剂盒， 该试剂盒包括扩增试剂和扩增后的基因分型用试剂 ； 0008 所述扩增前试剂包括 ： PCR 缓冲液、 MgCl2、 dNTPs 的混合物， Taq 酶， 2 对引物混合 物以及超纯水 ； 00。

12、09 所述扩增后试剂包括 ： 用于基因分型的对应于 SLC26A4 基因突变热点 IVS7-2A G 检测和 Amelogenin 性别鉴定基因座的等位基因标准物的混合物和内标 ROX-300 ； 说 明 书 CN 102559910 A 3 2/8 页 4 0010 使用所述的试剂盒进行 PCR 复合扩增反应的条件 ： PCR 扩增体系的 pH 值为 8.0-9.0， 镁离子浓度为 1.5-3.5mM， 4 种 dNTP 的终浓度各为 200-300M， Taq 酶的用量为 0.1-0.4U/L， 2 对引物混合物中的单对引物终浓度为 0.2-0.4M。 0011 使用所述试剂盒进行 PCR。

13、 扩增时， 扩增阶段反应在一个复合扩增反应体系中同时 扩增 SLC26A4 基因的 IVS7-2A G 和 Amelogenin 基因座。 0012 用于 SLC26A4 基因 IVS7(-2) 位点 A G 突变检测的引物为 ： SEQ NO.01 和 SEQ NO.02.X。 0013 SEQ NO.02.X 为下列掺入了 LNA 核苷的引物中的任意一条 (LNA 核苷以黑体字表 示 ) ： 0014 SEQ NO.02.1 ： 5 -G TTTTAACATCTTTTGTTTTATTTAG-3 0015 SEQ NO.02.2 ： 5 -GTTTTTAACATCT TTGTTTTATTTA。

14、G-3 0016 SEQ NO.02.3 ： 5 -GTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTT G-3 。 0017 用于 Amelogenin 基因座检测的引物为 ： SEQ NO.03 ： 5 -CCCTGGGCTCTGTAAAGAAT-3 、 SEQ NO.04 ： 5 -GCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3 。 0018 所述的 2 对引物， 其中每对引物中有一条引物的 5 端进行荧光染料标记， 所用的 荧光染料可以为相同或不同的荧光素。 0019 所述复合扩增采用聚合酶链式反应来实现， 采用多道或单道毛细管电泳进行检 测。 0020 其中所检测的人基因组 DNA 为。

15、 ： 使用 Chelex 法、 磁珠提取法或酚 / 氯仿抽提法对 来源样本进行处理得到的 DNA ； 所述的来源样本为 ： 来源于人类的 ： 滤纸片血斑 / 口腔拭子 样本、 FTA 卡血斑 / 口腔拭子样本、 口腔拭子样本、 血液 / 痕、 组织、 羊水。 0021 使用所述的试剂盒进行 PCR 扩增时， 扩增阶段反应在任何型号的 PCR 仪上进行， 扩增程序 ： 94-98 1-5min ； 26-32 个循环的 94-98 15-60s， 55-65 15-60s， 72 15-60 ； 60 30-60min。 0022 对于IVS7-2位点突变的检出， 使用的带荧光标记并经LNA核苷。

16、单体掺入修饰的引 物， 提高了引物的 Tm 值， 缩短了引物长度， 从而增加了引物的灵敏度和特异性， 防止假阳性 和假阴性的出现。 0023 对于 Amelogenin 的检出， 一方面是内参的作用 ： 指示模板 DNA 是否有效或浓度范 围 ； 另一方面能有效指示是否存在 PCR 产物污染， 防止因污染产生的假阳性。 附图说明 0024 图 1 是本发明的试剂盒 ( 采用不同荧光染料标记 ) 对突变个体血斑来源 DNA 扩增 后的分型结果 ； 0025 图 2 是本发明的试剂盒 ( 采用不同荧光染料标记 ) 对正常个体血斑来源 DNA 扩增 后的分型结果 ； 0026 图 3 是本发明的试剂。

17、盒 ( 采用相同荧光染料标记 ) 对突变及正常个体血斑来源 DNA 扩增后的分型结果。 0027 图 4 是经修饰和未修饰的引物对同一男性确证病例不同浓度 DNA 的分型结果。 0028 图 5 是经修饰和未修饰的引物对同一男性正常个体不同浓度 DNA 的分型结果。 说 明 书 CN 102559910 A 4 3/8 页 5 具体实施方式 0029 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明， 但不作为对本发明的限定。 0030 实施例 1 0031 聋病易感基因 SLC26A4 突变热点 IVS7-2A G 荧光检测试剂盒检测突变及正常个 体的 DNA 样本， 用于聋病易感基因 SLC2。

18、6A4 突变热点 IVS7-2A G 检测的引物采用蓝色荧 光染料 6-FAM 标记， 用于 Amelogenin 基因座扩增的引物采用黄色荧光染料标记， 荧光标记 物为 TAMRA ； 内标采用红色荧光染料标记， 荧光标记物为 ROX。 0032 1、 待测样本100份， 都已经使用 “DNA提取-PCR扩增-测序” 的技术方法对SLC26A4 突变热点 IVS7-2 位点进行过测序检测， 其中突变样本 5 份。 0033 2、 检材的基因组 DNA 提取 0034 Chelex 提取法 ： 剪下 1 3mm 血斑置于 1.5mL 离心管中， 加入 sdH2O 1mL， 振荡离 心， 弃上清。

19、液， 重复步骤两次， 弃上清液， 将 5 Chelex-100 震荡悬浮后快速用剪掉的枪头 吸取 200L 加入离心管中， 振荡数秒， 。于 56水浴保温 30min 后， 振荡数秒。95沸水浴 10min， 轻微振荡数秒。2000rpm 离心 5min， 上清中为提取的 DNA。 0035 3、 扩增和扩增产物的检测分析 0036 3.1PCR 扩增体系 ： 0037 0038 0039 3.2PCR 扩增程序 ： 0040 说 明 书 CN 102559910 A 5 4/8 页 6 0041 4、 扩增产物在遗传分析仪上荧光检测 0042 由去离子甲酰胺与分子量内标组成上样混合物 (0.。

20、2L 分子量内标 )( 进样 数 )+(9.8L 去离子甲酰胺 )( 进样数 ) 。将 10L 上样混合物与 1L 扩增产物或等位 基因分析标准物混合， 避免产生气泡。95变性 5min， 冰浴 5min， 并尽快电泳。用遗传分析 仪检测分析。 0043 5、 结论 0044 本发明分型完整清晰， 结果如图 1-2 所示 ： 0045 图 1 ： 第 1、 2 行 ： 确诊病例， 男， IVS7-2 位点判读位置 (88bp) 出现峰值 1500H 的检 测峰， 性别出 X、 Y 双峰 (105bp， 峰值 2700H 和 111bp， 峰值 2800H) 0046 图 1 ： 第 3、 4 。

21、行 ： 确诊病例， 女， IVS7-2 位点判读位置 (88bp) 出现峰值 5500H 的检 测峰， 性别出 X 单峰 (105bp， 峰值 7500H) 0047 图 2 ： 第 1、 2 行 ： 正常个体， 男， IVS7-2 位点判读位置 (88bp) 不出峰， 性别出 X、 Y 双峰 (105bp， 峰值 2800H 和 111bp， 峰值 2800H) 0048 图 2 ： 第 3、 4 行 ： 正常个体， 女， IVS7-2 位点判读位置 (88bp) 不出峰， 性别出 X 单 峰 (105bp， 峰值 2800H) 0049 与测序方法相比较 ： 对同一来源的样本的相同基因座分。

22、型结果是一致的。 0050 实施例 2 0051 聋病易感基因 SLC26A4 突变热点 IVS7-2A G 荧光检测试剂盒检测突变及正常个 体的 DNA 样本， 用于聋病易感基因 SLC26A4 突变热点 IVS7-2A G 检测的引物采用蓝色荧 光染料 6-FAM 标记， 用于 Amelogenin 基因座扩增的引物采用黄色荧光染料标记， 荧光标记 物为 TAMRA ； 内标采用红色荧光染料标记， 荧光标记物为 ROX。 0052 1、 待测样本同实施例 1。 0053 2、 检材的基因组 DNA 提取 0054 采用 Chelex 法进行基因组 DNA 的提取。 0055 3、 扩增和扩。

23、增产物的检测分析 0056 3.1PCR 扩增体系 ： 0057 说 明 书 CN 102559910 A 6 5/8 页 7 0058 3.2PCR 扩增程序 ： 0059 0060 4、 扩增产物在遗传分析仪上荧光检测 0061 同实施例 1。 0062 5、 结论 0063 本发明分型完整清晰， 结果如图 3 所示， 0064 第 1 行 ： 确诊病例， 男， IVS7-2 位点判读位置 (88bp) 出现峰值 1400H 的检测峰， 性 别出 X、 Y 双峰 (105bp， 峰值 2600H 和 111bp， 峰值 2800H) 0065 第 2 行 ： 确诊病例， 女， IVS7-2。

24、 位点判读位置 (88bp) 出现峰值 5800H 的检测峰， 性 别出 X 单峰 (105bp， 峰值 7800H) 0066 第 3 行 ： 正常个体， 男， IVS7-2 位点判读位置 (88bp) 不出峰， 性别出 X、 Y 双峰 (105bp， 峰值 2900H 和 111bp， 峰值 3000H) 0067 第4行 ： 正常个体， 女， IVS7-2位点判读位置(88bp)不出峰， 性别出X单峰(105bp， 峰值 2800H) 0068 与测序方法相比较 ： 对同一来源的样本的相同基因座分型结果是一致的。 0069 实施例 3 0070 聋病易感基因 SLC26A4 突变热点 I。

25、VS7-2A G 荧光检测试剂盒检测突变及正 说 明 书 CN 102559910 A 7 6/8 页 8 常个体的 DNA 样本， 用于聋病易感基因 SLC26A4 突变热点 IVS7-2A G 检测的引物、 用 于 Amelogenin 基因座扩增的引物均采用黄色荧光染料 TAMRA 标记 ； 内标采用红色荧光染 料标记， 荧光标记物为 ROX。其中， 用于聋病易感基因 SLC26A4 突变热点 IVS7-2A G 检 测的引物使用 ： 经过 LNA 核苷单体掺入修饰的引物 (SEQ NO.02.2 ： 5 -GTTTTTAACATCT TTGTTTTATTTAG-3 ) 和普通引物 (S。

26、EQ NO.02.0 ： 5 -GTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTTAG-3 ) 进行扩增效果的比较。 0071 1、 待测样本同实施例 1。 0072 2、 检材的基因组 DNA 提取 0073 采用 Chelex 法进行基因组 DNA 的提取。 0074 3、 扩增和扩增产物的检测分析 0075 3.1PCR 扩增体系 ： 0076 0077 0078 3.2PCR 扩增程序 ： 0079 说 明 书 CN 102559910 A 8 7/8 页 9 0080 4、 扩增产物在遗传分析仪上荧光检测 0081 同实施例 1。 0082 5、 结论 0083 如图 4 所示， 对。

27、于男性确诊病例， 0084 掺入了LNA核苷单体的引物SEQ NO.02.2(本发明试剂盒引物)所得结果(左图) 和未经修饰的 SEQ NO.02.0 引物所得结果 ( 右图 ) 一致， 即在各个 DNA 浓度下均能获得正 确的判定结果 ： IVS7-2 位点 A G 判读位置出峰， 性别出 X、 Y 双峰， 均随 DNA 浓度的增加峰 值增加。具体如下 ： 0085 0086 0087 如图 5 所示， 对于男性正常个体， 说 明 书 CN 102559910 A 9 8/8 页 10 0088 掺入了LNA核苷单体的引物SEQ NO.02.2(本发明试剂盒引物)所得结果(左图) 和未经修饰。

28、的 SEQ NO.02.0 引物所得结果 ( 右图 ) 对 IVS7-2 位点不一致 ： 前者在各个 DNA 浓度下均不出峰 ； 而后者当 DNA 的量大于 1ng 时， IVS7-2 位点判读位置出峰， 与测序结果不 一致， 即使用未经修饰的 SEQ NO.02.0 引物易出现假阳性的结果。两者对于性别的判定一 致 ： 性别出 X、 Y 双峰， 均随 DNA 浓度的增加峰值增加。具体如下 ： 0089 0090 因此， 本发明试剂盒引物能够特异性地检出 IVS7-2 位点突变， 结果与测序结果一 致， 不出现假阳性。 0091 以上实施例中所用的不同 pH 的 2.5PCR 缓冲液， 用不同。

29、 pH 值的 Tris-HCl 缓冲 液配制， 1PCR 缓冲液中的 Tris-HCl 浓度为 10mM， KCl 浓度为 50mM ； 本发明中所用的 Taq 聚合酶以及其他试剂及材料均为市售产品。 说 明 书 CN 102559910 A 10 1/3 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 102559910 A 11 2/3 页 12 0003 序 列 表 CN 102559910 A 12 3/3 页 13 序 列 表 CN 102559910 A 13 1/5 页 14 图 1 说 明 书 附 图 CN 102559910 A 14 2/5 页 15 图 2 说 明 书 附 图 CN 102559910 A 15 3/5 页 16 图 3 说 明 书 附 图 CN 102559910 A 16 4/5 页 17 图 4 说 明 书 附 图 CN 102559910 A 17 5/5 页 18 图 5 说 明 书 附 图 CN 102559910 A 18 。