技术领域
本发明涉及一种利用单克隆细胞分选快速获得CRISPR/Cas9基因敲除稳定细胞株的方法，属于基因工程和遗传修饰技术领域。
背景技术
CRISPR是指成簇的、规律的短回文重复序列(Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats)。CRISPR-Cas9系统主要是由三个部分组成，分别是Cas9蛋白、precursor CRISPR RNA(pre-crRNA)和trans-activating crRNA(tracrRNA)，前者在后两者的帮助下，可以识别并靶向特定的DNA序列，对其进行切割造成双链DNA断裂，最终造成移码突变，导致基因敲除。与传统的基因编辑方法相比，CRISPR-Cas9系统结构简单，载体构建非常容易，对基因组的编辑效率很高，在实际使用过程中没有物种限制，所以其在动物、植物和细胞系等基因敲除模型制作中得到了非常广泛应用。
传统的细胞系基因敲除需要在转染以后经过多轮抗性筛选和稀释才能得到阳性单克隆，非常费时费力，而且假阳性率很高。公布号为CN105950656A的中国发明专利公开了一种快速获得基因敲除细胞株的方法，仅通过荧光素酶进行细胞株的筛选，筛选效率不高，可操作性不强。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用单克隆细胞分选快速获得CRISPR/Cas9基因敲除稳定细胞株的方法，该方法通过构建all-in-one CRISPR/Cas9系统载体，然后转染细胞系，再结合流式细胞仪进行单克隆细胞分选，最终可以非常快速获得基因组被编辑的稳定细胞株。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种利用单克隆细胞分选快速获得CRISPR/Cas9基因敲除稳定细胞株的方法，包括如下步骤：
1)确定靶序列：在基因组数据库中找到目标基因DNA序列，然后使用软件CRISPOR获得目标基因的靶位点，选择两个特异性靶位点作为sgRNA靶序列；
2)设计引物：根据步骤1)获得的gRNA靶序列分别设计引物，并在引物序列的5‘端添加BbsI酶切位点，得sgRNA引物；分别合成sgRNA引物；
3)获得双链的DNA片段：将步骤2)中合成的sgRNA引物组合后退火、配对获得带有粘性末端的双链DNA片段；
4)获得载体DNA片段：使用BbsI酶切pX458质粒，回收线性质粒DNA，获得具有粘性末端的载体DNA片段；
5)获得Cas9-sgRNA表达载体：将步骤3)中得到的带有粘性末端的双链DNA片段分别与步骤4)中得到的具有粘性末端的载体DNA片段混合，加入T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌，培养后挑选大肠杆菌单菌落测序验证，正确的即为Cas9-sgRNA表达载体；
6)将两种Cas9-sgRNA表达载体等质量混合后，通过脂质体介导的转染方式转染细胞系，转染40-80小时后进行单克隆分选；
7)利用流式细胞仪进行单克隆分选，将荧光蛋白阳性细胞按照1个细胞分选到1个孔的方式分选到加了全培养基的微孔板中；进行分选时加Sytox blue核酸染料去除死细胞；
8)培养分选得到的GFP阳性单细胞，增殖后获取细胞基因组DNA；
9)设计包含靶位点目的片段的检测引物，以步骤8)得到细胞基因组DNA为模板进行PCR扩增；鉴定PCR扩增产物，选择CRISPR/Cas9基因敲除细胞株，扩大培养后冻存。
步骤1)中所述目标基因为小鼠Vav1时，sgRNA靶序列为：
Vav1-sgRNA1：5‘-CTACGAGGACCTAATGCGCTTGG-3’，
Vav1-sgRNA2：5‘-CGAGGACCTTTATGACTGCGTGG-3’。
步骤1)中所述目标基因为小鼠Vav2时，sgRNA靶序列为：
Vav2-sgRNA1：5‘-GTTAGAGATTCAGGAGACCGAGG-3’，
Vav2-sgRNA2：5‘-GGCCAAGTACTACCGCACCCTGG-3’。
步骤1)中所述目标基因为小鼠DSG4时，sgRNA靶序列为：
DSG4-sgRNA1：5‘-CTTAGCCGTAAGGATTGCCGAGG-3’，
DSG4-sgRNA2：5‘-GTGGTTGTCATCGCAATCACAGG-3’。
步骤2)中在设计引物时，如果上游引物的5‘起始碱基不是G，则额外添加一个碱基G。
步骤8)中采用终浓度为100mM的TrisHCl、5mM的EDTA、200mM的NaCl、0.2％的SDS、100μg/mL的蛋白酶K混合水溶液裂解细胞，抽提获取细胞基因组DNA。
步骤6)中所述细胞系为RAW264.7、B16、HaCaT细胞系。
本申请利用流式细胞仪分选功能可以在短时间内得到单克隆，同时结合利用表达载体上的荧光蛋白，又可以非常有针对性的获得阳性单克隆，所以将CRISPR-Cas9系统、流式细胞仪单细胞分选和表达载体上的荧光蛋白筛选三者结合起来，就可以在短时间内获得最多的阳性单克隆，极大地提高细胞系基因敲除工作效率。
本发明通过将CRISPR-Cas9系统、流式细胞仪单细胞分选和表达载体上的荧光蛋白筛选三者结合起来，可以在短时间内获得阳性单克隆，极大地提高细胞系基因敲除工作效率。与传统细胞系基因敲除方法相比，本发明具有以下优点：1、此发明使用CRISPR-Cas9系统进行基因敲除，编辑效率非常高；2、此发明使用流式细胞仪进行单细胞分选，一方面省去了抗生素筛选的繁琐从而可以在非常短时间内获得大量阳性单细胞，另外一方面可以保证每一个培养孔中都是单细胞，减少假阳性率；3、此发明在细胞转染以后40-80小时进行分选，此时间点可以保证细胞在分选以后具有最大存活率和最大被编辑效率；4、此发明的方法适用范围广泛，没有特定细胞系和基因限制；5、此发明所表述的整个细胞系基因敲除工作可以在一月以内完成，极大节省时间成本。
附图说明
图1为Vav2基因敲除打靶设计示意图；
图2为sgRNA表达载体测序峰图；
图3为流式细胞仪对GFP阳性细胞进行单细胞分选示意图；
图4为细胞系RAW264.7中Vav2基因敲除阳性单克隆测序结果图；
图5为细胞系B16中Vav1基因敲除阳性单克隆测序结果图；
图6为细胞系HaCat中DSG4基因敲除阳性单克隆测序结果图；
图7为转染后不同时间分选不同细胞系的存活率和编辑效率统计图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。
实施例1
本实施例中快速获得CRISPR/Cas9基因敲除稳定细胞株的方法，包括如下步骤：
(1)确定待敲除基因Vav2(Gene ID:102718)的特异性靶位点sgRNA1，sgRNA2：在小鼠基因组数据库ensembl(http://asia.ensembl.org)中找到小鼠Vav2基因DNA序列(Transcript ID:ENSMUST00000056176.7)，然后使用在线设计软件CRISPOR(http://crispor.tefor.net/crispor.cgi)，确定在小鼠Vav2基因的靶位点exon6(exon ID：ENSMUSE00001307648)内挑选2个特异性位点作为sgRNA的靶序列，这两个靶序列分别为：sgRNA1(SEQ ID NO.1)：5‘-GTTAGAGATTCAGGAGACCG AGG-3’，sgRNA2(SEQ ID NO.2)：5‘-GGCCAAGTACTACCGCACCC TGG-3’，Vav2基因敲除打靶位点设计如图1所示。
(2)设计引物：根据步骤(1)sgRNA靶序列，设计2对共4条引物(上海百力格生物技术有限公司)，并在引物序列的5‘端添加BbsI酶切位点(其中使用下划线标示的碱基表示添加的酶切位点)：
M-VAV2-IVT-1(SEQ ID NO.3)：5‘-CACCGTTAGAGATTCAGGAGACCG-3’；
M-VAV2-IVT-2(SEQ ID NO.4)：5‘-AAACCGGTCTCCTGAATCTCTAAC-3’；
M-VAV2-IVT-3(SEQ ID NO.5)：5‘-CACCGGCCAAGTACTACCGCACCC-3’；
M-VAV2-IVT-4(SEQ ID NO.6)：5‘-AAACGGGTGCGGTAGTACTTGGCC-3’。因为sgRNA表达载体使用的是U6启动子，如果在基因转录的起始位点有碱基G存在，则基因的表达量会有显著提高，所以在引物设计过程中，如果上游引物的5‘起始碱基不是G，则需要额外添加一个碱基G，以保证基因维持较高的表达量，此种情形下，其对应的下游引物3’末端需要添加一个碱基C。
(3)通过引物退火、配对获得带有粘性末端的双链DNA片段：将步骤(2)中合成的4条引物以M-VAV2-IVT-1+M-VAV2-IVT-2和M-VAV2-IVT-3+M-VAV2-IVT-4的组合方式用于退火配对获得带有粘性末端的双链DNA片段，具体程序如下：首先将合成的两对引物分别磷酸化，磷酸化反应体系为，引物M-VAV2-IVT-1+M-VAV2-IVT-2和M-VAV2-IVT-3+M-VAV2-IVT-4各加入1μl(100μM)，再加入1μl 10×T4Ligation Buffer(NEB)，然后加入0.5μl T4Polynucleotide Kinase(NEB M0201S)，最后加入6.5μl ddH2O至总体积10μl，配制好反应体系以后，充分混匀，置于37℃孵育30min；取出以上反应产物，转移至PCR仪中进行变性和退火，反应程序如下：95℃，5min；95–25℃at-5℃/min。
(4)使用限制性内切酶BbsI将载体(pX458)DNA线性化，然后纯化回收，获得具有粘性末端的载体DNA片段，具体体系如下：向1.5ml离心管中依次加入1μgpX458载体DNA；3μl 10×NEB Buffer 2.1；1μlBbsI(NEB)最后补水至总体积30μl，置于37℃孵育2小时。酶切完成以后使用QIAquick PCR Purification Kit纯化酶切产物并回收至30μl ddH2O中。
(5)通过连接反应、转化、重组子筛选获得完整的sgRNA和Cas9表达载体：加入0.5μl步骤(3)中得到的带有粘性末端的双链DNA片段和2μl步骤(4)中得到的具有相同粘性末端的载体DNA，再加入0.5μlT4DNA连接酶(NEB M0202S)和1μl 10×T4ligation Buffer(NEB)，反应1小时后转化大肠杆菌DH5α并涂布氨苄青霉素抗性平板，置于37℃培养箱进行过夜培养，第二天下午挑选单菌落进行测序验证，最终即可得到sgRNA和Cas9表达载体pX458-Vav2-1和pX458-Vav2-2，sgRNA表达载体测序峰如图2所示，A：pX458-Vav2-1测序峰图；B:pX458-Vav2-2测序峰图，其中用下划线标示的序列代表加入的酶切位点。
6)将构建好的表达载体等质量混合，然后通过脂质体介导的转染方式转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7。细胞培养和转染详细步骤如下：
RAW264.7细胞的培养和传代：细胞购于ATCC细胞库，将细胞带回实验室置于CO2培养箱中培养，待细胞完全贴壁后，用DPBS换液以冲洗掉死细胞和细胞代谢物，再加入新鲜的培养液(DMEM/GLUCOSE+10％FBS+1％双抗(青霉素+链霉素))继续培养，每日在倒置显微镜下观察细胞形态和生长状况，待细胞长满培养瓶底90％左右开始传代。观察培养瓶中细胞生长状况，待细胞增殖至铺满瓶底的80～90％时，吸除瓶内的旧培养液，用预热的DPBS洗涤1-2次，再向培养瓶内加入胰蛋白酶消化液(0.25％胰酶+0.02％EDTA)1mL，37℃消化2min后将培养瓶放置于显微镜下观察，当细胞形态变圆、细胞间隙增大后，弃去胰蛋白酶并加入3mL DMEM以终止消化反应，用移液器轻柔反复吹打细胞，细胞脱离瓶壁后即形成细胞悬液，吸取适量悬液转移至新的培养瓶中，加入新鲜培养基混合均匀后置于CO2恒温培养箱中培养待细胞达90％汇合度后，按上述传代方法将F2细胞接种到24孔板上培养24h。
RAW264.7细胞的转染：将pX458-Vav2-1和pX458-Vav2-2载体DNA各取1.5μg，两种质粒共计3μg为实验组，加入到150μL减血清培养基(Opti-MEM)中进行稀释；取0.75μL脂质体Lipofectamine 3000稀释于150μL减血清培养基(Opti-MEM)中，然后将脂质体稀释液加入至DNA稀释液中，充分混匀，置于室温条件下孵育20min。将上述步骤中已接种培养细胞的24孔板中的培养基弃去，然后将复合物按顺序分别加入相应的细胞中，每孔加入300μL，另额外加三孔以作为平行对照实验组和未加入转染混合物的细胞作为阴性对照组。所有细胞在37℃5％浓度CO2培养箱中孵育1.5h后，弃去培养基，更换新鲜的培养基继续培养。
(7)分选单细胞：转染72h后，弃去培养基，采用胰酶消化法将细胞重悬于含有500μL新鲜培养基的离心管中，1350rpm离心5min后，丢弃大部分培养基上清，留约200μL培养基于管底，用移液器轻轻吹打混匀，再加400μL新鲜培养基混匀后转移至流式管中。为了获得稳定的突变单克隆细胞，通过流式细胞仪将GFP阳性单细胞分选至已经加有150μL新鲜培养基的96孔细胞培养板中，流式细胞仪对GFP阳性细胞进行单细胞分选如图3所示，黑色方框中的细胞代表GFP阳性细胞群，阳性率为12.5％。培养14天后，将单克隆转移至48孔细胞培养板中继续扩大培养并做后续分析。
(8)抽提单克隆细胞基因组DNA：将单克隆细胞在48孔细胞培养板中培养10-15天，每3-4天更换一次培养基，待细胞增殖达到90％汇合度时，消化细胞，取部分细胞抽提基因组DNA(剩余细胞继续培养)，步骤如下：首先配制细胞裂解液，每500ml裂解中一次加入以下试剂25ml 2M的TrisHCl(终浓度为100mM)，5ml 0.5M的EDTA(终浓度为5mM)，20ml 5M的NaCl(终浓度为200mM)，5ml 20％的SDS(终浓度为0.2％)，补充ddH2O至终体积为500ml；收集细胞至1.5ml离心管，设定离心机至350g离心力，离心5min使细胞沉淀至离心管底；小心除去上清；向离心管中加入150μL细胞裂解液和0.75μL蛋白酶K(母液浓度为20mg/mL)，使用移液器吹打使细胞充分悬浮混匀；置于55℃孵育2小时，使细胞充分裂解，释放基因组DNA；裂解完成以后，向细胞裂解液中加入300μL 100％无水乙醇和4.5μL 5M的NaCl，上下颠倒使之充分混匀，此时可以看到有絮状沉淀即为基因组DNA；设定离心机至13000rpm，离心30min使DNA沉淀至离心管底；小心弃去上清液，保留管底DNA，加入500μL75％乙醇，上下颠倒混匀；设定离心机至13000rpm，离心5min洗净DNA中杂质；弃去上清液，保留管底DNA，并置于室温使液体完全挥发，DNA晾干以后，加入50μL ddH2O，溶解DNA，测定浓度，并置于-20℃保存备用。
(9)设计引物检测分选得到的单克隆细胞株是否有碱基缺失或是插入。使用在线引物设计软件primer3(http://primer3.ut.ee/)，针对打靶位点基因组序列设计特异性引物，Vav2-S PCR-F(SEQ ID NO.7)：5‘-TGGCCTGGGCATTCATTGAT-3’和Vav2-S PCR-R(SEQ ID NO.8)：5‘-ACGTGCCTCCATTTCCTCAG-3’，通过PCR扩增包含打靶位点目的片段(理论长度为586bp)，体系为：(Vazyme，P111)2*Taq Master PCR MIX：10μL，Vav2-S PCR-F(5μM)和Vav2-S PCR-R(5μM)各0.5μL；基因组DNA：20ng；补充ddH2O至总体积20μL；程序为：95℃，5min；95℃，30s，60℃，30s，72℃，40s，30个循环；72℃，10min。电泳检测PCR产物，如果有清晰DNA条带，则取1μL PCR产物进行TA克隆(天根生化科技有限公司，VT307)，详细步骤如下：2*rapid ligation buffer：5μL；pGM-T fast vector：1μL；PCR产物：1μL；补充ddH2O至总体积10μL，配制好反应体系以后置于室温反应10min，然后使用热激法转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂布于具有氨苄青霉素抗性的固体培养基平板上置于37℃生化培养箱过夜培养，第二天挑取8-10个单菌落进行测序反应。测序结果如图4所示，A：Vav2基因敲除3#单克隆；B：Vav2基因敲除5#单克隆；经过序列比对分析，发现所有经过分选得到的GFP阳性单克隆细胞均发生了碱基缺失，其中3号单细胞克隆缺失了17个碱基，5号单细胞克隆缺失了5个碱基，以上结果表明这些分选得到的单克隆即为Vav2基因敲除细胞株。
(10)将已验证的单克隆细胞株扩大培养、冻存液氮以保种。
实施例2：
本实施例快速获得CRISPR/Cas9基因敲除稳定细胞株的方法，包括如下步骤：
(1)确定小鼠待敲除基因Vav1(Gene ID:98923)的特异性靶位点sgRNA1，sgRNA2：在小鼠基因组数据库ensembl(http://asia.ensembl.org)中找到小鼠Vav1基因DNA序列(Transcript ID:ENSMUST00000005889)，然后使用在线设计软件CRISPOR
(http://crispor.tefor.net/crispor.cgi)，确定在小鼠Vav1基因的靶位点exon5(exon ID：
ENSMUSE00000138941)内挑选2个特异性位点作为sgRNA的靶序列，这两个靶序列分别为：sgRNA1(SEQ ID NO.9)：5‘-CTACGAGGACCTAATGCGCT TGG-3’，sgRNA2(SEQ ID NO.10)：5‘-CGAGGACCTTTATGACTGCG TGG-3’。
(2)设计引物：根据步骤(1)sgRNA靶序列，设计2对共4条引物(上海百力格生物技术有限公司)，并在引物序列的5‘端添加BbsI酶切位点(其中使用下划线标示的碱基表示添加的酶切位点)：
M-Vav1-IVT-1(SEQ ID NO.11)：5‘-CACCGCTACGAGGACCTAATGCGCT-3’；
M-Vav1-IVT-2(SEQ ID NO.12)：5‘-AAACAGCGCATTAGGTCCTCGTAGC-3’；
M-Vav1-IVT-3(SEQ ID NO.13)：5‘-CACCGCGAGGACCTTTATGACTGCG-3’；
M-Vav1-IVT-4(SEQ ID NO.14)：5‘-AAACCGCAGTCATAAAGGTCCTCGC-3’。
(3)通过引物退火、配对获得带有粘性末端的双链DNA片段：将步骤(2)中合成的4条引物以M-Vav1-IVT-1+M-Vav1-IVT-2和M-Vav1-IVT-3+M-Vav1-IVT-4的组合方式用于退火配对获得带有粘性末端的双链DNA片段，具体程序如下：首先将合成的两对引物分别磷酸化，磷酸化反应体系为，引物M-Vav1-IVT-1+M-Vav1-IVT-2和M-Vav1-IVT-3+M-Vav1-IVT-4各加入1μl(100μM)，再加入1μl 10×T4Ligation Buffer(NEB)，然后加入0.5μl T4Polynucleotide Kinase(NEB M0201S)，最后加入6.5μl ddH2O至总体积10μl，配制好反应体系以后，充分混匀，置于37℃孵育30min；取出以上反应产物，转移至PCR仪中进行变性和退火，反应程序如下：95℃，5min；95–25℃at-5℃/min。
(4)使用限制性内切酶BbsI将载体(pX458)DNA线性化，然后纯化回收，获得具有粘性末端的载体DNA片段，具体体系如同实施例1中的步骤(4)。
(5)通过连接反应、转化、重组子筛选获得完整的sgRNA和Cas9表达载体，具体方法如同实施例1中的步骤(5)，最终即可得到sgRNA和Cas9表达载体pX458-Vav1-1和pX458-Vav1-2。最终即可得到sgRNA和Cas9表达载体pX458-Vav1-1和pX458-Vav1-2。
(6)将构建好的表达载体等质量混合，然后通过脂质体介导的转染方式转染小鼠黑色素瘤细胞系B16。细胞培养和转染详细步骤如下：
B16细胞的培养和传代：细胞购于ATCC细胞库，将细胞带回实验室置于CO2培养箱中培养，培养和传代方法同RAW264.7细胞。有所不同的是，B16细胞在传代消化过程中，37℃消化1min后将培养瓶放置于显微镜下观察，当细胞形态变圆、细胞间隙增大后，弃去胰蛋白酶并加入3mL DMEM以终止消化反应。
B16细胞的转染：将pX458-Vav1-1和pX458-Vav1-2载体DNA转染至B16细胞的方法同RAW264.7细胞的转染。
(7)分选单细胞：步骤如同上述实施例1中的步骤(7)。
(8)抽提单克隆细胞基因组DNA：步骤如同上述实施例1中的步骤(8)。
(9)设计引物检测分选得到的单克隆细胞株是否有碱基缺失或是插入。使用在线引物设计软件primer3(http://primer3.ut.ee/)，针对打靶位点基因组序列设计特异性引物，Vav1-S PCR-F(SEQ ID NO.15)：5‘-GACACATTGCAAGACGTGGG-3’和Vav1-S PCR-R(SEQ ID NO.16)：5‘-TTTGCCATCCCAGCTCTCAG-3’，通过PCR扩增包含打靶位点目的片段(理论长度为550bp)，体系为：(Vazyme，P111)2*Taq Master PCR MIX：10μL，Vav1-S PCR-F(5μM)和Vav1-S PCR-R(5μM)各0.5μL；基因组DNA：10μg；补充ddH2O至总体积20μL；程序为：95℃，5min；95℃，30s，60℃，30s，72℃，40s，30个循环；72℃，10min。电泳检测PCR产物，如果有清晰DNA条带，则取1μL PCR产物进行TA克隆(天根生化科技有限公司，VT307)，详细步骤如同上述实施例1步骤(9)中的TA克隆。测序结果如图5所示，A：Vav1基因敲除2#单克隆；B：Vav1基因敲除3#单克隆；经过分析，发现所有经过分选得到的GFP阳性单克隆细胞均发生了碱基缺失，其中2号单细胞克隆缺失了55个碱基，3号单细胞克隆缺失了51个碱基，以上结果表明这些分选得到的单克隆即为Vav1基因敲除细胞株。
(10)将已验证的单克隆细胞株扩大培养、冻存液氮以保种。
实施例3
本实施例快速获得CRISPR/Cas9基因敲除稳定细胞株的方法，包括如下步骤：
(1)确定小鼠待敲除基因DSG4(Gene ID:2661061)的特异性靶位点sgRNA1，sgRNA2：在小鼠基因组数据库ensembl(http://asia.ensembl.org)中找到小鼠DSG4基因DNA序列(Transcript ID:ENSMUST00000019426.4)，然后使用在线设计软件CRISPOR(http://crispor.tefor.net/crispor.cgi)，确定在小鼠DSG4基因的靶位点exon12(exon ID：ENST00000308128.8)内挑选2个特异性位点作为sgRNA的靶序列，这两个靶序列分别为：sgRNA1(SEQ ID NO.17)：5‘-CTTAGCCGTAAGGATTGCCG AGG-3’，sgRNA2(SEQ ID NO.18)：5‘-GTGGTTGTCATCGCAATCAC AGG-3’。
(2)设计引物：根据步骤(1)sgRNA靶序列，设计2对共4条引物(上海百力格生物技术有限公司)，并在引物序列的5‘端添加BbsI酶切位点(其中使用下划线标示的碱基表示添加的酶切位点)：
M-DSG4-IVT-1(SEQ ID NO.19)：5‘-CACC GCTTAGCCGTAAGGATTGCCG-3’；
M-DSG4-IVT-2(SEQ ID NO.20)：5‘-AAAC CGGCAATCCTTACGGCTAAGC-3’；
M-DSG4-IVT-3(SEQ ID NO.21)：5‘-CACC GTGGTTGTCATCGCAATCAC-3’；
M-DSG4-IVT-4(SEQ ID NO.22)：5‘-AAAC GTGATTGCGATGACAACCAC-3’。
(3)通过引物退火、配对获得带有粘性末端的双链DNA片段：将步骤(2)中合成的4条引物以M-DSG4-IVT-1+M-DSG4-IVT-2和M-DSG4-IVT-3+M-DSG4-IVT-4的组合方式用于退火配对获得带有粘性末端的双链DNA片段，具体程序如下：首先将合成的两对引物分别磷酸化，磷酸化反应体系为，引物M-DSG4-IVT-1+M-DSG4-IVT-2和M-DSG4-IVT-3+M-DSG4-IVT-4各加入1μl(100μM)，再加入1μl 10×T4Ligation Buffer(NEB)，然后加入0.5μl T4Polynucleotide Kinase(NEB M0201S)，最后加入6.5μl ddH2O至总体积10μl，配制好反应体系以后，充分混匀，置于37℃孵育30min；取出以上反应产物，转移至PCR仪中进行变性和退火，反应程序如下：95℃，5min；95–25℃at-5℃/min。
(4)使用限制性内切酶BbsI将载体(pX458)DNA线性化，然后纯化回收，获得具有粘性末端的载体DNA片段，具体体系如同实施例1中的步骤(4)。
(5)通过连接反应、转化、重组子筛选获得完整的sgRNA和Cas9表达载体，具体方法如同实施例1中的步骤(5)，最终即可得到sgRNA和Cas9表达载体pX458-DSG4-1和pX458-DSG4-2。
(6)将构建好的表达载体等质量混合，然后通过脂质体介导的转染方式转染人永生化表皮细胞系HaCaT。细胞培养和转染详细步骤如下：
HaCaT细胞的培养和传代：细胞购于ATCC细胞库，将细胞带回实验室置于CO2培养箱中培养，待细胞完全贴壁后，用DPBS换液以冲洗掉死细胞和细胞代谢物，再加入新鲜的培养液(MEM/GLUCOSE+10％FBS+1％双抗(青霉素+链霉素)+1％丙酮酸钠+1％非必需氨基酸)继续培养，每日在倒置显微镜下观察细胞形态和生长状况，待细胞长满培养瓶底90％左右开始传代。传代方法如同RAW264.7细胞。有所不同的是，HaCaT细胞在传代消化过程中，37℃消化10min后将培养瓶放置于显微镜下观察，当细胞形态变圆、细胞间隙增大后，弃去胰蛋白酶并加入3mL DMEM以终止消化反应。
HaCaT细胞的转染：将pX458-DSG4-1和pX458-DSG4-2载体DNA转染至HaCaT细胞的方法如同RAW264.7细胞的转染。
(7)分选单细胞：步骤如同上述实施例1中的步骤(7)。
(8)抽提单克隆细胞基因组DNA：步骤如同上述实施例1中的步骤(8)。
(9)设计引物检测分选得到的单克隆细胞株是否有碱基缺失或是插入。使用在线引物设计软件primer3(http://primer3.ut.ee/)，针对打靶位点基因组序列设计特异性引物，DSG4-S PCR-F(SEQ ID NO.23)：5‘-GTATTAGGGAGAGTTAACCACCCC-3’和DSG4-S PCR-R(SEQ ID NO.24)：5‘-TTCAGTGACAGGCCCATACG-3’，通过PCR扩增包含打靶位点目的片段(理论长度为296bp)，体系为：(Vazyme，P111)2*Taq Master PCR MIX：10μL，DSG4-S PCR-F(5μM)和DSG4-S PCR-R(5μM)各0.5μL；基因组DNA：10μg；补充ddH2O至总体积20μL；程序为：95℃，5min；95℃，30s，60℃，30s，72℃，40s，30个循环；72℃，10min。电泳检测PCR产物，如果有清晰DNA条带，则取1μL PCR产物进行TA克隆(天根生化科技有限公司，VT307)，详细步骤如同上述实施例1步骤(9)中的TA克隆。测序结果如图6所示，A：DSG4基因敲除1#单克隆；B：DSG4基因敲除4#单克隆；经过分析，发现所有经过分选得到的GFP阳性单克隆细胞均发生了碱基缺失，其中1号单细胞克隆缺失了117个碱基，4号单细胞克隆缺失了139个碱基，以上结果表明这些分选得到的单克隆即为DSG4基因敲除细胞株。
(10)将已验证的单克隆细胞株扩大培养、冻存液氮以保种。
实施例4
本实施例获得CRISPR/Cas9基因敲除稳定细胞株的方法，将转染细胞培养48h后进行流式细胞仪分选，其余操作与实施例1相同。
实施例5
本实施例获得CRISPR/Cas9基因敲除稳定细胞株的方法，将转染细胞培养48h后进行流式细胞仪分选，其余操作与实施例2相同。
对比例1
本实施例获得CRISPR/Cas9基因敲除稳定细胞株的方法，将转染细胞培养24h后进行流式细胞仪分选，其余操作与实施例1相同。
对比例2
本实施例获得CRISPR/Cas9基因敲除稳定细胞株的方法，将转染细胞培养24h后进行流式细胞仪分选，其余操作与实施例2相同。
试验例
比较实施例1-2、4-5和对比例1-2中获得CRISPR/Cas9基因敲除稳定细胞株的方法，经流式细胞仪分选后，统计各组细胞的存活率和基因编辑效率。结果如图7所示，横坐标为转染后培养的时间，其中，Vav1基因转染的细胞系为B16；Vav2基因转染的细胞系为RAW264.7；结果表明，转染以后72小时进行分选，细胞存活率均达到最大值(72小时细胞存活率略高于48小时)(图7-A)；但是在转染以后72小时进行分选，细胞系B16中Vav1基因的突变率会显著高于48小时分选后的突变率(图7-B)，所以综合以上结果，我们确定转染以后40-80小时进行单细胞分选为最佳时间点。
<110> 新乡医学院
<120> 一种利用单克隆细胞分选快速获得CRISPR/Cas9基因敲除稳定细胞株的方法
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<211> 23
<212> DNA
<213> 序列
<221> Vav2基因sgRNA1
<400> 1
gttagagatt caggagaccg agg 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 序列
<221> Vav2基因sgRNA2
<400> 2
ggccaagtac taccgcaccc tgg 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 序列
<221> M-VAV2-IVT-1
<400> 3
caccgttaga gattcaggag accg 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 序列
<221> M-VAV2-IVT-2
<400> 4
aaaccggtct cctgaatctc taac 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 序列
<221> M-VAV2-IVT-3
<400> 5
caccggccaa gtactaccgc accc 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 序列
<221> M-VAV2-IVT-4
<400> 6
aaacgggtgc ggtagtactt ggcc 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 序列
<221> Vav2-S PCR-F
<400> 7
tggcctgggc attcattgat 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 序列
<221> Vav2-S PCR-R
<400> 8
acgtgcctcc atttcctcag 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 序列
<221> vav1基因sgRNA1
<400> 9
ctacgaggac ctaatgcgct tgg 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 序列
<221> vav1基因sgRNA2
<400> 10
cgaggacctt tatgactgcg tgg 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 序列
<221> M-Vav1-IVT-1
<400> 11
caccgctacg aggacctaat gcgct 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 序列
<221> M-Vav1-IVT-2
<400> 12
aaacagcgca ttaggtcctc gtagc 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 序列
<221> M-Vav1-IVT-3
<400> 13
caccgcgagg acctttatga ctgcg 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 序列
<221> M-Vav1-IVT-4
<400> 14
aaaccgcagt cataaaggtc ctcgc 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 序列
<221> Vav1-S PCR-F
<400> 15
gacacattgc aagacgtggg 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 序列
<221> Vav1-S PCR-R
<400> 16
tttgccatcc cagctctcag 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 序列
<221> DSG4基因sgRNA1
<400> 17
cttagccgta aggattgccg agg 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 序列
<221> DSG4基因sgRNA2
<400> 18
gtggttgtca tcgcaatcac agg 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 序列
<221> M-DSG4-IVT-1
<400> 19
caccgcttag ccgtaaggat tgccg 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 序列
<221> M-DSG4-IVT-2
<400> 20
aaaccggcaa tccttacggc taagc 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 序列
<221> M-DSG4-IVT-3
<400> 21
caccgtggtt gtcatcgcaa tcac 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 序列
<221> M-DSG4-IVT-4
<400> 22
aaacgtgatt gcgatgacaa ccac 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 序列
<221> DSG4-S PCR-F
<400> 23
gtattaggga gagttaacca cccc 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 序列
<221> DSG4-S PCR-R
<400> 24
ttcagtgaca ggcccatacg 20
<211> 550
<212> DNA
<213> 序列
<221> Vav1的PCR检测片段
<400> 25
gacacattgc aagacgtggg gggaggggtg gcattgtgca tttattcttc attctgaaag 60
tttctgatgg gtccctggct tgggacatgg cctgaatctg tcccctagtg acaccgcaga 120
ggaagacgag gacctttatg actgcgtgga aaatgaggag gcagaggggg acgagatcta 180
cgaggaccta atgcgcttgg agtcggtgcc tacgccagtg agtgggcctg ggaagggcgg 240
ggcaggtggg aagggtagag atggctgcag ggagcttcac cagcctctat ggtctctgct 300
cacagcccaa gatgacagag tatgataagc gctgctgctg cctgcgggag atccagcaga 360
cggaggagaa gtatacagac acactgggct ccatccagca ggtgtgtcac acccctgggt 420
cctgccagcc tgggtcctgc caggggcatc tcctccctgc ttcctcctag gaggtcttct 480
tatgttgccc caagctgccc ataaactgat aatcttaatg tctcagtttc ctgagagctg 540
ggatggcaaa 550
<211> 586
<212> DNA
<213> 序列
<221> Vav2的PCR检测片段
<400> 26
tggcctgggc attcattgat gcaggaagac ccagcccgct ataagtagca ccaacccctg 60
gcctggtggt cctgggctgt tctgctaagc aggagctagc aagcagcttt tctccatggt 120
ttctgcttga ggtcttgcac tgattccccc cgctgggact gtaatctcca agttaggata 180
aagtaaactc ctctcttccc tcagctcctt ttggtcagag tttcctcaca ggcagagaga 240
gagagagaga aaactggaac aggtgctaag accctgaccc tgggctttcc aggagaaatg 300
gctctcacct tctcaatgtc ctccagggtg cggtagtact tggcctcggt ctcctgaatc 360
tctaacaagc agcagcttct cttgtcgtcc tcagtcatgc ccattttcta gaggagacat 420
gacgcgtgag ccaggacccc actacctggc cacccaggta tctgctgccg gccacctgtc 480
ccacacaaca ggatgacacc tttccagtat ggtcacaaga ttactgagtt tacagtgagc 540
cccagcccct cccccattct ctatgtctga ggaaatggag gcacgt 586
<211> 296
<212> DNA
<213> 序列
<221> DSG4的PCR检测片段
<400> 27
gtattaggga gagttaacca cccccctagc ccaccaagga atttccattt attttctgtt 60
tcctctcttc catttcagct acctcggcaa tccttacggc taagcaggtt ttatctccag 120
gattttatga aatcccaatc ctggtgaagg acagctataa cagagcatgt gaattggcac 180
aaatggtgca gttatatgcc tgtgattgcg atgacaacca catgtgcctg gactctggtg 240
ccgcgggcat ctacacagag gacataactg gtgacacgta tgggcctgtc actgaa 296