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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710697784.1 (22)申请日 2017.08.15 (71)申请人 昆明理工大学 地址 650093 云南省昆明市五华区学府路 253号 (72)发明人 余旭亚岳陈陈丁巍 (51)Int.Cl. C12P 23/00(2006.01) C12R 1/89(2006.01) (54)发明名称 褪黑素在提高雨生红球藻中虾青素含量中 的应用 (57)摘要 本发明公开了一种褪黑素的新用途， 即在提 高雨生红球藻中虾青素含量中的应用， 属于生物 工程技术领域， 应用实验结果。
2、显示： 添加5-15M 的褪黑素的诱导组比对照组积累虾青素的含量 提高了26.3-120.9%， 达到15.4-26.95mg/L； 本 发明具有简单易行， 低投入、 高产出的优点， 褪黑 素能大幅提高了虾青素的产量， 从而增加雨生红 球藻中虾青素的产率， 为虾青素的制备以及市场 的巨大需求提供一条有效的解决途径。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 107418993 A 2017.12.01 CN 107418993 A 1.褪黑素在提高雨生红球藻中虾青素含量中的应用。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 包括以下步骤： （1） 制备雨生红球藻藻液； （2） 诱导藻细胞积。
3、累虾青素； （3） 制备虾青素。 3.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 步骤 （1） 中制备雨生红球藻藻液具体为： 在 光强2500-2800 lux、 温度24-26下， 持续培养至对数生长期后期， 细胞浓度为106个/mL 时， 加入含有质量百分比8-12%硝酸钠的BBM培养基， 稀释藻细胞至2105-3105个/mL， 即 得雨生红球藻藻液。 4.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 步骤 （2） 中诱导藻细胞积累虾青素具体为： 在待诱导的雨生红球藻藻液中加入使用无水乙醇配制的褪黑素母液， 使得藻液中褪黑素的 浓度为5-15 mol/L， 在27-29、 光强11000-12。
4、000 lux条件下进行培养。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107418993 A 2 褪黑素在提高雨生红球藻中虾青素含量中的应用 技术领域 0001 本发明属于生物工程技术领域， 具体涉及一种褪黑素的新用途， 即在提高雨生红 球藻中虾青素含量中的应用。 背景技术 0002 天然虾青素 （3， 3 -二羟基-4， 4 -二酮基- ， -胡萝 卜素） 是高价值生物活性物质， 具有强大的抗氧化活性， 比其它的类胡萝 卜素高10倍， 比维生素E高550倍， 被称为 “超级维生 素E” 。 虾青素具有增强免疫力， 抗癌症， 防止皮肤衰老， 维护眼睛及中枢神经系统健康等多 种生理功能。 天然虾青素。
5、来源自发夫酵母、 鲑鱼、 虾壳及雨生红球藻中， 又以其中的雨生红 球藻中的虾青素含量最高， 最高可达其干重的5%， 被公认为自然界中生产虾青素最好的生 物来源， 并已成为近年来国内外虾青素研究的热点。 0003 雨生红球藻 （Haematococcus Pluvialis） 是一种微型单细胞绿藻， 具有特殊的生 物学性质， 它在诸如高光照、 高盐和氮饥饿等条件下， 可快速大量积累虾青素， 而对雨生红 球藻产虾青素的诱导大多集中在理化因子上， 很少对激素诱导进行研究， 褪黑素 （N-乙酰 基-5-甲氧基色胺） 是一种广泛存在于生物界的激素， 在动物、 植物以及微生物中均已发现， 褪黑素作用： (。
6、1)传递光暗信号， 使生物的各种内源性节律与环境周期保持同步。 (2)有效清 除生物体内的自由基， 使机体免受氧化损伤。 (3)褪黑素与钙调蛋白结合， 调节细胞骨架的 机能状态， 以执行特定的功能。 外源添加褪黑素能抑制活性氧ROS 的产生， 提高抗氧化酶系 的活性及抗氧化物质的含量， 降低膜质过氧化水平， 保护脂膜的完整性， 减少电解质的外 渗， 减轻外界胁迫对植株的伤害， 提高机体抗性。 0004 大规模生产雨生红球藻可分为两个阶段： 一个是对雨生红球藻的培养， 使藻细胞 高密度生长； 二是在胁迫条件下使它积累较多虾青素。 目前有能力商业化养殖雨生红球藻 的企业， 全球只有五个国家的八家公。
7、司： 日本FUJI化学集团 （控制瑞典、 夏威夷两家工厂） 、 YAMAHA集团、 Biogenic公司 （在中国昆明设有工厂） 、 美国Cyanotech公司、 中国云南爱尔发 天然虾青素生产技术有限公司、 湖北荆州市天然虾青素有限公司、 印度Bioprex公司、 以色 列Algatech公司。 但虾青素市场需求巨大， 在2000年， 纯天然虾青素的价格已达到每千克 3500美元； 到2010年， 全球虾青素市场规模达到2亿3000万美元以上； 在2014年时已达到 4.47亿美元， 预计到2020年， 全球虾青素规模将达到11亿美元。 巨大的市场需求， 必然加大 对虾青素产量的期望， 因此。
8、， 提高雨生红球藻中虾青素的积累量就显得尤为重要。 发明内容 0005 本发明目的是提供褪黑素的一种新用途， 即将褪黑素应用在提高雨生红球藻中虾 青素含量中， 该方法具有简单易行， 低投入、 高产出， 并能大幅提高了虾青素的产量， 从而增 加了雨生红球藻中虾青素的产率。 0006 本发明用途的实现方法如下： （1） 制备雨生红球藻藻液： 培养雨生红球藻至对数生长期后期， 加入含有质量百分比8- 说明书 1/4 页 3 CN 107418993 A 3 12 %硝酸钠的BBM培养基稀释藻液， 作为培养液； （2） 诱导藻细胞积累虾青素： 往待诱导的培养液中加入使用无水乙醇配制的褪黑素母 液， 使。
9、得藻液中褪黑素的浓度为5-15mol/L， 进行培养至藻细胞变红， 收集藻细胞。 0007 （3） 制备虾青素。 0008 所述雨生红球藻为雨生红球藻菌株Haematococcus pluvialis LUGU， 该菌株为在 现有文献中公开的菌株 （Zhao Y, Shang M, Xu J W, et al. Enhanced astaxanthin production from a novel strain of Haematococcus pluvialis using fulvic acid J. Process Biochemistry, 2015, 50(12): 2072-20。
10、77. ） 。 0009 所述步骤 （1） 中制备雨生红球藻藻液具体为： 在光强2500-2800 lux、 温度24-26 下， 持续培养至对数生长期后期， 细胞浓度约为106个/mL时， 加入含有质量百分比8-12%硝 酸钠的BBM培养基， 稀释藻细胞至2105-3105个/mL， 即得雨生红球藻藻液。 0010 所述诱导藻细胞积累虾青素培养条件具体为： 在27-29、 光强11000-12000 lux 条件下进行培养。 0011 所述制备虾青素具体为： 取5mL混匀的上述藻液， 5000 r/min离心3 min， 弃上清得 到藻细胞沉淀； 向藻细胞沉淀中加入2 mL （先加1mL， 。
11、用移液枪吹打均匀， 再加1mL） 含有甲 醇和KOH的水溶液 （甲醇在混合液中的体积浓度为30%， KOH在混合液中的质量浓度为5%） ， 65水浴15 min， 4000 r/min离心10 min， 除上清， 沉淀加入纯水洗涤2次， 除碱液残留； 然 后加入5 mL 二甲基亚砜， 200 w超声破壁15 min， 其中， 超声1 min， 10s间歇， 再于45水浴 20 min， 使用二甲基亚砜反复抽提至藻体发白， 离心收集上清， 测OD490； 并按照公式C （mg/ L） = （4.5AVa） /Vb计算得出虾青素的浓度， 其中C为虾青素浓度， A为490 nm下OD值， Va为 二。
12、甲基亚砜体积， Vb为藻液体积。 0012 本发明的优良效果： 1、 本发明具有简单易行， 低投入、 高产出， 只需加入mol/L级的褪黑素就可极大的促进 虾青素的积累； 2、 本发明能大幅度的提高虾青素的产率， 实验证明， 13天时各培养组虾青素浓度达到 最高， 添加5-15M的褪黑素的诱导组比对照组积累虾青素的含量提高了26.3-120.9%， 达到 15.4-26.95 mg/L。 附图说明 0013 图1为本发明不同浓度褪黑素提高虾青素含量的结果示意图。 具体实施方式 0014 下面通过实施例对本发明作进一步详细说明， 但本发明保护范围不局限于所述内 容。 0015 实施例1： 本褪黑。
13、素在提高雨生红球藻中虾青素含量的方法步骤如下： （1） 采用含质量百分比8%硝酸钠的BBM培养基作为雨生红球藻生长的基本培养基， 配置 好后分装入500mL的锥形瓶中， 每瓶加入250mL培养基， 高温高压条件下灭菌20min， 备用； （2） 在光强2500lux、 温度24下， 培养雨生红球藻菌株Haematococcus pluvialis LUGU至对数生长期后期， 细胞浓度106个/mL时， 加入含有质量百分比8%硝酸钠的BBM培养 说明书 2/4 页 4 CN 107418993 A 4 基， 稀释藻细胞至2105个/mL即得雨生红球藻藻液； （3） 在待诱导的雨生红球藻藻液中加入。
14、使用无水乙醇配制的褪黑素母液， 使得藻液中 褪黑素的浓度为5 mol/L， 在27、 光强11500lux条件下进行培养； （4） 培养过程中， 每隔一天， 取5mL混匀的上述藻液， 5000r/min离心3 min， 弃上清得到 藻细胞沉淀； 分别向藻细胞沉淀中加入2 mL （先加1mL， 用移液枪吹打均匀， 再加1mL） 含有 甲醇和KOH的水溶液 （甲醇在混合液中的体积浓度为30%， KOH在混合液中的质量浓度为 5%） ， 65水浴15 min， 4000 r/min离心10 min， 除上清， 沉淀加入纯水洗涤2次， 除碱液残 留； 然后加入5 mL 二甲基亚砜， 200w超声破壁1。
15、5 min， 其中， 超声1 min， 10s间歇， 于45水 浴20 min， 使用二甲基亚砜反复抽提至藻体发白， 离心收集上清， 测OD490； 同时每次收集 10mL均匀的藻液， 冻干后称重， 以便计算虾青素产量 （图1） 。 0016 发现13天后藻体细胞完全变红后， 收集藻细胞利用有机溶剂提取藻细胞的虾青 素， 此时其虾青素的积累量已达到最高。 0017 实施例2 （1） 采用含质量百分比10%硝酸钠的BBM培养基作为雨生红球藻生长的基本培养基， 配 置好后分装入500mL的锥形瓶中， 每瓶加入250mL培养基， 高温高压条件下灭菌20min， 备用； （2） 在光强2600lux、。
16、 温度25下， 培养雨生红球藻菌株Haematococcus pluvialis LUGU至对数生长期后期， 细胞浓度约为106个/mL时， 加入含有质量百分比10%硝酸钠的BBM 培养基， 稀释藻细胞至2.5105个/mL即得雨生红球藻藻液； （3） 在待诱导的雨生红球藻藻液中加入使用无水乙醇配制的褪黑素母液， 使得藻液中 褪黑素的浓度为10 mol/L， 在28、 光强11000lux条件下进行培养； （4） 培养过程中， 每隔一天， 取5mL混匀的上述藻液， 5000r/min离心3 min， 弃上清得到 藻细胞沉淀； 分别向藻细胞沉淀中加入2 mL （先加1mL， 用移液枪吹打均匀， 。
17、再加1mL） 含有 甲醇和KOH的水溶液 （甲醇在混合液中的体积浓度为30%， KOH在混合液中的质量浓度为 5%） ， 65水浴15 min， 4000 r/min离心10 min， 除上清， 沉淀加入纯水洗涤2次， 除碱液残 留； 然后加入5 mL 二甲基亚砜， 200w超声破壁15 min， 其中， 超声1 min， 10s间歇， 于45水 浴20 min， 使用二甲基亚砜反复抽提至藻体发白， 离心收集上清， 测OD490； 同时每次收集 10mL均匀的藻液， 冻干后称重， 以便计算虾青素产量 （图1） 。 0018 每天定期取样观察藻细胞颜色变化， 每隔一天定期取样测其虾青素的量， 发。
18、现13 天藻体细胞完全变红后， 收集藻细胞利用有机溶剂提取藻细胞的虾青素， 此时其虾青素的 积累量已达到最高。 0019 实施例3 （1） 采用含质量百分比12%硝酸钠的BBM培养基作为雨生红球藻生长的基本培养基， 配 置好后分装入500mL的锥形瓶中， 每瓶加入250mL培养基， 高温高压条件下灭菌20min， 备用； （2） 在光强2800lux、 温度26下， 培养雨生红球藻菌株Haematococcus pluvialis LUGU至对数生长期后期， 细胞浓度106个/mL时， 加入含有质量百分比12%硝酸钠的BBM培养 基， 稀释藻细胞至3105个/mL即得雨生红球藻藻液； （3） 。
19、在待诱导的雨生红球藻藻液中加入使用无水乙醇配制的褪黑素母液， 使得藻液中 褪黑素的浓度为15 mol/L， 在29、 光强12000lux条件下进行培养； （4） 培养过程中， 每隔一天， 取5mL混匀的上述藻液， 5000r/min离心3 min， 弃上清得到 说明书 3/4 页 5 CN 107418993 A 5 藻细胞沉淀； 分别向藻细胞沉淀中加入2 mL （先加1mL， 用移液枪吹打均匀， 再加1mL） 含有 甲醇和KOH的水溶液 （甲醇在混合液中的体积浓度为30%， KOH在混合液中的质量浓度为 5%） ， 65水浴15 min， 4000 r/min离心10 min， 除上清， 。
20、沉淀加入纯水洗涤2次， 除碱液残 留； 然后加入5 mL 二甲基亚砜， 200w超声破壁15 min， 其中， 超声1 min， 10s间歇， 于45水 浴20 min， 使用二甲基亚砜反复抽提至藻体发白， 离心收集上清， 测OD490； 同时每次收集 10mL均匀的藻液， 冻干后称重， 以便最后计算虾青素产量 （图1） 。 0020 对照组： 含质量百分比10%硝酸钠的BBM培养基作为雨生红球藻生长的基本培养基， 不添加褪黑 素， 用同等体积的乙醇替换褪黑素， 其余条件同实施例2， 此对比例作为空白对照组； 图1结果显示： 随着培养时间的进行， 各组的虾青素含量逐渐升高， 随后有略微下降的 。
21、趋势， 对照组虾青素的产量13天时达到最高 （12.20mg/g） ， 5和10mol/L褪黑素处理组13天 时达到最高， 比对照组分别提高了26.3%和120.9%， 达到15.4 mg/g 和26.95mg/g， 15mol/L 褪黑素处理组在第9天时达到6.87mg/g， 此时高于对照 （5.95mg/g） ， 随后没有明显的上升趋 势， 而对照组和其他组还有明显的上升趋势。 结果表明适当浓度的褪黑素诱导能显著提高 雨生红球藻中虾青素含量， 浓度过高时， 虽有加快虾青素合成的趋势， 但降低了虾青素的积 累量， 不宜用于虾青素的生产。 说明书 4/4 页 6 CN 107418993 A 6 图 1 说明书附图 1/1 页 7 CN 107418993 A 7 。