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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710756474.2 (22)申请日 2017.08.29 (71)申请人 博奥生物集团有限公司 地址 102206 北京市昌平区生命科学园路 18号 申请人 清华大学 (72)发明人 闫赫邢婉丽 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 代理人 刘猛赵青朵 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) (54)发明名称 一种将miRNA从石墨烯上解吸附的方法 (57)摘要 本发明涉及分析化学和生物检测技术领域， 公开了一种将miR。
2、NA从石墨烯上解吸附的方法。 本发明所述方法将吸附有miRNA的石墨烯直接进 行原位反转录， 将miRNA解吸附下来。 本发明本采 用原位反转录的方式， 即直接对吸附有miRNA的 石墨烯材料进行逆转录， 其解吸效率显著高于现 有技术中方案， 且产物对后续反应没有抑制效 果， 可直接用于后续的PCR。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 107447011 A 2017.12.08 CN 107447011 A 1.一种将miRNA从石墨烯上解吸附的方法， 其特征在于， 将吸附有miRNA的石墨烯直接 进行原位反转录， 将miRNA解吸附下来。 2.根据权利要求1所述方法， 其特征在于。
3、， 所述原位反转录的体系为： 8-16 L原位反转录buffer、 1-5 L反转录酶、 余量水， 共20 L。 3.根据权利要求2所述方法， 其特征在于， 所述原位反转录的体系为： 10 L原位反转录buffer、 2 L反转录酶、 8 L水， 共20 L。 4.根据权利要求1-3任意一项所述方法， 其特征在于， 所述原位反转录在42下进行1 小时。 5.根据权利要求1所述方法， 其特征在于， 所述石墨烯为还原氧化石墨烯。 6.根据权利要求5所述方法， 其特征在于， 所述还原氧化石墨烯为磁性还原氧化石墨 烯。 7.根据权利要求6所述方法， 其特征在于， 所述磁性还原氧化石墨烯通过将还原氧化石。
4、 墨烯修饰到磁珠上获得。 8.根据权利要求1所述方法， 其特征在于， 所述miRNA为miRNAlet-7a。 9.原位反转录在将miRNA从石墨烯上解吸附中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107447011 A 2 一种将miRNA从石墨烯上解吸附的方法 技术领域 0001 本发明涉及分析化学和生物检测技术领域， 具体涉及一种将miRNA从石墨烯上解 吸附的方法。 背景技术 0002 MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链 RNA分子， 主要参与转录后基因表达的调控， 其能够和目的mRNA的结合使目的基因沉默或者 降低表达， 从而起到。
5、调控机体的作用。 miRNA的检测是众多核酸检测领域中重要的一个环 节， 因为其含量的变化往往和癌症的发生有着密切的关系。 0003 目前， 根据相关文献报道， 氧化石墨烯(GO)或还原氧化石墨烯(rGO)由于富含 电 子云， 能够过 - 相互作用使短单链核酸吸附在石墨烯表面， 并且rGO或GO能够猝灭靠近其 的荧光基团。 0004 有研究报道提出(XiaoliZhuet al.,Chem.Commun.,2015,51,10002-10005.)利用 滚还扩增(RCA)完成了对吸附在石墨烯表面的miRNA的检测。 但是为了使得miRNA的检测更 加具有普适性， 即使用PCR来检测miRNA，。
6、 其吸附在石墨烯表面后的解吸附是十分必要的。 根 据文献报道， cDNA， 随机DNA， BSA， 碱， 尿素或者异丙醇的加入， 以及在加热条件下可以使吸 附在石墨烯表面的单链核酸适当解吸附(Chang Luet al.,Langmuir,2016,32,10776- 10783)， 但是这些方法存在解吸效率低， 不兼容后续PCR等缺点， 例如， BSA和cDNA对吸附在 石墨烯表面的单链核酸的解吸效率只有25左右， 碱， 尿素和异丙醇的加入会抑制后续的 反转录和PCR。 可见寻找一种高效和具备下游兼容性的解吸方法对miRNA的检测至关重要。 发明内容 0005 有鉴于此， 本发明的目的在于提。
7、供一种将miRNA从石墨烯上解吸附的方法， 使得所 述方法具备较高的解吸附效率， 且产物对后续反应没有抑制效果， 可直接用于后续的PCR。 0006 为了实现上述目的， 本发明提供如下技术方案： 0007 一种将miRNA从石墨烯上解吸附的方法， 将吸附有miRNA的石墨烯直接进行原位反 转录， 将miRNA解吸附下来。 0008 针对现有对吸附在石墨烯表面的单链核酸解吸附的方法效率不高以及影响后续 反转录和PCR的缺陷， 本发明直接进行原位反转录进行解吸附， 将解吸附和反转录合为一 步， 不仅提高了miRNA的解吸附效率， 并且不影响后续PCR扩增的环节。 0009 作为优选， 本发明所述原。
8、位反转录的体系为： 0010 8-16 L原位反转录buffer、 1-5 L反转录酶、 余量水， 共20 L。 0011 在本发明具体实施方式中， 所述原位反转录buffer可以是8 L、 10 L、 12 L或16 L， 所述反转录酶可以是1 L、 2 L、 3 L、 4 L或5 L。 更为具体的， 所述原位反转录的体系为： 10 L 原位反转录buffer、 2 L反转录酶、 8 L水， 共20 L。 所述原位反转录体系可通过市售途径获 得， 例如天根生化科技(北京)有限公司， 名称为miRcute Plus miRNA Fisrt-Strand cDNA 说明书 1/4 页 3 CN 。
9、107447011 A 3 Synthesis Kit.。 其中， 所述反转录酶为两种酶组分， 一种为E.coliPoly(A)polymerase,另 一种为RNase， 首先miRNA在E.coliPoly(A)polymerase的作用下进行3 端加多聚A尾， 再在 Oligo(dT)通用逆转录引物和RNase的作用下进行逆转录反应。 0012 作为优选， 所述原位反转录在42下进行1小时。 0013 作为优选， 本发明所述石墨烯为氧化还原石墨烯。 在本发明具体实施方式中， 所述 氧化还原石墨烯为磁性氧化还原石墨烯， 以便可以快速的对石墨烯进行分离； 更为具体地， 所述磁性氧化还原石墨烯。
10、通过将氧化还原石墨烯修饰到磁珠上获得。 0014 本发明分别采取六种条件对吸附在磁性氧化还原石墨烯材料表面的miRNA let- 7a进行解吸附， 通过qPCR进行对比， 所述六种条件分别为室温水， 80水， 0.1BSA， 100nM miRNA let-7a的cDNA， 1吐温20和本发明直接反转录体系。 结果显示， 六种条件下本发明 直接反转录体系的qPCR的Ct值最低， 即解吸附出来的miRNA的含量最多， 说明本发明提供的 解吸附方法能够最有效地将miRNA从石墨烯上解吸附下来， 并且操作步骤最为简单， 产物可 直接用于后续的PCR。 同时， 本发明以不同反转录体系进行对比， 解吸附。
11、效率均有不同， 以本 发明所限定的条件下最佳。 0015 基于上述优异的技术效果， 本发明提供了原位反转录在将miRNA从石墨烯上解吸 附中的应用。 其中， 所述原位反转录体系和条件均可参照上述记载。 0016 由以上技术方案可知， 本发明本采用原位反转录的方式， 即直接对吸附有miRNA的 石墨烯材料进行逆转录， 其解吸效率显著高于现有技术中方案， 且产物对后续反应没有抑 制效果， 可直接用于后续的PCR。 附图说明 0017 图1所示为不同解吸附方案下的qPCR的Ct值柱形图。 具体实施方式 0018 本发明公开了一种将miRNA从石墨烯上解吸附的方法， 本领域技术人员可以借鉴 本文内容，。
12、 适当改进工艺参数实现。 特别需要指出的是， 所有类似的替换和改动对本领域技 术人员来说是显而易见的， 它们都被视为包括在本发明。 本发明所述方法已经通过较佳实 施例进行了描述， 相关人员明显能在不脱离本发明内容、 精神和范围内对本文所述的方法 进行改动或适当变更与组合， 来实现和应用本发明技术。 0019 在本发明具体实施方式中， 所有对比试验除去应有的区别外， 其他试验条件和环 境均一致， 以保证试验结果的可对比性。 0020 以下就本发明所提供的一种将miRNA从石墨烯上解吸附的方法做进一步说明。 0021 实施例1： 本发明所述将miRNA从石墨烯上解吸附的方法 0022 本实施例中所。
13、用到的石墨烯材料为磁性氧化还原石墨烯， 即将氧化还原石墨烯修 饰到磁珠上， 从而可以快速的对石墨烯进行分离。 0023 待石墨烯磁材料将miRNA吸附完毕后， 吸走液体， 直接对石墨烯磁材料进行原位反 转录， 反转录体系共20 L， 其中10 L原位反转录buffer、 2 L反转录酶、 8 L水， 42下1小时， 便可将miRNA解吸附下来， 且解吸附效率高于其他方法， 并且产物可直接用于后续的qPCR (miRNA反转录和miRNAqPCR试剂盒均从天根生化科技(北京)有限公司购买)。 说明书 2/4 页 4 CN 107447011 A 4 0024 实施例2： 不同解吸附方案的对比 0。
14、025 首先利用磁性氧化还原石墨烯对20微升的miRNA let-7a(10nM)进行吸附， 10分钟 后， 大部分miRNA被吸附在石墨烯的表面， 完成吸附后， 将液体用移液枪吸走， 分别采取六种 条件对吸附在石墨烯磁材料表面的let-7a进行解吸附， 每种条件重复三次实验。 六种条件 分别为室温水， 80水， 0,1BSA， 100nMlet-7a的cDNA， 1吐温20和直接逆转录体系。 其具 体操作步骤如下表： 0026 表1不同解吸附方案 0027 0028 用qPCR的Ct值来判断各个条件下解吸附的miRNA， 结果如图1， 从结果可以看出， 直 接反转录体系的qPCR的Ct值最低。
15、， 即解吸附出来的miRNA的含量最多， 说明本发明提供的解 吸附方法能够最有效地将miRNA从石墨烯上解吸附下来， 并且操作步骤最为简单， 产物可直 接用与后续的PCR。 0029 实施例3： 不同原位反转录体系的对比 0030 设置不同原位反转录体系进行解吸附对比， 首先利用磁性氧化还原石墨烯对20微 升的miRNA let-7a(10nM)进行吸附， 10分钟后， 完成吸附后， 将液体用移液枪吸走， 对材料 进行原位逆转录。 42度逆转录1h后将逆转录体系稀释十倍， 取2微升进行qPCR(总体积20微 升)， 每组重复三次， 结果见表2。 0031 反转录体系1： 10 L原位反转录bu。
16、ffer、 2 L反转录酶、 余量水， 共20 L。 0032 反转录体系2： 4 L原位反转录buffer、 0.5 L反转录酶、 余量水， 共20 L。 说明书 3/4 页 5 CN 107447011 A 5 0033 反转录体系3： 16 L原位反转录buffer、 1 L反转录酶、 余量水， 共20 L。 0034 反转录体系4： 12 L原位反转录buffer、 5 L反转录酶、 余量水， 共20 L。 0035 反转录体系5： 10 L原位反转录buffer、 4 L反转录酶、 余量水， 共20 L。 0036 反转录体系6： 14 L原位反转录buffer、 4 L反转录酶、 。
17、余量水， 共20 L。 0037 反转录体系7： 16 L原位反转录buffer、 2 L反转录酶、 余量水， 共20 L。 0038 反转录体系8： 8 L原位反转录buffer、 1 L反转录酶、 余量水， 共20 L。 0039 反转录体系9： 16 L原位反转录buffer、 5 L反转录酶、 余量水， 共20 L。 0040 反转录体系10： 18 L原位反转录buffer、 1 L反转录酶、 余量水， 共20 L。 0041 表2不同反转录体系对解吸附的影响 0042 反转录体系12345678910 qPCR Ct平均值13.516.514.612.512.813.214.014。
18、.112.915.4 0043 由表2可以看出， 在本发明所限定的反转录体系下能够具备较高的解吸附效率(体 系1、 3-9)， 而其他反转录体系(体现2和10)的qPCRCt平均值均超过了15， 与实施例2中现有 其他解吸附方案中 “水， 80” 方案基本一致， 其中反转录体系2的数值要更高。 0044 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。 说明书 4/4 页 6 CN 107447011 A 6 图1 说明书附图 1/1 页 7 CN 107447011 A 7 。