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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710320098.2 (22)申请日 2017.05.09 (71)申请人 中国科学院新疆理化技术研究所 地址 830011 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐 市北京南路40号附1号 (72)发明人 阿吉艾克拜尔艾萨 马依拉赛力哈孜李俊 (74)专利代理机构 乌鲁木齐中科新兴专利事务 所 65106 代理人 张莉 (51)Int.Cl. C07D 307/93(2006.01) (54)发明名称 天山雪莲种子中的倍半萜内酯类化合物及 其制备方法 (57)摘要 本发明涉及一种天山雪。
2、莲种子中的倍半萜 内酯类化合物及其制备方法， 该化合物以天山雪 莲种子药材为原料， 用有机溶剂提取和萃取后， 通过硅胶柱层析法、 葡聚糖凝胶LH-20柱层析法、 反相ODS柱层析、 制备型高效液相色谱的三种或 四种方式进行分离， 采取薄层层析法检测分析， 得到天山雪莲种子中的倍半萜内酯类化合物， 化 学名称为 （3S， 3aR， 4S， 6aR， 8R， 9aS， 9bR） -4,8-二 羟基-3-甲基-6,9-二甲基二氢薁基4,5-b呋 喃-2 （9bH-酮） 。 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 CN 107118188 A 2017.09.01 CN 107118188 A 1.一种。
3、天山雪莲种子中的倍半萜内酯化合物， 其特征在于该化合物的结构式( )为： 其中： 化合物( )被命名为雪莲內酯D， 其化学名称为(3S， 3aR， 4S， 6aR， 8R， 9aS， 9bR)-4, 8-二羟基-3-甲基-6,9-二甲基二氢薁基4,5-b呋喃-2(9bH-酮)。 2.根据权利要求1所述的天山雪莲种子中倍半萜内酯化合物的制备方法， 其特征在于 按下列步骤进行： a、 以天山雪莲种子为原料， 粉碎后， 用3-10倍体积浓度的75-95乙醇、 无水乙醇或甲 醇进行室温下冷浸提取， 或温度20-70加热回流提取， 提取液经减压浓缩后得到粗提物； b、 将步骤a得到的粗提物用蒸馏水分散，。
4、 用石油醚进行萃取3-5次后， 水层用三氯甲烷 或二氯甲烷萃取3-5次， 将萃取液浓缩， 得到萃取物浸膏； c、 将步骤b得到的萃取物浸膏经正相硅胶柱层析分离， 然后经过葡聚糖凝胶LH-20柱层 析或反相ODS柱层析纯化后， 再用高效液相色谱进行纯化， 即得到倍半萜内酯类化合物雪莲 內酯D。 3.根据权利要求2所述雪莲种子中的倍半萜内酯类化合物的制备方法， 其特征在于步 骤c中所用正相硅胶柱层析法为常压或加压柱层析， 所用洗脱剂为二氯甲烷或三氯甲烷和 甲醇的混合溶剂， 采用梯度洗脱。 4.根据权利要求3所述的雪莲种子倍半萜类化合物的制备方法， 其特征在于步骤c中葡 聚糖凝胶LH-20柱层析法的。
5、洗脱剂为体积比1:1的甲醇:三氯甲烷或甲醇:二氯甲烷等度洗 脱， 或体积浓度10-60甲醇-水梯度洗脱。 5.根据权利要求3所述的雪莲种子倍半萜类化合物的制备方法， 其特征在于步骤c中反 相柱ODS柱层析采用体积浓度10-90的甲醇-水或乙腈-水梯度洗脱。 6.根据权利要求2所述的雪莲种子中的倍半萜内酯类化合物的制备方法， 其特征在于 步骤c中高效液相色谱进行分离， 洗脱剂为体积浓度10-90的甲醇-水溶液或体积浓度10- 60的乙腈-水溶液， 采用梯度洗脱。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107118188 A 2 天山雪莲种子中的倍半萜内酯类化合物及其制备方法 技术领域 0001 本发。
6、明为植物化学领域， 具体为中药有效成分的提取、 分离与制备工艺领域， 尤其 涉及从雪莲种子中提取、 分离具有药理活性的一个新的倍半萜内酯类化合物。 背景技术 0002 天山雪莲(Saussurea involucrata)系菊科(Asteraceae)风毛菊属(Saussurea) 植物， 是新疆的著名特产， 又称新疆雪莲， 全草入药。 雪莲分布于我国新疆天山和昆仑山一 带， 生长在雪线以上。 其国外分布很少， 资料表明， 仅在俄罗斯、 哈萨克斯坦和蒙古有分布。 天山雪莲又名雪莲花， 学荷花， 是维吾尔族医常用药材(名为 “塔格依力斯” )。 天山雪莲在医 药应用上已有数百年的历史， 中国传统。
7、中医理论认为雪莲性温， 味微苦， 入肝、 脾、 肾三经， 具有散寒除湿、 活血通经、 强筋助阳、 抗炎、 镇痛、 收缩子宫等功能。 民间用于治疗风湿性关 节炎、 肩周炎等疾病、 妇女小腹冷痛、 闭经、 胎衣不下、 麻疹不透、 肺寒咳嗽、 阳萎等症， 在治 疗跌打损伤、 雪盲和牙痛方面也有使用。 现代药理学证明雪莲具有抗肿瘤、 清除自由基、 抗 感染和免疫调节等作用。 从已有文献来看， 新疆雪莲中化学成分种类比较丰富(黄酮、 萜类、 香豆素和植物甾醇等)并且具有很好的药理活性(抗炎镇痛、 抗癌、 解痉降压、 终止妊娠和抗 染色体损伤等)。 天山雪莲(Saussurea involucrata)种。
8、子在零摄氏度发芽， 35生长， 幼 苗能经受-20的严寒。 在生长期不到两个月的环境里， 高度却能超过其他植物的五到七 倍。 它虽然要五年才能开花， 但实际生长天数只有八个月。 独特的生物学特征可能造就了结 构新颖的次生代谢产物。 另外， 通过文献调研， 目前对新疆雪莲种子的化学成分和药理作用 进行报道的文献还较少。 因此对于新疆雪莲种子进行化学成分及其生物活性的研究对于雪 莲药用价值的开发具有极高的学术价值和非常重要的科学意义， 不仅可对雪莲种子的化学 成分研究其有效成分及药理功效奠定了良好的基础， 也为同类产品进一步开发再利用， 提 高商品技术附加值提供理论与技术支持。 发明内容 0003。
9、 本发明的目的在于， 提供一种天山雪莲种子中的倍半萜内酯类化合物及其制备方 法， 该化合物以天山雪莲种子药材为原料， 用有机溶剂提取和萃取后， 通过硅胶柱层析法、 葡聚糖凝胶LH-20柱层析法、 反相ODS柱层析、 制备型高效液相色谱的三种或四种方式进行 分离， 采取薄层层析法检测分析， 得到天山雪莲种子中的倍半萜内酯类化合物， 化学名称为 (3S， 3aR， 4S， 6aR， 8R， 9aS， 9bR)-4,8-二羟基-3-甲基-6,9-二甲基二氢薁基4,5-b呋喃-2 (9bH-酮)。 0004 本发明所述的一种天山雪莲种子中的倍半萜内酯化合物， 该化合物的结构式( ) 为： 说明书 1/。
10、6 页 3 CN 107118188 A 3 0005 0006 其中： 化合物( )被命名为雪莲內酯D， 其化学名称为(3S， 3aR， 4S， 6aR， 8R， 9aS， 9bR)-4,8-二羟基-3-甲基-6,9-二甲基二氢薁基4,5-b呋喃-2(9bH-酮)。 0007 所述天山雪莲种子中倍半萜内酯化合物的制备方法， 按下列步骤进行： 0008 a、 以天山雪莲种子为原料， 粉碎后， 用3-10倍体积浓度的75-95乙醇、 无水乙醇 或甲醇进行室温下冷浸提取， 或温度20-70加热回流提取， 提取液经减压浓缩后得到粗提 物； 0009 b、 将步骤a得到的粗提物用蒸馏水分散， 用石油醚。
11、进行萃取3-5次后， 水层用三氯 甲烷或二氯甲烷萃取3-5次， 将萃取液浓缩， 得到萃取物浸膏； 0010 c、 将步骤b得到的萃取物浸膏经正相硅胶柱层析分离， 经过葡聚糖凝胶LH-20柱层 析或反相ODS柱层析纯化后， 再用高效液相色谱进行纯化， 即得到倍半萜内酯类化合物， 为 雪莲內酯D。 0011 步骤c中所用正相硅胶柱层析法为常压或加压柱层析， 所用洗脱剂为二氯甲烷或 三氯甲烷和甲醇的混合溶剂， 采用梯度洗脱。 0012 步骤c中葡聚糖凝胶LH-20柱层析法的洗脱剂为体积比1:1的甲醇:三氯甲烷或甲 醇:二氯甲烷等度洗脱， 或体积浓度10-60的甲醇-水梯度洗脱。 0013 步骤c中反。
12、相柱ODS柱层析采用体积浓度10-90的甲醇-水或乙腈-水梯度洗脱。 0014 步骤c中高效液相色谱进行分离， 洗脱剂为体积浓度10-90的甲醇-水溶液或体 积浓度10-60的乙腈-水溶液， 采用梯度洗脱。 附图说明 0015 图1为本发明化合物的核磁共振氢谱谱图； 0016 图2为本发明化合物的核磁共振碳谱谱图； 0017 图3为本发明化合物的高分辨质谱图。 具体实施方式 0018 实施例1 0019 a、 取天山雪莲种子3Kg， 粉碎后， 用5倍体积浓度的95乙醇水溶液回流提取， 温度 20， 将提取液经减压浓缩后得到粗提物； 0020 b、 将步骤a得到的粗提物用蒸馏水分散， 用石油醚进。
13、行萃取5次后， 水层用三氯甲 说明书 2/6 页 4 CN 107118188 A 4 烷萃取3次， 将三氯甲烷萃取液浓缩， 得到萃取物浸膏； 0021 c、 将步骤b得到的三氯甲烷萃取物浸膏用常压正相硅胶柱层析分离， 按体积比 100:1-0:100的三氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱， 依次收集洗脱液减压浓缩后， 进行硅胶薄层 层析(TLC)跟踪分析， 合并相同流分， 最终得到5个流分A-E； 将流分E再次利用常压正相硅胶 柱层析进行分离， 依次用体积比为30:1-0:1的正己烷-三氯甲烷和体积比为20:1-0:1的三 氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱， 依次收集洗脱液减压浓缩后， 进行TLC跟踪分析， 。
14、合并相同流 分， 最终得到12个组分EA-EL； 将EJ流分用葡聚糖凝胶LH-20凝胶柱层析纯化， 以体积比为1: 1的三氯甲烷-甲醇进行纯化， 得到EJ1-34流分， 依次收集洗脱液在室温浓缩后， 进行TLC跟 踪分析合并流份EJ12-13； 将合并流份EJ12-13采用制备型高效色谱反相柱(C18 5 m 10 250mm)进行纯化， 以浓度为32的乙腈-水溶液等度洗脱， 得到化合物名称为(3S， 3aR， 4S， 6aR， 8R， 9aS， 9bR)-4,8-二羟基-3-甲基-6,9-二甲基二氢薁基4,5-b呋喃-2(9bH-酮)， (1.8mg)， (3.0mL/min， 210nm，。
15、 tR23min)， 命名为雪莲內酯D。 0022 实施例2 0023 a、 取天山雪莲种子3Kg， 粉碎后， 用3倍体积浓度的75乙醇水溶液回流提取， 温度 50， 提取液经减压浓缩后得到粗提物； 0024 b、 将步骤a得到的粗提物用蒸馏水分散， 用石油醚进行萃取5次后， 水层用三氯甲 烷萃取3次， 将三氯甲烷萃取液浓缩， 得到萃取物浸膏； 0025 c、 将步骤b得到的三氯甲烷萃取物浸膏用常压正相硅胶柱层析分离， 按体积比 100:1-0:100的三氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱， 依次收集洗脱液减压浓缩后， 进行硅胶薄层 层析(TLC)跟踪分析， 合并相同流分， 最终得到5个流分A-E； 将。
16、流分E用加压硅胶柱层析进行 分离， 依次用体积比为30:1-0:1的正己烷-三氯甲烷和体积比为20:1-0:1三氯甲烷-甲醇进 行梯度洗脱， 依次收集洗脱液减压浓缩后， 进行TLC跟踪分析， 合并相同流分， 最终得到12个 组分EA-EL； 将EJ流分用葡聚糖凝胶LH-20凝胶柱层析纯化， 以体积比为1:1的二氯甲烷-甲 醇进行纯化， 得到EJ1-34流分， 依次收集洗脱液在室温浓缩后， 进行TLC跟踪分析合并流份 EJ12-13； 将合并流份EJ12-13采用制备型高效色谱反相柱(C18 5 m 10250mm)进行纯 化， 以浓度为49的甲醇-水溶液等度洗脱， 得到化合物名称为(3S， 3。
17、aR， 4S， 6aR， 8R， 9aS， 9bR)-4,8-二羟基-3-甲基-6,9-二甲基二氢薁基4,5-b呋喃-2(9bH-酮)， (1.8mg)， (3.0mL/min， 210nm， tR18min)， 命名为雪莲內酯D。 0026 实施例3 0027 a、 取天山雪莲种子3Kg， 粉碎后， 用3倍体积的无水乙醇回流提取， 温度70， 提取 液经减压浓缩后得到粗提物； 0028 b、 将步骤a得到的粗提物用蒸馏水分散， 用石油醚进行萃取5次后， 水层用三氯甲 烷萃取3次， 将三氯甲烷萃取液浓缩， 得到萃取物浸膏； 0029 c、 将步骤b得到的三氯甲烷萃取物浸膏用常压正相硅胶柱层析分。
18、离， 按体积比 100:1-0:100的三氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱， 依次收集洗脱液减压浓缩后， 进行硅胶薄层 层析(TLC)跟踪分析， 合并相同流分， 最终得到5个流分A-E； 将流分E用常压正相硅胶柱层析 进行分离， 依次用体积比为30:1-0:1的正己烷-三氯甲烷和体积比为20:1-0:1的三氯甲烷- 甲醇进行梯度洗脱， 依次收集洗脱液减压浓缩后， 进行TLC跟踪分析， 合并相同流分， 最终得 到12个组分EA-EL； 将EJ流分用采用反相ODS柱层析进行纯化， 以浓度为10-90的甲醇-水 说明书 3/6 页 5 CN 107118188 A 5 溶液梯度洗脱， 依次收集洗脱液在室温浓。
19、缩后， 进行TLC跟踪分析合并流份EJ12-13， 将合并 流份EJ12-13， 采用制备型高效色谱反相柱(C18 5 m 10250mm)进行纯化， 以浓度为32 的乙腈-水溶液等度洗脱， 得到化合物名称为(3S， 3aR， 4S， 6aR， 8R， 9aS， 9bR)-4,8-二羟基- 3-甲基-6,9-二甲基二氢薁基4,5-b呋喃-2(9bH-酮)， (1.8mg)， (3.0mL/min， 210nm， tR 23min)， 命名为雪莲內酯D。 0030 实施例4 0031 a、 取天山雪莲种子3Kg， 粉碎后， 用5倍体积无水甲醇回流提取， 温度30， 提取液 经减压浓缩后得到粗提物。
20、； 0032 b、 将步骤a得到的粗提物用蒸馏水分散， 用石油醚进行萃取5次， 水层依次加入三 氯甲烷萃取3次， 将三氯甲烷萃取液浓缩， 得到萃取物浸膏； 0033 c、 将步骤b得到的三氯甲烷萃取物浸膏用常压正相硅胶柱层析分离， 按体积比 100:1-0:100的三氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱， 依次收集洗脱液减压浓缩后， 进行硅胶薄层 层析(TLC)跟踪分析， 合并相同流分， 最终得到5个流分A-E； 将流分E用加压正相硅胶柱层析 进行分离， 依次用体积比为30:1-0:1的正己烷-三氯甲烷和体积比为20:1-0:1的三氯甲烷- 甲醇进行梯度洗脱， 依次收集洗脱液减压浓缩后， 进行TLC跟踪分。
21、析， 合并相同流分， 最终得 到12个组分EA-EL； 将EJ流分用采用反相ODS柱层析进行纯化， 以浓度为10-90的乙腈-水 溶液梯度洗脱， 依次收集洗脱液在室温浓缩后， 进行TLC跟踪分析合并流份EJ12-13， 将合并 流份EJ12-13采用制备型高效色谱反相柱(C18 5 m 10250mm)进行纯化， 以浓度为32 的乙腈-水溶液等度洗脱， 得到化合物名称为(3S， 3aR， 4S， 6aR， 8R， 9aS， 9bR)-4,8-二羟基- 3-甲基-6,9-二甲基二氢薁基4,5-b呋喃-2(9bH-酮)， (1.8mg)， (3.0mL/min， 210nm， tR 23min)，。
22、 命名为雪莲內酯D。 0034 实施例5 0035 a、 取天山雪莲种子3Kg， 粉碎后， 用3倍体积浓度的75乙醇水溶液室温下冷浸提 取， 提取液经减压浓缩后得到粗提物； 0036 b、 将步骤a得到的粗提物用蒸馏水分散， 用石油醚进行萃取5次后， 水层用二氯甲 烷萃取3次， 将二氯甲烷萃取液浓缩， 得到萃取物浸膏； 0037 c、 将步骤b得到的二氯甲烷萃取物浸膏用正相硅胶柱层析分离， 按体积比100:1- 0:100的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱， 依次收集洗脱液减压浓缩后， 进行硅胶薄层层析 (TLC)跟踪分析， 合并相同流分， 最终得到5个流分A-E； 将流分E用正相硅胶柱层析进行分 。
23、离， 依次用体积比为30:1-0:1的正己烷-二氯甲烷和体积比为20:1-0:1的二氯甲烷-甲醇进 行梯度洗脱， 依次收集洗脱液减压浓缩后， 进行TLC跟踪分析， 合并相同流分， 最终得到12个 组分EA-EL； 将EJ流分用葡聚糖凝胶LH-20柱层析纯化， 以甲醇等度洗脱依次收集洗脱液在 室温浓缩后， 得到流分EJ1-34， 进行TLC跟踪分析合并流分EJ12-13， 将合并流份EJ12-13采 用制备型高效色谱反相柱(C18 5 m 10250mm)进行纯化， 以浓度为32的乙腈-水溶液 等度洗脱， 得到化合物名称为(3S， 3aR， 4S， 6aR， 8R， 9aS， 9bR)-4,8-。
24、二羟基-3-甲基-6,9-二 甲基二氢薁基4,5-b呋喃-2(9bH-酮)， (1.8mg)， (3.0mL/min， 210nm， tR23min)， 命名为 雪莲內酯D。 0038 实施例6 0039 a、 取天山雪莲种子3Kg， 粉碎后， 用3倍体积浓度的无水甲醇室温下冷浸提取， 提取 说明书 4/6 页 6 CN 107118188 A 6 液经减压浓缩后得到粗提物； 0040 b、 将步骤a得到的粗提物用蒸馏水分散， 用石油醚进行萃取5次后， 水层用三氯甲 烷萃取3次， 将三氯甲烷萃取液浓缩， 得到萃取物浸膏； 0041 c、 将步骤b得到的三氯甲烷萃取物浸膏用常压正相硅胶柱层析分离。
25、， 按体积比 100:1-0:100的三氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱， 依次收集洗脱液减压浓缩后， 进行硅胶薄层 层析(TLC)跟踪分析， 合并相同流分， 最终得到5个流分A-E； 将流分E用加压正相硅胶柱层析 进行分离， 依次用体积比为30:1-0:1的正己烷-二氯甲烷和体积比为20:1-0:1的二氯甲烷- 甲醇进行梯度洗脱， 依次收集洗脱液减压浓缩后， 进行TLC跟踪分析， 合并相同流分， 最终得 到12个组分EA-EL； 将EJ流分用葡聚糖凝胶LH-20柱层析纯化， 用甲醇等度洗脱进行纯化， 得 到EJ1-34流分， 依次收集洗脱液在室温浓缩后， 进行TLC跟踪分析合并流分EJ12-13， 。
26、将合并 流份EJ12-13采用制备型高效色谱反相柱(C18 5 m 10250mm)进行纯化， 以浓度为49 的甲醇-水溶液等度洗脱， 得到化合物名称为(3S， 3aR， 4S， 6aR， 8R， 9aS， 9bR)-4,8-二羟基- 3-甲基-6,9-二甲基二氢薁基4,5-b呋喃-2(9bH-酮)， (1.8mg)， (3.0mL/min， 210nm， tR 18min)， 命名为雪莲內酯D。 0042 实施例7 0043 将实施例1-6任意一种天山雪莲种子中的倍半萜内酯类化合物采用薄层层析法检 测分析， 采用高分辨质谱、 一维和二维核磁共振谱等现代波谱手段鉴定其结构， 其结果为： 化合物。
27、名称为(3S， 3aR， 4S， 6aR， 8R， 9aS， 9bR)-4,8-二羟基-3-甲基-6,9-二甲基二氢薁基 4,5-b呋喃-2(9bH-酮)， 为无色针状晶体， 薄层板喷浓硫酸-香草醛(2)显色剂溶液显深 紫色； 测定其在温度20时， 甲醇溶液中浓度为1.0mg/ml浓度下的旋光度为-15； HR-ESI-MS (m/z)给出的准分子离子峰为M+H-287.1257(计算值为287.1254)， 确定其分子式为 C15H20O4。 1H NMR(600MHz)和13C NMR(150MHz)数据见表1： 0044 表1 0045 说明书 5/6 页 7 CN 107118188 A 7 0046 0047 根据核磁共振氢谱、 碳谱及二维谱数据确定天山雪莲种子中倍半萜内酯类化合物 的结构为(3S， 3aR， 4S， 6aR， 8R， 9aS， 9bR)-4,8-二羟基-3-甲基-6,9-二甲基二氢薁基4,5- b呋喃-2(9bH-酮)。 说明书 6/6 页 8 CN 107118188 A 8 图1 说明书附图 1/2 页 9 CN 107118188 A 9 图2 图3 说明书附图 2/2 页 10 CN 107118188 A 10 。