技术领域
本发明属化学合成领域，特别涉及一步法全自动化合成[11C]标记乙酰唑胺类水通道蛋白抑制剂正电子示踪剂的方法。
背景技术
目前临床使用医用回旋加速器生产的正电子核素[15O]、[13N]、[11C]、[18F]中11C具有20分钟的半衰期,可以通过[11C]CH3I甲基化对前体进行标记，特别是[11C]标记的示踪剂并不改变化合物的物理、化学、生物化学和生物学性能而成为科研和临床最为重视的正电子核素。[11C]标记的正电子示踪剂是临床PET/CT、PET和符合线路系统最常用的正电子放射性示踪剂，[11C]胆碱、[11C]乙酸、[11C]雷必利、[11C]CFT、[11C]PK1195等作为正电放射型示踪剂目前已经被广泛用于肿瘤、心血管和神经系统疾病的早期诊断、治疗方案制定和疗效评估。Agre等在1993年发现了水通道蛋白(Water Channel Protein，WCP)，即水孔蛋白(Aquaporins，AQPs)后改变了传统观念上水在细胞膜扩散（被动转运）观念，创立了水在细胞膜主动转运全新理论基础。AQPs理论的创立打开了PET和MRI分子影像成像研究的新路径。
发明内容
本发明旨在提供一种用途广，产量大，效率高，反应时间短，成本低的一步法全自动化合成[11C]标记乙酰唑胺类水通道蛋白抑制剂正电子示踪剂的方法。
为解决上述技术问题，本发明是这样实现的。
一步法全自动化合成 [11C]标记乙酰唑胺类水通道蛋白抑制剂正电子示踪剂的方法，可按如下步骤依次进行。
（1）将来自于加速器的[11C]CO2在TRACERlab FXc合成仪采用气相合成方法合成[11C]CH3I，并将[11C]CH3I输入到反应瓶。
（2）将前体溶于DMSO、乙腈或DMF,待前体溶解后再加入碱性溶液，并加入到所述反应瓶中进行加热。
（3）降低温度，加入淋洗液对所述反应瓶中粗产物进行水解。
（4）对步骤（3）所得溶液进行分离、收集即得目标产物。
作为一种优选方案，本发明在完成步骤（2）后，可接续将前体溶于DMSO、乙腈或DMF,待前体溶解后再加入碱性溶液，进行分步加热。
进一步地，本发明所述碱性溶液为NaOH、KOH、KHCO3、Cs2CO3或TBAB中的一种或两种以上的混合物。
更进一步地，本发明所述前体可选择乙酰唑胺。
更进一步地，本发明所述淋洗液可选择含乙醇的缓冲液。
更进一步地，本发明所述淋洗液为含10%乙醇的NaH2PO4缓冲液。
更进一步地，本发明所述步骤（4）中，可利用高效液相色谱及纯化柱对目标产物进行分离、收集。
更进一步地，本发明所述步骤（4）中，可使用分离柱对目标产物进行分离。
更进一步地，本发明所述步骤（2）中采用微波或电热炉加热方式进行加热。
[11C]标记乙酰唑胺类水通道蛋白抑制剂正电子示踪剂，其具有如下结构。
分子式：C5H8N4O3S2。
分子量：236.27。
正电子水通道蛋白(WCP)抑制剂又被称为水孔蛋白(AQPs)抑制剂。
化学名称为：N-[5-(氨磺酰基)-1,3,4-噻二唑-2-基]N-甲基乙酰胺，N-(5-sulfamoyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)N-methylacetamide，以下简称N-甲基乙酰唑胺，N-methylacetazolamide。
N-甲基乙酰唑胺与乙酰唑胺具有类似的物理、化学性质，但是具有比乙酰唑胺对AQPs的抑制作用更强。为此，我们首次采用[11C]标记制备成[11C]N-甲基乙酰唑胺作为AQPs抑制剂，用于对肿瘤、神经、心血管疾病的早期诊断、特异性诊断和指导个体化治疗。
为了达到设计出能够满足多用途、高产率、稳定、高效和快速和低成本的合成[11C]标记乙酰唑胺类水通道蛋白抑制剂正电子示踪剂方法，我们在设计中利用以下几个关键核心技术达到我们要求的技术解决方案。这些核心技术包括：采用气相合成法生产[11C]CH3I，已获得高比活度产物；采用乙酰唑胺作为前体；在碱性环境下，采用[11C]CH3I甲基化对乙酰唑胺进行标记获得[11C]N-甲基乙酰唑胺；利用分段加热达到大剂量合成和快速合成的目的；使用HPLC对高比活度示踪剂或分离柱对示踪剂进行分离以进一步缩短产物分离时间；采用含有乙醇的磷酸二氢钠作为淋洗液分离产物；利用微波加热技术提高合成效率；全自动化、一步法快速合成[11C]N-甲基乙酰唑胺作为AQPs类抑制剂正电子示踪剂的目的。
[11C]N-甲基乙酰唑胺合成机理如下。
前体：乙酰唑胺（N-(5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)乙酰胺）。
两种甲基化的产物被命名为THIN（N上甲基化）和THIO（O上甲基化）。
（一）采用[11C]CH3I在碱性环境下对前体进行甲基化合成[11C]N-甲基乙酰唑胺。
乙酰唑胺对AQPs具有一定程度的抑制作用，但是乙酰唑胺在水中溶解度差，对AQPs抑制作用也不如甲基乙酰唑胺。为此，我们以乙酰唑胺为原料，对其在碱性环境下进行定位甲基化，获得[11C]N-甲基乙酰唑胺。
（二）前体在碱性环境下可以实现定位甲基化的目的。选择碱性环境下甲基化目的是为获得N-甲基乙酰唑胺，甲基化并不影响磺胺基团。
（三）利用分段加热达到满足临床大剂量合成正电子放射性示踪剂的目的，利用分段加热能够提高产物生成率，有利于降低副产物。另外，研究发现小的反应体积能够提高产率，加入离子液体也能缩短反应时间。
（四）利用HPLC对示踪剂产物进行产物分离，实验证明用含有乙醇的磷酸二氢钠作为淋洗液，能够分离获得高纯度的[11C]N-甲基乙酰唑胺。
（五）利用微波加热技术提高合成效率，微波不仅仅具有加热均匀、快速升温和降低温度的特点，而且微波加热明显提高离子液体对前体的溶解度。
（六）利用一站式合成模式达到全自动化一步法合成[11C]N-甲基乙酰唑胺正电子示踪剂。
为了达到该技术具有实用性的目的，我们在设计中特别重视达到全自动化一步法合成的目的。全自动化一步合成法，可使操作人员降低射线辐射，快速完成合成过程；具有高度重复性和稳定性等优点。对于正电子放射性示踪剂由于核素的半衰期非常短，不能完成全自动化一步合成过程，就无从谈起实用性的问题。为此，我们在GE 公司的TRACERLab FXc 化学合成器上在全球首次完成全自化一步法合成出上述[11C]N-甲基乙酰唑胺正电子示踪剂。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但本发明的工艺路线不仅局限于下面所表述的内容。
图1为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
（一）乙酰唑胺类抑制剂作用机理和临床应用。
1、AQPs结构、分类和生理作用。
传统观念一直认为水的跨细胞膜转运是通过简单扩散完成的。1988年，Agre研究小组最先从红细胞质膜中分离得到水孔蛋白CHIP28 蛋白，即AQP1。1992 年他们在爪蟾卵母细胞表达系统中对所得蛋白质进行功能鉴定，第一次从分子水平证实细胞膜上存在蛋白质介导的水分跨膜转运。AQP的发现及其结构和功能的研究，为人们从分子水平认识和阐明细胞内水分运输及其调控的分子机制奠定了基础。为此，Agre由于最早发现并证实了细胞膜水通道的功能而获得2003年诺贝尔化学奖。
水通道蛋白是指细胞膜上能选择性地高效转运水分子的膜内在蛋白，属于主体内在膜蛋白 (major intrinsic protein，MIP)超家族，分子质量在23～31 ku。AQP 家族都具有高度保守的结构特征。演绎的氨基酸序列的拓扑学分析揭示，水通道在细胞膜中以四聚体的形式存在，每一亚单位在功能上都可作为一个单水通道。它的四级结构是由四个对称排列的各长5nm ，直径3.2nm 的圆筒状亚基包绕而成的四聚体。小分子气体（O、CO2和NO）和一些离子从四聚体中心形成的小孔通过。AQP每个单体由5个短环相连的6 个亲水的跨膜区域构成。N 端和C 端伸入细胞质，B、D 环位于细胞内，A 环、C 环及E 环在细胞外，其一级结构呈内部同源性，即它的N端及C端的氨基酸具同源性，以对称形式存在，这被推测为是基因内部扩增而成。B环和E环各含有高度保守的氨基酸序列：天冬酰氨- 脯氨酸- 丙氨酸(Asn-Pro-Ala，NPA)。已知序列的MIP蛋白中几乎均具有该结构域。胞内的B 环和胞外的E 环各自形成半个跨膜螺旋，并围绕成腔型使NPA 折叠形成狭窄的水孔，形成“水漏模型”(hour-glass model)参与AQP的活性调控。大多数AQP 均有一个对Hg2+敏感的残基Cys189，其邻近的NPA结构域结合Hg2+后水孔受阻塞，因此常用HgCl2研究AQP的通透性。
分子生物学和分子医学研究成果显示，在哺乳类动物中已经发现AQP的13个亚型，分别分布在人体不同脏器和组织结构。表1是AQP亚型通过物质和在组织分布。AQP0、AQP1、AQP2、AQP4、AQP6和AQP8主要转运水，也被称为“纯水通道家族”。但是，AQP6和AQP8除了转运水之外，还分别转运阴离子和尿素；AQP3、AQP7、AQP9和AQP10除转运水外，还转运甘油、尿素和一元羧酸。因此，又被称为水甘油通道蛋白。AQP11和AQP12的结构和功能还有待于进一步研究。可以看出不同的通道通过的物质和在组织中分布具有明显的区别。这样可能是为了更好的发挥AQP的功能。活细胞每天要通过改变自身状态和体积来维持正常的代谢。水分子通过水通道分子主体中的狭窄水孔进出细胞，从而实现水在细胞内外的转运。上述不同类型的AQP分布在人体各组织中，尤其是在与液体分泌和吸收有关上皮细胞和内皮细胞含量较多，这些AQP共同参与水的分泌、吸收及细胞内外水的平衡。
表1 AQP亚型通过物质和在组织分布。 AQP分型通过物质分布AQP0水分子晶状体囊内的纤维细胞膜AQP1水分子红细胞膜、肾脏近端小管、肺、眼晶状体、脑脉络丛、肝胆和结肠AQP2水分子肾脏集合管AQP3水分子、甘油和尿素结肠、肾脏、肝、胰腺、肺、气管和外周白细胞AQP4水分子大脑皮质、脑干边缘和肾脏集合管AQP5水分子肺上皮AQP6水分子、硝酸根和氯离子肾脏AQP7水分子、甘油、尿素和亚硝酸盐心脏、肾脏、睾丸和脂肪组织AQP8水分子胃肠道、胎盘、心脏，睾丸、肾脏、肝、胰和脑
2、针对AQPs抑制剂[11C]N-甲基乙酰唑胺临床价值。
由表1可以看出AQPs分布人体每个脏器的组织细胞。对于维持脏器生理功能发挥重要的作用。在疾病发生时AQP首先会发生相应的变化。AQP在人体组织细胞的功能类似于葡萄糖转运体，但是比葡萄糖转运体在疾病发生过程更早的发生改变。所以，开发AQPs PET正电子示踪剂对于疾病早期诊断、特异性诊断和个体化治疗均具有重要的价值。
我们首次采用全自动化、一步法合成[11C]N-甲基乙酰唑胺AQPs类抑制剂正电子示踪剂。
实施例1。
[11C]N-甲基乙酰唑胺的合成步骤。
1、将从医用回旋加速器传送的[11C]CO2在TRAECERLab FXc合成器上采用气相合成法合成[11C]CH3I（0.5-4Ci）。
2、[11C]CH3I传送到反应瓶。
3、利用NaOH(0.1μg)＋0.5Ml DMF或DMSO +2mg前体的混合物加入到反应瓶；在氮气或氦气的保护下加热100度8分钟。
4、温度冷却至35℃，然后加入淋洗液到溶液进入反应瓶。
5、将溶液通过HPLC对反应瓶粗产物进行分离。淋洗液为10％乙醇：20mM 90％磷酸二氢钠水溶液；也可以利用WATER公司或其它公司提供的分离柱分离出[11C]N-甲基乙酰唑胺。
合成效率50％以上，放射化学纯度大于98％。
7、利用70W微波加热时，加热时间均可以缩短1～2分钟，合成效率可以达到55％，放射性化学纯度大于98％。
8、在GE 公司的TRACERLab FXc 化学合成器上能够全自化一步法合成[11C]N-甲基乙酰唑胺。
实施例2。
[11C]N-甲基乙酰唑胺的合成步骤。
1、将从医用回旋加速器传送的[11C]CO2在TRAECERLab FXc合成器上采用气相合成法合成[11C]CH3I（0.5-4Ci）。
2、[11C]CH3I传送到反应瓶。
3、利用KHCO3 (0.1μg)＋0.5Ml DMF或DMSO +2mg前体的混合物加入到反应瓶；在氮气或氦气的保护下加热105度7分钟。
4、温度冷却至33℃，然后加入淋洗液到溶液进入反应瓶。
5、将溶液通过HPLC对反应瓶粗产物进行分离。淋洗液为10％乙醇：20mM 90％磷酸二氢钠水溶液；也可以利用WATER公司或其它公司提供的分离柱分离出[11C]N-甲基乙酰唑胺。
合成效率50％以上，放射化学纯度大于98％。
7、利用70W微波加热时，加热时间均可以缩短1～2分钟，合成效率可以达到55％，放射性化学纯度大于98％。
8、在GE 公司的TRACERLab FXc 化学合成器上能够全自化一步法合成[11C]N-甲基乙酰唑胺。
实施例3。
由原料乙酰唑胺为原料，用碘甲烷甲基化，根据分离后物质相应的核磁共振谱图结果，认为主要是两种甲基化的产物，具体结构见下图，这两种甲基化的产物被命名为THIN（N上甲基化）和THIO（O上甲基化）。
具体实验过程。
222mg（1mmol）乙酰唑胺, 碘甲烷85mg(0.5mmol，0.5eq)，氢氧化钠 80mg(2mmol，2.0eq)，DMF1.5mL，于100度下反应8min。
液相分离的条件是：甲醇：水（0.1%甲酸）=10:90梯度经25分钟后到甲醇：水=20:80。对应的THIN的出峰时间为9.19min，THIO的出峰时间为15.2min。
缩写注释：
PET Positron Emission Tomography
AC Acetazolamide
WCP Water channel protein
DMF N,N-dimethyl formamide
DMSO Dimethylsulfoxide
AQPs Aquaporins
HPLC……..High performance liquid
TBAB Tetrabutylammonium bicarbonate。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。